蔡姿秀 周國華 田 軍

1.杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院兒科，浙江杭州 311200；2.杭州市蕭山區(qū)第三人民醫(yī)院兒科，浙江杭州 311256

支氣管哮喘（以下簡稱“哮喘”）是兒童常見的慢性呼吸道疾病。有研究顯示，我國每十年哮喘患兒發(fā)病率上升20%～50%，嚴重影響患兒身心健康[1]。目前，哮喘發(fā)病機制尚不完全清楚，有研究認為維生素D（vitamin D，VitD）和體內微生物變化也是發(fā)病的重要因素[2]。VitD 能調節(jié)Th1/Th2 平衡，在免疫細胞分化和發(fā)育中起重要作用[3-7]。VitD 及其信號通路可通過影響腸道屏障完整性及微生物組成，進而影響腸道免疫反應[8-9]。本研究通過體外補充VitD 方式，觀察哮喘幼鼠外周血T 淋巴細胞及腸道菌群改變，從而闡述哮喘患兒VitD、腸道菌群、免疫平衡三者的相互作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

7 d 齡體重4.09～6.13 g 的SPF 級野生型BALB/c雌性幼鼠，浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK（滬）2018-0006，合格證號：20180006035029。本研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學實驗動物管理與倫理委員會批準（IACUC-20211025-07）。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為21～25℃，濕度為50%～60%。

1.2 主要試劑及儀器

幼鼠Th1、Th2、Th17、調節(jié)性T 細胞（regulatoryTcell，Treg）流式細胞檢測試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司，70-KTH201-25、70-KTH217-25、70-KTH219-25）；卵清蛋白（ovalbumin，OVA）致敏液（Sigma，A5503-1G）；氫氧化鋁（Thermo，77161）；磷酸鹽緩沖液（Biosharp，BL302A）；霧化器[百瑞醫(yī)療科技（常州）有限公司，BRM-077Ⅲ]；顯微鏡（Leica，DM2000）。

1.3 動物分組和模型制備

動物常規(guī)飼養(yǎng)2 d 后開始實驗，選取30 只幼鼠按隨機數(shù)字表法分為哮喘模型組15 只，VitD 干預組15 只，另選10 只作為健康對照組。實驗第1、7 天，哮喘模型組和VitD 干預組予10%OVA 致敏液200 μl腹腔注射；健康對照組注射等量生理鹽水。實驗第19天，將哮喘模型組和VitD 干預組置于20 cm×20 cm×30 cm的密閉容器內，給予3%OVA 溶液10 ml 霧化吸入20 min，健康對照組在相同條件下霧化吸入等量生理鹽水。1 次/d，連續(xù)霧化6 d。幼鼠在霧化過程中有明顯活動過多、搔耳橈鼻，證明造模成功[10]。

1.4 干預給藥

實驗第18 天，VitD 干預組給予VitD 滴劑[國藥控股星鯊制藥（廈門）有限公司]灌胃，給藥劑量為35 μg/（kg·周），1 次/2 d，共2 周，其余兩組均給予等體積磷酸鹽緩沖液灌胃[11]。

1.5 標本采集

三組給藥結束24 h 后摘除眼球取血至抗凝試管，4℃保存送檢。取血后處死動物，打開胸腔暴露肺組織，取出右肺放入10%甲醛溶液中，常溫固定72 h；剪開腹腔分離結腸，取出糞便放置于凍存管，加入液氮置于-80℃冰箱保存送檢。

1.6 觀察指標及檢測方法

1.6.1 肺組織切片染色 肺組織經(jīng)固定、脫水、包埋、切片并行蘇木精-伊紅染色，置于光學顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

1.6.2 流式細胞儀檢測 取抗凝血裂解紅細胞，制備單細胞懸液，采用流式細胞儀檢測并計算三組外周血Th1/Th2 比值、Th17/Treg 比值，按照儀器及試劑盒說明書操作。

1.6.3 16S rDNA 測序 將三組糞便送至杭州聯(lián)川生物科技股份有限公司行16S rDNA 測序。通過對基因序列剪切過濾，測得每份樣品中基因序列條數(shù)，在門和屬水平上分析物種豐富度，計算Alpha、Beta 多樣性，并進行比較。Alpha 多樣性可反映特定環(huán)境或生態(tài)系統(tǒng)內微生物群落的豐富度和多樣性，Beta 多樣性可用于分析物種間差異性。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，比較采用t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組肺組織病理學結果

健康對照組肺組織支氣管壁及肺泡壁結構完整，肺泡腔內無滲出，肺泡上皮排列有序，肺泡壁厚度正常；哮喘模型組肺泡壁結構受損，肺泡上皮細胞破壞，氣管平滑肌增厚，管腔狹窄，黏膜充血水腫，血管周圍炎癥細胞浸潤。VitD 干預組與哮喘模型組比較，肺組織炎癥反應明顯減輕。見圖1。

圖1 三組肺組織蘇木精-伊紅染色（200×）

2.2 三組Th1/Th2 比值、Th17/Treg 比值比較

哮喘模型組外周血Th1/Th2 比值低于健康對照組，Th17/Treg 比值高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。VitD 干預組Th1/Th2 比值高于健康對照組，Th17/Treg 比值低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 三組Th1/Th2 比值、Th17/Treg 比值比較（）

表1 三組Th1/Th2 比值、Th17/Treg 比值比較（）

注 與健康對照組比較，aP＜0.05；與哮喘模型組比較，bP＜0.05。Treg：調節(jié)性T 細胞；VitD：維生素D

2.3 三組腸道菌群測序比較

2.3.1 三組腸道菌群Shannon 指數(shù)曲線分析 三組測序樣本微生物物種Shannon 指數(shù)曲線趨平緩，提示數(shù)據(jù)量足夠大，物種豐度高且分布均勻。見圖2。

圖2 三組腸道菌群Shannon 指數(shù)曲線

2.3.2 三組腸道菌群Alpha 多樣性分析 Alpha 多樣性分析顯示，三組Simpson 指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 三組腸道菌群Simpson 指數(shù)比較

2.3.3 三組腸道菌群Beta 多樣性分析PCoA 圖分析顯示，各組組內樣本呈現(xiàn)聚集傾向，而組間樣本之間距離接近，組內樣本均在95%置信區(qū)間內，其中哮喘模型組和健康對照組組間距離大，VitD 干預組與哮喘模型組組間距離近，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001）。見圖4。

2.3.4 三組腸道菌群物種組成分析 門水平上包括15個門，F(xiàn)irmicutes 和Bacteroidota 是絕對優(yōu)勢菌群。哮喘組Actinobacteriota 豐度低于健康對照組，Proteobacteria 豐度高于健康對照組，VitD 干預組Actinobacteriota、Proteobacteria 豐度均高于哮喘模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖5。屬水平上包括23 個屬，哮喘模型組Helicobacter、Colidextribacter 豐度低于健康對照組，Ligilactobacillus、Bacteroides 豐度高于健康對照組，VitD 干預組Helicobacter、Colidextribacter 豐度高于哮喘模型組，Ligilactobacillus、Bacteroides 豐度低于哮喘模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與基于屬水平的heatmap 分析結果一致。見圖6～7。

圖5 三組腸道菌群門水平下物種組成分析

圖6 三組腸道菌群屬水平下物種組成分析

圖7 三組腸道菌群屬水平的heatmap 分析

3 討論

經(jīng)典Th1/Th2 細胞失衡被認為是哮喘主要發(fā)病機制，在炎癥發(fā)展過程中起促進作用[12-13]。VitD 在體外抑制T 細胞產(chǎn)生白細胞介素-17 和γ 干擾素，可誘導腸道發(fā)揮免疫效應[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患兒中VitD水平普遍偏低，與哮喘嚴重程度呈負相關[15-16]。但Luo等[17]發(fā)現(xiàn)，補充VitD 后患兒哮喘發(fā)作率并沒有改善。本研究給予VitD 干預的幼鼠血清Th1/Th2 水平較哮喘幼鼠上升，而Th17/Treg 水平下降，提示VitD 參與哮喘幼鼠免疫穩(wěn)態(tài)。人類和嚙齒動物的主要微生物群是Firmicutes 和Bacteroides[18]，其為宿主提供營養(yǎng)、促進血管再生，增加IgA 表達，在能量代謝和免疫保護中發(fā)揮作用[19-22]，同時腸道微生物可通過VitD 狀態(tài)和/或暴露來改變[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，補充VitD 會引起物種變化，使Bacteroides和Proteobacteria 增加[24-25]。本研究給予VitD 干預后發(fā)現(xiàn)，在VitD 干預組中Actinobacteriota、Proteobacteria 豐度較哮喘模型組增加，Helicobacter、Colidextribacter 豐度較哮喘模型組增加，而Ligilactobacillus、Bacteroides 較哮喘模型組豐度減少，上述結果與文獻報道結果基本一致。

綜上所述，本研究提示VitD 可調節(jié)哮喘失衡及改善腸道穩(wěn)態(tài)，從一個新視角闡述“肺-腸軸”定義[26-28]，但由于動物實驗和臨床存在差距，VitD 是否為腸道微生物群落影響肺免疫反應的推動因子這一推斷及其可能的潛在機制仍需要更多研究來確認。