趙水強(qiáng) 孟大偉 陳國(guó)強(qiáng) 李亮亮 王志文 胡甜甜 牛建星

北京航空總醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100012

膠質(zhì)瘤屬于神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，手術(shù)切除、放療、化療等常見治療手段雖然能夠在一定程度上緩解膠質(zhì)瘤進(jìn)展，但治療后的多數(shù)患者生存時(shí)間低于5 年，尋找有效方法抑制膠質(zhì)瘤具有重大研究?jī)r(jià)值[1-2]。鐵死亡是近些年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞程序性死亡，氧化應(yīng)激、Fe2+含量增多是其較為典型的特征，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡也成為腫瘤治療中的研究熱點(diǎn)[3-4]。circRNA 是高度穩(wěn)定的非編碼RNA，其是由前體RNA 經(jīng)過反向剪接而產(chǎn)生的，circRNA 在人體內(nèi)的多種組織中表達(dá)，并且有多種生物學(xué)功能[5-6]。研究證明[7-8]，腫瘤的進(jìn)展也受到circRNA 的表達(dá)調(diào)控，靶向改變circRNA 的表達(dá)可能是腫瘤治療的潛在途徑之一。既往文獻(xiàn)[5]顯示，hsa_circ_0006988（circ_0006988）促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)。目前尚未發(fā)現(xiàn)circ_0006988在膠質(zhì)瘤細(xì)胞鐵死亡中的作用研究。Nrf2/GPX4 信號(hào)可增加機(jī)體抗氧化能力，參與氧化應(yīng)激、鐵死亡、腫瘤等生理、病理過程[9-11]。本實(shí)驗(yàn)探討下調(diào)hsa_circ_0006988 作用于Nrf2/GPX4 信號(hào)誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞鐵死亡的機(jī)制，為膠質(zhì)瘤靶向基因治療提供參考思路，為研究膠質(zhì)瘤分子發(fā)生機(jī)制提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

腦正常膠質(zhì)細(xì)胞HEB（BNCC358606），購(gòu)自上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172（貨號(hào)：CL0016），武漢普諾賽生命科技有限公司；膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG44（貨號(hào)：CTCC-007-0459），購(gòu)自湖南豐暉生物科技有限公司；膠質(zhì)瘤細(xì)胞CHG-5（貨號(hào)：YS1481M），購(gòu)自美 國(guó)ATCC；siRNA control、circ_0006988 siRNA、Nrf2 siRNA、陰性對(duì)照載體（pcDNA）、Nrf2 過表達(dá)載體（pcDNA-Nrf2），湖南普拉特澤生物科技有限公司提供；兔抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（trasferrin-receptor，TFR）抗體（貨號(hào)：ab185550）、兔抗Ferritin 抗體（貨號(hào)：ab75973）、兔抗Nrf2 抗體（貨號(hào)：ab62352），兔抗轉(zhuǎn)鐵蛋白（Trans ferrin,TF）抗體（貨號(hào)：ab277635），F(xiàn)e2+檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：ab83366）購(gòu)自美國(guó)Abcam；兔抗GPX4 抗體（貨號(hào)：MABS1274）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；cDNA 第一鏈合成試劑盒（貨號(hào)：K1622）、ROS 測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：E004-1-1），購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；MDA測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：A003-3-1），購(gòu)自北京中昊新生科技有限責(zé)任公司；熒光定量PCR 試劑盒SYBR Green qPCR Mix（貨號(hào)：MCE HY-K0501），購(gòu)自天津邁基生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組 膠質(zhì)瘤細(xì)胞CHG-5 培養(yǎng)參數(shù)設(shè)置為37℃，5%CO2，細(xì)胞培養(yǎng)在添加有10%胎牛血清的RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)液中。膠質(zhì)瘤細(xì)胞CHG-5 分為Control 組、si-NC 組、si-circ 組、si-Nrf2 組、si-circ+Vector 組、si-circ+Nrf2 組，Control 組為空白對(duì)照，si-NC組、si-circ 組、si-Nrf2 組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染siRNA Control組、circ_0006988 siRNA 組、Nrf2 siRNA 組，si-circ+Vector 組細(xì)胞共轉(zhuǎn)染circ_0006988 siRNA、陰性對(duì)照載體，si-circ+Nrf2 組細(xì)胞共轉(zhuǎn)染circ_0006988 siRNA、Nrf2 過表達(dá)載體。細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作方法完全根據(jù)Lipofectamine 2000 說明書進(jìn)行。

1.2.2 qRT-PCR 方法檢測(cè)circ_0006988 表達(dá) 收集腦正常膠質(zhì)細(xì)胞HEB 和膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172、SHG44、CHG-5，或者收集按照“1.2.1”中方法分組（Control 組、si-NC 組、si-circ 組）處理24 h 后的細(xì)胞，經(jīng)PBS 洗滌2 次后，用Trizol 試劑提取總RNA，cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR 試劑盒SYBR Green qPCR Mix 進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)；設(shè)置GAPDH 作為參照，結(jié)果按照2-△△Ct法計(jì)算目的基因的表達(dá)變化。PCR 引物序列，circ_0006988 正向引物：5’-CTGCAACGTCACCTACAACG-3’，circ_0006988 反向引物：5’-CACCACCAG-CACAAAAATGA-3’；GAPDH 正向引物：5’-CTCCTCCACCTTTGACGCT-3’，GAPDH 反向引物：5’-GGGTCTCTCTC-TTCCTCTTGTG-3’。

1.2.3 比色法檢測(cè)Fe2+收集按照“1.2.1”中方法分組處理24 h 后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，添加4 倍體積的鐵檢測(cè)緩沖液，4℃，16 000 g 離心10 min，吸取上清備用。吸取50 μl 上清液添加到96 孔板，再補(bǔ)充50 μl 的Fe2+分析緩沖溶液，然后繼續(xù)添加5 μl 的分析緩沖液，放在25℃孵育30 min。把100 μl 的Fe2+探針加入測(cè)試孔或標(biāo)準(zhǔn)品孔內(nèi)，在25℃孵育30 min。酶標(biāo)儀測(cè)定593 nm 的OD值。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Fe2+含量。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)Nrf2、GPX4、Ferritin、TF、TFR 蛋白表達(dá) 收集按照“1.2.1”中方法分組處理24 h 后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，加入蛋白提取試劑，細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，4℃，12 000 g 離心10 min，吸取蛋白上清備用。配制10%的分離膠、5%的濃縮膠。蛋白樣品在添加到樣品孔之前，首先需要與5×Loading Buffer 混合煮沸5 min。每個(gè)孔內(nèi)添加蛋白量為40 μg。80 V 電壓電泳20 min，100 V 電壓電泳1 h。PVDF 膜放在甲醇中活化，100 V 電壓轉(zhuǎn)膜2 h。PVDF 膜經(jīng)過5%脫脂奶粉將非特異性的結(jié)合位點(diǎn)封閉以后，放在稀釋以后的一抗（Nrf2、TFR 按照1∶1 000 稀釋，GPX4、Ferritin、TF 抗體按照1∶800 稀釋）溶液中，4℃孵育12 h。PVDF膜放在稀釋后的抗溶液中，室溫結(jié)合2 h。ECL 顯色，顯影。Image J 分析條帶的灰度值，根據(jù)灰度值計(jì)算目的蛋白的表達(dá)差異，GAPDH 作為參照。

1.2.5 ROS、MDA 檢測(cè) 收集按照“1.2.1”中方法分組處理24 h 后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，利用ROS 測(cè)定試劑盒（DCFH-DA 法）、MDA 測(cè)定試劑盒（硫代巴比妥酸法）檢測(cè)ROS、MDA 水平。ROS 結(jié)果以相對(duì)熒光強(qiáng)度表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circ_0006988 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)

膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172、SHG44、CHG-5 中circ_0006988表達(dá)水平高于腦正常膠質(zhì)細(xì)胞HEB（P＜0.05）；膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172、SHG44 中circ_0006988 表達(dá)水平低于膠質(zhì)瘤細(xì)胞CHG-5（P＜0.05）。circ_0006988 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，選擇表達(dá)水平最高的膠質(zhì)瘤細(xì)胞CHG-5 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表1。

表1 腦正常膠質(zhì)細(xì)胞HEB 和膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172、SHG44、CHG-5 中circ_0006988 表達(dá)水平（，n=9）

表1 腦正常膠質(zhì)細(xì)胞HEB 和膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172、SHG44、CHG-5 中circ_0006988 表達(dá)水平（，n=9）

注 與HEB 比較，aP＜0.05；與CHG-5 比較，bP＜0.05

2.2 下調(diào)circ_0006988 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞鐵死亡的作用

si-circ 組膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，F(xiàn)e2+含量、ROS、MDA 含量高于Control 組、si-NC 組，F(xiàn)erritin、TF、TFR 蛋白表達(dá)高于Control 組、si-NC 組（P＜0.05）。見圖1～2、表2。

圖1 Western blot 檢測(cè)circ_0006988 siRNA 轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞Ferritin、TF、TFR 蛋白表達(dá)差異

圖2 DCFH-DA 法檢測(cè)ROS 含量（200×）

表2 circ_0006988 siRNA 轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞中circ_0006988 表達(dá)水平和Ferritin、TF、TFR 蛋白表達(dá)及Fe2+、ROS、MDA 含量（，n=9）

表2 circ_0006988 siRNA 轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞中circ_0006988 表達(dá)水平和Ferritin、TF、TFR 蛋白表達(dá)及Fe2+、ROS、MDA 含量（，n=9）

注 與Control 組比較，aP＜0.05；與si-NC 組比較，bP＜0.05。ROS：活性氧；MDA：丙二酸

2.3 下調(diào)circ_0006988 抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Nrf2/GPX4信號(hào)激活

si-circ 組膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Nrf2、GPX4 蛋白表達(dá)低于Control 組、si-NC 組（P＜0.05）。見圖3、表3。

圖3 Western blot 檢測(cè)circ_0006988 siRNA 轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Nrf2/GPX4 信號(hào)蛋白表達(dá)

表3 circ_0006988 siRNA 轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Nrf2、GPX4 蛋白表達(dá)水平（，n=9）

表3 circ_0006988 siRNA 轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Nrf2、GPX4 蛋白表達(dá)水平（，n=9）

注 與Control 組比較，aP＜0.05；與si-NC 組比較，bP＜0.05

2.4 激活Nrf2/GPX4 信號(hào)逆轉(zhuǎn)下調(diào)circ_0006988 對(duì)膠質(zhì)瘤鐵死亡作用

si-circ 組膠質(zhì)瘤細(xì)胞Nrf2、GPX4 蛋白表達(dá)低于si-NC 組，F(xiàn)e2+含量，F(xiàn)erritin、TF、TFR 蛋白表達(dá)，ROS、MDA 含量高于si-NC 組（P＜0.05）；si-circ+Nrf2 組膠質(zhì)瘤細(xì)胞Nrf2、GPX4 蛋白表達(dá)高于si-circ+Vector組，F(xiàn)e2+含量，F(xiàn)erritin、TF、TFR 蛋白表達(dá)，ROS、MDA含量低于si-circ+Vector 組（P＜0.05）。見圖4～5、表4。

圖4 Western blot 檢測(cè)Nrf2 過表達(dá)載體、circ_0006988 siRNA共轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Nrf2、GPX4、TF、TFR、Ferritin 蛋白表達(dá)變化

表4 Nrf2 過表達(dá)載體、circ_0006988 siRNA 轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤Nrf2、GPX4、Ferritin、TF、TFR 蛋白表達(dá)及Fe2+、ROS、MDA 含量（，n=9）

表4 Nrf2 過表達(dá)載體、circ_0006988 siRNA 轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤Nrf2、GPX4、Ferritin、TF、TFR 蛋白表達(dá)及Fe2+、ROS、MDA 含量（，n=9）

注：與si-NC 組比較，aP＜0.05；與si-circ+Vector 組比較，bP＜0.05。ROS：活性氧；MDA：丙二醛

3 討論

研究circRNA 在膠質(zhì)瘤中的作用，對(duì)于基因靶向治療膠質(zhì)瘤具有重要意義[12-15]。文獻(xiàn)顯示[8]，circ_0006988在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)上調(diào)，并且circ_0006988 可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，circ_0006988 可能是腫瘤促進(jìn)因子。本實(shí)驗(yàn)顯示，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中circ_0006988 表達(dá)水平高于正常膠質(zhì)細(xì)胞，并且下調(diào)circ_0006988 抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，circ_0006988 可能具有促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展的功能，這與之前的研究報(bào)道結(jié)果一致，均說明circ_0006988 可能發(fā)揮類似癌基因的作用。

鐵死亡表現(xiàn)為脂質(zhì)過氧化物積累、氧化應(yīng)激[10-11]。MDA、ROS 含量變化可間接反映氧化應(yīng)激水平和鐵死亡變化[12-13]。Ferritin、TF、TFR 是與鐵死亡有關(guān)的蛋白調(diào)控因子，F(xiàn)erritin、TF、TFR 在鐵死亡中過表達(dá)[14-15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，下調(diào)circ_0006988 后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Fe2+含量增加，ROS、MDA 水平增加，F(xiàn)erritin、TF、TFR 蛋白表達(dá)增多，提示下調(diào)circ_0006988 促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞鐵死亡，這可能是circ_0006988 調(diào)控膠質(zhì)瘤進(jìn)展的重要原因之一。Nrf2 是機(jī)體多種解毒酶的激活因子，在細(xì)胞受到損傷時(shí)，Nrf2 表達(dá)上調(diào)促進(jìn)細(xì)胞增加抗氧化能力，減輕細(xì)胞損傷[16-17]。研究顯示[18-20]，Nrf2 能夠誘導(dǎo)GPX4 表達(dá)，而GPX4 也被認(rèn)為是鐵死亡的核心，抑制GPX4 能夠加快細(xì)胞氧化應(yīng)激和鐵死亡。本研究顯示，下調(diào)circ_0006988 降低了膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Nrf2、GPX4 表達(dá)水平，且抑制Nrf2/GPX4 信號(hào)降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力，提高細(xì)胞中Fe2+、ROS、MDA 水平，促進(jìn)Ferritin、TF、TFR 蛋白表達(dá)，并且下調(diào)circ_0006988 可能通過抑制Nrf2/GPX4 信號(hào)誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞鐵死亡[21-25]。進(jìn)一步用逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，激活Nrf2/GPX4 信號(hào)部分逆轉(zhuǎn)了下調(diào)circ_0006988 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、鐵死亡的作用，這提示下調(diào)circ_0006988 通過抑制Nrf2/GPX4 信號(hào)誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞鐵死亡，抑制細(xì)胞增殖。

綜上，circ_0006988 在膠質(zhì)瘤中可能發(fā)揮促進(jìn)作用，靶向抑制circ_0006988 可能是膠質(zhì)瘤治療的途徑之一，下調(diào)circ_0006988 可在體外誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞鐵死亡，作用機(jī)制與抑制Nrf2/GPX4 信號(hào)有關(guān)，這為研究circ_0006988 在膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制提供了參考，為膠質(zhì)瘤的分子靶向治療提供了參考方向。

圖5 DCFH-DA 法檢測(cè)ROS 含量（200×）