王晨宇,郭峰,趙建華,羅勇

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是腎臟常見的惡性腫瘤,占腎臟所有惡性腫瘤的80%～90%,2020年我國RCC發(fā)病率和病死率分別為3.99/10萬、1.39/10萬[1-2]。RCC尚缺乏有效的治療策略,探索其機(jī)制對病情控制和預(yù)后改善至關(guān)重要。非編碼RNA作為獨特的RNA轉(zhuǎn)錄本,其異常表達(dá)對RCC有重要調(diào)控作用[3-4]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)結(jié)直腸腫瘤差異表達(dá)基因(colorectal neoplasia differentially expressed,CRNDE)和微小RNA(microRNA,miRNA)-29a-3p是新近發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA,研究報道lncRNA CRNDE與膀胱癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移和凋亡等有關(guān)[5-6],miR-29a-3p與甲狀腺癌、非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移和凋亡等有關(guān)[7-8]。本研究擬探討RCC組織中l(wèi)ncRNA CRNDE、miR-29a-3p表達(dá)與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系,以期為改善RCC患者預(yù)后提供參考依據(jù),報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2019年11月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科收治RCC患者92例,其中男55例,女37例,年齡27～85(60.54±8.54)歲;腫瘤位置:左腎52例,右腎40例;RCC亞型:透明細(xì)胞64例,乳頭狀18例,嫌色細(xì)胞3例,Xp11.2易位/轉(zhuǎn)錄因子與IGHM增強(qiáng)子3結(jié)合(transcription factor binding to IGHM enhancer 3,TFE3)基因融合7例;腫瘤最大徑:≥4 cm 42例、<4 cm 50例;世界衛(wèi)生組織/國際泌尿病理學(xué)會(World Health Organization/International Society of Urology Pathology,WHO/ISUP)分級[9]: 1～2級44例,3～4級48例;臨床分期[10]:Ⅰ～Ⅱ期62例,Ⅲ～Ⅳ期30例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移74例。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(KY2019071245),患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)病理檢查確診為RCC;②初次確診;③入院前未接受任何抗腫瘤治療;④行部分腎切除/根治性腎切除(Ⅰ～Ⅲ級)或細(xì)胞減滅手術(shù)、姑息手術(shù)(Ⅳ級);(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①腎轉(zhuǎn)移癌或合并其他部位惡性腫瘤;②合并急慢性感染或免疫、血液系統(tǒng)損害;③年齡<18歲;④院內(nèi)死亡、拒接接受隨訪、臨床資料不完整。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 lncRNA CRNDE、miR-29a-3p表達(dá)檢測:收集RCC患者術(shù)中部分癌組織和癌旁組織,液氮下碾磨組織標(biāo)本,Trizol法(杭州昊鑫生物科技股份有限公司,編號:RN0102)提取組織總RNA,TaKaRa RNA PCR Kit試劑盒(北京麥瑞博生物科技有限公司,編號:RR001A-1)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,條件42 ℃ 1 h,95 ℃ 5 min。以cDNA為模板,參考SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司,編號:DRR041A)說明書進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)體系共20.0 μl:cDNA模板1.0 μl、2×Master mix 8 μl、上游引物0.5 μl、下游引物0.5 μl、SYBR Premix Ex Taq 5.0 μl、RNase-free ddH2O 5.0 μl;反應(yīng)條件95 ℃ 90 s(循環(huán)1次)、95 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s(循環(huán)40次)。lncRNA CRNDE以GAPDH為內(nèi)參,miR-29a-3p以U6為內(nèi)參,2-ΔΔCT法計算組織中l(wèi)ncRNA CRNDE、miR-29a-3p相對表達(dá)量。lncRNA CRNDE:上游引物5′-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3′,下游引物5′-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3′;GAPDH:上游引物5′-TCAAGGCTGAGAACGGG-3′,下游引物5′- TGGACTCCACGACGTCA-3′;miR-29a-3p:上游引物5′-UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG-3′,下游引物5′-CUACCUGCACUAUAAGCACUUA-3′;U6:上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′,下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGT-3′。

1.3.2 隨訪和分組:RCC患者出院后通過電話或門診隨訪3年(第1年每3個月1次,然后每6個月1次),隨訪截至終點事件發(fā)生(死亡)或隨訪時間終止(2022年11月),統(tǒng)計累積生存率。根據(jù)RCC組織中l(wèi)ncRNA CRNDE、miR-29a-3p表達(dá)均值分為高、低表達(dá)組。

2 結(jié) 果

2.1 RCC癌組織與癌旁組織中l(wèi)ncRNA CRNDE、miR-29a-3p表達(dá)比較 RCC癌組織中l(wèi)ncRNA CRNDE表達(dá)高于癌旁組織,miR-29a-3p表達(dá)低于癌旁組織(P<0.01),見表1。

表1 RCC癌組織與癌旁組織中l(wèi)ncRNA CRNDE、miR-29a-3p表達(dá)比較Tab.1 Comparison of lncRNA CRNDE and miR-29a-3p expression in RCC cancer tissue and adjacent tissues

2.2 RCC癌組織中l(wèi)ncRNA CRNDE與miR-29a-3p表達(dá)的相關(guān)性 經(jīng)StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測,lncRNA CRNDE與miR-29a-3p存在互補(bǔ)序列(圖1)。Pearson相關(guān)性分析顯示,RCC組織中l(wèi)ncRNA CRNDE與miR-29a-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.739,P<0.001)。

圖1 lncRNA CRNDE與miR-29a-3p結(jié)合位點示意圖Fig.1 Schematic diagram of lncRNA CRNDE and miR-29a-3p binding sites

2.3 RCC癌組織中l(wèi)ncRNA CRNDE、miR-29a-3p表達(dá)在不同臨床病理特征中的差異比較 RCC癌組織中l(wèi)ncRNA CRNDE在WHO/ISUP分級3～4級、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中高于WHO/ISUP分級1～2級、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.01),而miR-29a-3p表達(dá)低于WHO/ISUP分級1～2級、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.01);二者在不同性別、年齡、腫瘤位置、RCC亞型、腫瘤直徑中比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 RCC癌組織中l(wèi)ncRNA CRNDE、miR-29a-3p表達(dá)在不同臨床病理特征中的比較Tab.2 Comparison of lncRNA CRNDE and miR-29a-3p expression in RCC cancer tissues in different clinical and pathological features

2.4 RCC癌組織中l(wèi)ncRNA CRNDE、miR-29a-3p表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 隨訪3年,92例RCC患者失訪3例,死亡17例,3年累積生存率為81.52%(75/92)。K-M生存曲線分析顯示,lncRNA CRNDE高表達(dá)組累積生存率73.47%(36/49)低于lncRNA CRNDE低表達(dá)組90.70%(39/43);miR-29a-3p高表達(dá)組累積生存率91.49%(43/47)高于miR-29a-3p低表達(dá)組71.11%(32/45),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.346、5.773,P=0.037、0.016),見圖3。

圖3 不同lncRNA CRNDE、miR-29a-3p表達(dá)RCC患者K-M生存曲線Fig.3 K-M survival curve of RCC patients with different lncRNA CRNDE and miR-29a-3p expressions

2.5 存活組與死亡組患者臨床資料比較 存活組RCC患者WHO/ISUP分級3～4級、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例及l(fā)ncRNA CRNDE表達(dá)低于死亡組,miR-29a-3p表達(dá)高于死亡組(P<0.05),其他資料2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表3 存活組與死亡組RCC患者臨床資料比較Tab.3 Comparison of clinical data between survival and death groups of RCC patients

2.6 RCC患者死亡的多因素Cox回歸分析 以RCC患者死亡為因變量, 以上述結(jié)果中P<0.05項目為自變量進(jìn)行多因素Cox回歸分析,結(jié)果顯示,WHO/ISUP分級3～4級、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、lncRNA CRNDE高為RCC患者死亡的獨立危險因素,miR-29a-3p高為獨立保護(hù)因素(P<0.05),見表4。

表4 RCC患者死亡的多因素Cox回歸分析Tab.4 Multivariate Cox regression analysis of mortality in RCC patients

3 討 論

RCC是起源于腎小管上皮的惡性腫瘤,以血尿、腰部包塊和疼痛為主要臨床表現(xiàn),其發(fā)病可能與肥胖、吸煙、遺傳等有關(guān)[11]。盡管近年來隨著影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展,RCC早期診斷率顯著增加,局限性RCC經(jīng)根治性腎切除術(shù)或保留腎單位腎臟腫瘤切除術(shù)可獲得滿意療效,但仍有17%的RCC患者在確診時已屬晚期,且手術(shù)切除后仍有30%～40%的患者可出現(xiàn)局部轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處復(fù)發(fā),絕大多數(shù)患者因此死亡[12-13]。近年來基于晚期轉(zhuǎn)移性RCC的靶向治療和免疫治療取得一定進(jìn)展,但僅獲得了無疾病生存獲益,未能獲得總生存率獲益,不能滿足臨床需求[14]。因此亟需深入了解RCC發(fā)病機(jī)制,對促進(jìn)RCC靶向治療和預(yù)后改善具有重要意義。

RCC的發(fā)生發(fā)展涉及一系列基因組和表觀遺傳學(xué)改變,非編碼RNA能通過調(diào)控表觀遺傳參與RCC發(fā)生發(fā)展[3-4]。lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本>200個核苷酸的非編碼RNA,能直接或通過海綿miRNA間接調(diào)控基因表達(dá),進(jìn)而參與RCC調(diào)控[15]。lncRNA CRNDE定位于人染色體16q12.2,最初于結(jié)直腸癌發(fā)現(xiàn)高表達(dá),并與結(jié)直腸癌惡性進(jìn)展有關(guān)[16]。近年研究發(fā)現(xiàn),lncRNA CRNDE還參與其他惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展,如Wang等[17]報道,lncRNA CRNDE能靶向miR-423-5p上調(diào)肌動蛋白結(jié)合蛋白1促進(jìn)卵巢癌的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。Li等[18]研究報道,沉默lncRNA CRNDE能靶向miR-423-5p下調(diào)組蛋白脫乙酰酶2抑制非小細(xì)胞肺癌增殖、遷移和侵襲。但關(guān)于lncRNA CRNDE在RCC的臨床意義尚不清楚。本研究結(jié)果顯示,RCC癌組織中l(wèi)ncRNA CRNDE高表達(dá),與WHO/ISUP分級、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),說明lncRNA CRNDE高表達(dá)與RCC發(fā)生發(fā)展有關(guān)。lncRNA CRNDE在RCC中高表達(dá)可能與其啟動子被癌基因激活有關(guān),而隨著lncRNA CRNDE表達(dá)升高,能激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路促進(jìn)RCC進(jìn)展。Wnt/β-連環(huán)蛋白是介導(dǎo)RCC等多種惡性腫瘤增殖、遷移和侵襲的重要信號通路[19-20]。Shao等[21]實驗發(fā)現(xiàn),RCC表達(dá)增強(qiáng)的lncRNA CRNDE能激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路,在體外和體內(nèi)均促進(jìn)RCC增殖和生長。

miRNA能通過與mRNA完美互補(bǔ)或不完美配對引發(fā)mRNA降解或轉(zhuǎn)錄后基因沉默,進(jìn)而參與RCC調(diào)控[22-23]。miR-29a-3p定位于人染色體7q32.3,是miR-29家族表達(dá)最豐富的成員,近年來大量研究報道了其與惡性腫瘤的關(guān)系,如Pan等[24]報道,miR-29a-3p能靶向Ⅰ型膠原蛋白α2鏈抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲。Qi等[23]研究報道,miR-29a-3p能靶向胰島素樣生長因子1介導(dǎo)的磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/叉頭框蛋白O3抑制骨肉瘤增殖、遷移和侵襲。上述研究提示,miR-29a-3p在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用。本研究結(jié)果顯示,RCC癌組織中miR-29a-3p低表達(dá),與WHO/ISUP分級、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),說明miR-29a-3p低表達(dá)與RCC發(fā)生發(fā)展有關(guān)。miR-29a-3p在RCC中低表達(dá)可能與其啟動子被甲基化而導(dǎo)致沉默有關(guān)[24]。而隨著miR-29a-3p表達(dá)降低,可上調(diào)賴氨酸特異性去甲基化酶5B(lysine-specific demethylase 5B,KDM5B)促進(jìn)RCC進(jìn)展。KDM5B是一種組蛋白去甲基化酶,能作用于逆轉(zhuǎn)錄元件促進(jìn)腫瘤免疫逃逸,與RCC惡性進(jìn)展密切相關(guān)[25]。仇海軍等[26]實驗發(fā)現(xiàn),過表達(dá)miR-29a-3p能靶向下調(diào)KDM5B抑制腎透明細(xì)胞癌增殖和侵襲。

本研究通過網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn),lncRNA CRNDE與miR-29a-3p存在互補(bǔ)序列,相關(guān)性分析也發(fā)現(xiàn)二者在RCC組織中表達(dá)呈負(fù)相關(guān),提示lncRNA CRNDE與miR-29a-3p共同參與RCC進(jìn)展。最近孫定軍等[27]實驗報道,沉默lncRNA CRNDE能靶向負(fù)調(diào)控miR-29a-3p抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。但關(guān)于lncRNA CRNDE與miR-29a-3p在RCC是否存在靶向關(guān)系還需進(jìn)一步實驗證實。本研究通過分析預(yù)后發(fā)現(xiàn),相比lncRNA CRNDE高表達(dá)和miR-29a-3p低表達(dá)患者,lncRNA CRNDE低表達(dá)與miR-29a-3p高表達(dá)患者3年累積生存率顯著增加,說明lncRNA CRNDE、miR-29a-3p表達(dá)與RCC患者預(yù)后有關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),lncRNA CRNDE、miR-29a-3p與RCC患者死亡獨立相關(guān),進(jìn)一步說明二者可能成為RCC患者預(yù)后潛在預(yù)測指標(biāo)。

綜上所述,RCC癌組織中l(wèi)ncRNA CRNDE表達(dá)升高,miR-29a-3p表達(dá)降低,與WHO/ISUP分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān),lncRNA CRNDE與miR-29a-3p可能共同參與RCC進(jìn)展。但本研究結(jié)果還需多中心研究證實。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

王晨宇、郭峰:設(shè)計研究方案,實施研究過程,論文撰寫,統(tǒng)計學(xué)分析;趙建華:提出研究思路,分析試驗數(shù)據(jù),論文審核;羅勇:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改