李旭瑜,張玉,王旭東,袁鵬飛,紀(jì)世琪,劉慶軍

膀胱癌是常見(jiàn)尿路上皮癌,全球每年發(fā)病43.0萬(wàn)例,死亡16.5萬(wàn)例[1]。非肌層浸潤(rùn)膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC)最為常見(jiàn),占所有原發(fā)性膀胱癌的70%。經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切(transurethral resection of bladder tumor,TURBT)是NMIBC的主要治療方式,但術(shù)后易發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[2-3]。目前NMIBC術(shù)后復(fù)查主要依賴(lài)膀胱鏡等檢查,但費(fèi)用昂貴且具有侵入性。血清淀粉樣蛋白A4(serum amyloid A4,SAA4)是一種急性期蛋白,參與機(jī)體免疫、代謝等生理學(xué)過(guò)程的調(diào)控。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),SAA4在卵巢癌、肺癌等腫瘤中表達(dá)升高,是新的腫瘤血清標(biāo)志物[4-5]。激肽釋放酶B1(kallikrein B1,KLKB1)是一種絲氨酸蛋白酶,參與凝血、纖溶、激肽生成等過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn),KLKB1在肝癌等惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào),其通過(guò)影響機(jī)體抗腫瘤免疫能力,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6-7]。目前SAA4、KLKB1在NMIBC中表達(dá)的臨床意義尚不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)NMIBC中SAA4、KLKB1的表達(dá),探討兩者與NMIBC臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1月—2019年12月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院泌尿外科接受TURBT治療的NMIBC患者100例為NMIBC組,男61例,女39例,年齡32～76(63.47±4.19)歲;病程7～58(15.12±4.67) d;既往史:高血壓25例,糖尿病14例;膀胱癌家族史2例;吸煙41例;腫瘤直徑≥3 cm者27例,<3 cm者73例;腫瘤數(shù)目:單發(fā)66例,多發(fā)34例;腫瘤TNM分期:Ta-Tis期40例,T1期60例;病理分級(jí):低級(jí)別尿路上皮癌58例,高級(jí)別尿路上皮癌42例。根據(jù)NMIBC患者血清SAA4、KLKB1水平的平均值52.19 μg/L、4.12 U/ml,將NMIBC患者分為SAA4高水平組(n=49)和低水平組(n=51),KLKB1高水平組(n=48)和低水平組(n=52)。以同期健康體檢者60例為健康對(duì)照組,男38例,女22例,年齡31～77(62.98±4.05)歲;既往史:高血壓11例,糖尿病6例,吸煙26例。NMIBC組和健康對(duì)照組在性別、年齡、高血壓史、糖尿病史及吸煙史之間比較,差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)通過(guò)(2017-0123),入選者或家屬知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①所有NMIBC患者均經(jīng)膀胱鏡鏡檢及病理組織活檢,病理明確為NMIBC;②均無(wú)明顯誘因,初次診治,無(wú)放化療治療史;③能配合治療和隨訪;④臨床資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①伴其他惡性腫瘤;②合并尿道狹窄,膀胱攣縮或尿路感染等疾病;③合并嚴(yán)重肝腎功能障礙;④合并急慢性感染性疾病或自身免疫性疾病;⑤近3個(gè)月有心腦血管疾病、下肢靜脈血栓等疾病。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 血清SAA4、KLKB1水平檢測(cè):NMIBC患者入院后第2天清晨、健康對(duì)照組健康體檢時(shí)采取空腹肘靜脈血4 ml至不含抗凝劑的采血管中,室溫靜置1 h,離心留取上層血清待測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(雙抗夾心法)檢測(cè)血清SAA4、KLKB1水平。人SAA4 ELISA試劑盒購(gòu)自上?？婆嗳鸸?貨號(hào)KPR-1175)。實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.2 術(shù)后治療及隨訪:患者TURBT術(shù)后均接受規(guī)范的膀胱灌注化療。隨訪間隔時(shí)間:術(shù)后第1年每3個(gè)月電話(huà)或門(mén)診隨訪1次,術(shù)后第2～3年每6個(gè)月隨訪1次。隨訪內(nèi)容:根據(jù)隨訪過(guò)程中膀胱鏡鏡檢,尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查及盆腔CT等影像學(xué)檢查等,對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)及進(jìn)展情況進(jìn)行評(píng)估。隨訪終點(diǎn)為2022年12月。NMIBC腫瘤進(jìn)展定義為腫瘤膀胱局部復(fù)發(fā),盆腔或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或患者發(fā)生腫瘤相關(guān)死亡。無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間(progression free survival,PFS)為自確診之日至NMIBC腫瘤進(jìn)展的間隔時(shí)間。

2 結(jié) 果

2.1 血清SAA4、KLKB1水平比較 NMIBC組血清SAA4、KLKB1水平分別為(52.19±6.38)μg/L、(4.12±0.61)U/ml,高于健康對(duì)照組血清SAA4、KLKB1水平(21.54±5.17)μg/L、(2.06±0.44)U/ml,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=31.508、22.825,P均<0.001)。

2.2 血清SAA4、KLKB1水平的相關(guān)性 NMIBC患者血清SAA4與KLKB1水平呈顯著正相關(guān)(r=0.725,P<0.001)。

2.3 血清SAA4、KLKB1水平與臨床病理特征的關(guān)系 T1期、高級(jí)別NMIBC患者中血清SAA4、KLKB1水平分別高于Ta/Tis期、低級(jí)別癌組織患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)表1。

表1 血清SAA4、KLKB1水平與NMIBC臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 Relationship between serum SAA4, KLKB1 levels and clinical pathological parameters of NMIBC

2.4 不同SAA4、KLKB1水平NMIBC患者PFS比較 NMIBC患者100例中, TURBT術(shù)后3年發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移41例,PFS為59.00%(59/100)。3年P(guān)FS: SAA4高水平患者為42.86%(21/49),低于SAA4低水平的74.51%(38/51),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-Rankχ2=8.275,P=0.004);KLKB1高水平患者為41.67%(20/48),低于低水平患者的75.00%(39/52),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-Rankχ2=10.420,P=0.001),見(jiàn)圖1。

圖1 K-M生存曲線分析血清SAA4、KLKB1對(duì)NMIBC患者預(yù)后的影響Fig.1 K-M survival curve analysis: The impact of SAA4 and KLKB1 on the prognosis of NMIBC patients

2.5 NMIBC患者無(wú)進(jìn)展生存預(yù)后的影響因素分析 以NMIBC是否發(fā)生進(jìn)展為因變量(1=進(jìn)展,0=未進(jìn)展,t=進(jìn)展時(shí)間),以上述結(jié)果中P<0.05項(xiàng)目為自變量進(jìn)行多因素Cox回歸分析,結(jié)果顯示,腫瘤分期T1期、病理分級(jí)高、SAA4高表達(dá)、KLKB1高表達(dá)是影響NMIBC患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.01),見(jiàn)表2。

表2 NMIBC患者無(wú)進(jìn)展生存預(yù)后的影響多因素Cox回歸分析Tab.2 Multivariate Cox regression analysis of the impact of progression free survival prognosis in NMIBC patients

3 討 論

膀胱癌是常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)腫瘤,我國(guó)每年新發(fā)8.2萬(wàn)例[8]。目前臨床上NMIBC的治療以TURBT為主,并輔以術(shù)后膀胱灌注局部化療。但仍有約60%的NMIBC患者術(shù)后1～2年可能發(fā)生腫瘤局部復(fù)發(fā),其中約15%的NMIBC患者可進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)膀胱癌,導(dǎo)致預(yù)后不佳[9]。目前NMIBC臨床預(yù)后的評(píng)估主要根據(jù)腫瘤分期、病理分級(jí)等臨床病理因素進(jìn)行分層,但由于膀胱癌腫瘤異質(zhì)性,不同患者臨床預(yù)后差異較大,難以準(zhǔn)確評(píng)估NMIBC患者預(yù)后[10]。

SAA4基因位于11p15.1,屬于血清淀粉樣蛋白A家族成員,是一種高度糖基化的蛋白。研究表明,SAA4參與炎性反應(yīng)、血管生成因子如血管細(xì)胞黏附因子1等的調(diào)節(jié),與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤等疾病密切相關(guān)[10-11]。本研究中,NMIBC患者血清SAA4水平升高,與腫瘤分期及分級(jí)有關(guān),提示SAA4可能參與NMIBC腫瘤發(fā)生發(fā)展。這與Gómez等[7]基于絕對(duì)定量同位素標(biāo)記技術(shù)的研究結(jié)果一致。NMIBC中SAA4水平升高的機(jī)制與轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常有關(guān)。研究表明,膀胱癌發(fā)生時(shí)腫瘤中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子TWIST表達(dá)上調(diào),其能夠結(jié)合SAA4啟動(dòng)子區(qū),促進(jìn)SAA4的表達(dá),導(dǎo)致患者不良預(yù)后[12-13]。此外,SAA4能夠激活腫瘤細(xì)胞中AKT基因的表達(dá),促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶1和9的表達(dá),增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力,導(dǎo)致腫瘤惡性進(jìn)展[4]。本研究還發(fā)現(xiàn),血清SAA4高水平的NMIBC患者PFS預(yù)后較差,表明SAA4是一種新的NMIBC預(yù)后相關(guān)腫瘤標(biāo)志物。SAA4水平升高能夠重塑腫瘤微環(huán)境,促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞向M2型分化,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸,導(dǎo)致患者不良預(yù)后[14-15]。此外,Wang等[16]發(fā)現(xiàn),SAA4的表達(dá)升高能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進(jìn)對(duì)化療耐藥性的形成,增加NMIBC患者術(shù)后腫瘤局部復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。

KLKB1編碼基因位于4q35.2,是胰蛋白酶樣蛋白酶前體形式,能夠與激肽原結(jié)合形成復(fù)合體,介導(dǎo)緩激肽釋放、凝血酶生成激活及纖溶等過(guò)程,與高血壓、血栓性疾病等關(guān)系密切[17]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),在肝癌、黑色素瘤等惡性腫瘤中均存在KLKB1表達(dá)升高的現(xiàn)象,是新的腫瘤預(yù)后標(biāo)志物[18-19]。本研究中,NMIBC患者血清KLKB1水平升高,與既往研究報(bào)道一致[7],表明KLKB1參與NMIBC腫瘤的發(fā)生過(guò)程。筆者分析,NMIBC是膀胱癌的早期階段,惡性腫瘤細(xì)胞通過(guò)分泌產(chǎn)生促凝血因子,導(dǎo)致患者機(jī)體常處于高凝狀態(tài),導(dǎo)致KLKB1基因表達(dá)上調(diào)。本研究中,KLKB1表達(dá)與NMIBC腫瘤分期、分級(jí)有關(guān),提示KLKB1參與NMIBC的腫瘤進(jìn)展。其原因可能與KLKB1參與調(diào)控腫瘤微環(huán)境有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞中KLKB1的表達(dá)升高能夠降解細(xì)胞與細(xì)胞間連接及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的整合素受體,增加腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力,促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[20]。此外,KLKB1還能夠通過(guò)降解并釋放與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合的表皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等,形成可溶性形式,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及腫瘤血管生成等,導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移[21]。本研究中,血清KLKB1高水平NMIBC患者預(yù)后較差,提示KLKB1是一種新的NMIBC預(yù)后相關(guān)腫瘤標(biāo)志物。分析其原因,KLKB1能夠在轉(zhuǎn)錄后水平促進(jìn)尿激酶受體的表達(dá)[22],而膀胱癌中尿激酶受體表達(dá)升高能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移,增加腫瘤復(fù)發(fā)進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn),導(dǎo)致患者無(wú)進(jìn)展生存預(yù)后和總體生存預(yù)后較差。因此,臨床泌尿外科醫(yī)師可根據(jù)NMIBC患者血清KLKB1水平,對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估,對(duì)于高?；颊哂枰苑e極治療,如采取卡介苗免疫治療或TURBT術(shù)后短期內(nèi)二次電切,以減少TURBT術(shù)后腫瘤殘留,降低腫瘤復(fù)發(fā)進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn),改善患者的臨床預(yù)后。

本研究中,NMIBC患者血清中SAA4與KLKB1水平呈顯著正相關(guān),提示兩者可能共同參與NMIBC的腫瘤進(jìn)展。既往學(xué)者對(duì)NMIBC患者血清中差異性表達(dá)的蛋白通路進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)NMIBC患者載脂蛋白通路中SAA4、載脂蛋白A等和絲氨酸蛋白酶通路中的KLKB1、α1抗胰蛋白酶等基因表達(dá)均有良好的相關(guān)性,提示兩個(gè)通路之間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系,共同參與促進(jìn)膀胱癌淋巴管的生成和淋巴轉(zhuǎn)移[7]。但NMIBC中SAA4與KLKB1的具體作用機(jī)制及能否成為新的NMIBC治療靶點(diǎn),值得繼續(xù)深入研究。

綜上所述,NMIBC患者血清SAA4、KLKB1水平升高,兩者與腫瘤TNM分期、病理分級(jí)有關(guān)。血清SAA4、KLKB1高水平NMIBC患者PFS預(yù)后較差,是影響患者PFS預(yù)后的新的腫瘤標(biāo)志物。但本研究也存在以下問(wèn)題:臨床樣本量較少,未能對(duì)NMIBC不同的亞型如T1、Ta和Tis進(jìn)行分層分析,有待今后擴(kuò)大樣本量深入研究;本研究未對(duì)SAA4、KLKB1在NMIBC中具體作用機(jī)制進(jìn)行研究,有待今后進(jìn)行基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步探索。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

李旭瑜:研究構(gòu)思、課題設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)獲取、統(tǒng)計(jì)分析、論文撰寫(xiě);張玉、王旭東、袁鵬飛、紀(jì)世琪:數(shù)據(jù)獲取;劉慶軍:研究構(gòu)思、論文修改、論文終審