張艷,費(fèi)旭茂,張雪梅,付曾強(qiáng),羅洪

食管癌是全球范圍內(nèi)最常見惡性腫瘤之一,而我國是食管癌高發(fā)國家,TheLancet統(tǒng)計(jì)了1990—2017年間195個(gè)國家和地區(qū)的數(shù)據(jù)顯示,與全球食管癌數(shù)據(jù)相比,無論新發(fā)病例,還是死亡病例,我國幾乎均占50%[1]。組織學(xué)上,食管癌可分腺癌、鱗狀細(xì)胞癌,而后者是主要亞型,約占全球食管癌的90%,且鱗狀細(xì)胞癌更易發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[2]。近年腫瘤免疫治療已逐漸發(fā)展成腫瘤的重要治療手段,能有效殺傷腫瘤細(xì)胞并抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,而免疫治療較大程度上依賴于對(duì)腫瘤微環(huán)境免疫景觀的全面了解。CD8+T細(xì)胞是在機(jī)體抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用的一種T淋巴細(xì)胞,能通過釋放穿孔素、顆粒酶等細(xì)胞毒性物質(zhì)直接殺傷腫瘤細(xì)胞[3];骨髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)是由樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞的祖細(xì)胞或前體細(xì)胞構(gòu)成的一群未成熟的異質(zhì)性骨髓細(xì)胞,Yang等[4]于2022年報(bào)道顯示,MDSCs在胃癌等多種腫瘤疾病中具有免疫抑制潛能,其能通過分泌衣康酸而影響CD8+T細(xì)胞增殖及相關(guān)細(xì)胞因子的生成活性[5]。本研究旨在探討MDSCs在食管鱗癌患者免疫微環(huán)境中的表達(dá)及與CD8+T細(xì)胞的關(guān)系,為臨床完善治療方案提供更多依據(jù),報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年1月—2021年10月中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院腫瘤科診治食管鱗癌患者103例,根據(jù)預(yù)后情況(隨訪過程中失訪5例)分病情進(jìn)展組(n=46)、無進(jìn)展組(n=52)。病情進(jìn)展組男28例,女18例,年齡48～75(62.06±6.82)歲;體質(zhì)量指數(shù)18～26(20.21±2.33)kg/m2;吸煙13例,飲酒16例;基礎(chǔ)疾病:高血壓13例,糖尿病7例,冠心病6例;有家族史11例。無進(jìn)展組男30例,女22例,年齡44～75(59.97±7.11)歲;體質(zhì)量指數(shù)18～27(21.04±2.51)kg/m2;吸煙14例,飲酒15例;基礎(chǔ)疾病:高血壓11例,糖尿病7例,冠心病4例;有家族史8例。2組患者性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙情況、飲酒情況、基礎(chǔ)疾病情況、有家族史例數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(1901205),患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)《中國早期食管鱗狀細(xì)胞癌及癌前病變篩查與診治共識(shí)(2015年,北京)》[6]診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為食管鱗癌;首次確診,且入組前未進(jìn)行放化療、免疫治療等;未出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;卡氏評(píng)分>70分。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):精神異常;嚴(yán)重心腦等臟器功能障礙;感染性疾病;血液系統(tǒng)疾病;自身免疫性疾病;合并其他腫瘤疾病。

1.3 治療方法 患者均采用胸腔鏡三野清掃食管癌根治術(shù)治療,并根據(jù)患者病情及意愿實(shí)施圍術(shù)期治療,包括新輔助化療、輔助化療及輔助放化療。(1)新輔助化療:第1、8天靜脈滴注長春瑞濱25 mg/m2,第1～3天靜脈注射順鉑25 mg/m2,3周為1個(gè)療程,治療2個(gè)療程。(2)新輔助化療后4～8周進(jìn)行胸腔鏡三野清掃食管癌根治術(shù):雙腔氣管插管全麻,左側(cè)45°側(cè)俯臥位,抬高雙上肢置頭兩側(cè),腋中線第7肋間做10 mm長穿刺孔,建立二氧化碳?xì)庑?<8 mmHg),置入胸腔鏡;分別在肩胛下角線偏前第6、第9肋間做10 mm穿刺孔置入套管,第9肋間孔作觀察孔,第6肋間孔置電鉤、腔鏡抓鉗,分離并清掃上縱隔,置入套管針觀察病灶位置、大小,游離縱隔胸膜,切斷,游離胸段食管,提起,清掃淋巴結(jié),術(shù)畢縫合切口,置引流管。(3)術(shù)后輔助化療:術(shù)后第1、8天靜脈滴注長春瑞濱25 mg/m2,第1～3天靜脈滴注順鉑25 mg/m2,3周為1個(gè)療程,治療4個(gè)療程。(4)術(shù)后放療:照射野包含雙鎖骨上區(qū)、中上縱隔淋巴引流區(qū)、吻合口及瘤床,術(shù)后3～4周進(jìn)行放療,中位總劑量54 Gy/27次,2Gy/次,5次/周。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 外周血MDSCs比率及外周血CD8+T細(xì)胞比率檢測(cè):于治療前均采用乙二胺四乙酸抗凝管采集患者清晨空腹肘靜脈血8 ml,均分為2份,其中1份采用賽默飛世爾Attune NxT型流式細(xì)胞儀測(cè)定CD8+T細(xì)胞比率;另1份以Ficoll密度梯度離心法獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞,并制成細(xì)胞混懸液(1×106/μl),采用賽默飛世爾Attune NxT型流式細(xì)胞儀檢測(cè)MDSCs比率。

1.4.2 臨床資料收集:包括性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史、飲酒史、基礎(chǔ)疾病、腫瘤位置、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化程度、治療方法、CEA、CA199、MDSCs比率、CD8+T細(xì)胞比率等。

1.4.3 隨訪:以出院時(shí)為觀察起點(diǎn),通過電話、門診復(fù)查隨訪至2022年12月31日,患者第1年間隔3個(gè)月復(fù)查1次,此后每間隔6個(gè)月復(fù)查1次,以確診疾病進(jìn)展為隨訪終點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 比較不同病理特征患者外周血MDSCs比率及外周血CD8+T細(xì)胞比率 103例患者M(jìn)DSCs比率、CD8+T細(xì)胞比率分別為(24.56±4.78)%、(22.69±3.65)%。不同腫瘤位置患者M(jìn)DSCs比率及CD8+T細(xì)胞比率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。浸潤深度為T3/T4、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者M(jìn)DSCs比率高于浸潤深度為T1/T2、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者,CD8+T細(xì)胞比率低于浸潤深度為T1/T2、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);隨著分化程度降低,MDSCs比率呈升高趨勢(shì),CD8+T細(xì)胞比率呈降低趨勢(shì),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01),見表1。

表1 不同病理特征食管癌患者M(jìn)DSCs比率和CD8+T細(xì)胞比率比較Tab.1 Comparison of MDSCs and CD8+T cell ratios in patients with different pathological characteristics

2.2 外周血MDSCs比率與CD8+T細(xì)胞比率相關(guān)性分析 MDSCs比率與CD8+T細(xì)胞比率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.654,P<0.001)。

2.3 不同預(yù)后患者臨床資料比較 103例患者隨訪過程中失訪5例,有效隨訪98例(病情進(jìn)展46例,無進(jìn)展52例)。不同預(yù)后患者性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史、飲酒史、基礎(chǔ)疾病、腫瘤位置、治療方法比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病情進(jìn)展組浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CEA、CA199、MDSCs比率高于無進(jìn)展組,分化程度、CD8+T細(xì)胞比率低于無進(jìn)展組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 不同預(yù)后食管癌患者臨床資料比較Tab.2 Comparison of clinical data of patients with different prognosis

2.4 外周血MDSCs比率及外周血CD8+T細(xì)胞比率與患者預(yù)后的關(guān)系 以是否出現(xiàn)病情進(jìn)展為因變量,以MDSCs比率及CD8+T細(xì)胞比率四分位組為自變量,以Q1分位組為對(duì)照,經(jīng)Cox回歸模型分析發(fā)現(xiàn),調(diào)整混雜因素后MDSCs比率高仍為患者病情進(jìn)展的危險(xiǎn)因素,CD8+T細(xì)胞比率高仍為保護(hù)因素(P<0.05),見表3。

表3 外周血MDSCs比率及外周血CD8+T細(xì)胞比率與食管癌患者預(yù)后的獨(dú)立關(guān)系Tab.3 Independent relationship between peripheral blood MDSCs ratio and peripheral blood CD8+T cell ratio and patient prognosis

2.5 不同MDSCs比率與CD8+T細(xì)胞比率患者無進(jìn)展生存率比較 以MDSCs比率(25%)、CD8+T細(xì)胞比率(22%)中位水平為界值,經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)顯示,不同MDSCs比率、CD8+T細(xì)胞比率患者無進(jìn)展生存率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.911,P=0.003;χ2=15.340,P<0.001),見圖1、圖2。

圖1 不同MDSCs比率食管癌患者無進(jìn)展生存率比較Fig.1 Comparison of progression free survival rates among patients with different MDSCs ratios

圖2 不同CD8+T細(xì)胞比率食管癌患者無進(jìn)展生存率比較Fig.2 Comparison of progression free survival rates among patients with different CD8+T cell ratios

3 討 論

食管鱗癌發(fā)生與長期酗酒、食物過硬等不良因素刺激密切相關(guān),其早期缺乏特異性,多數(shù)患者確診時(shí)已侵犯漿膜層和/或出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,患者預(yù)后較差[7]。因此,積極探明造成食管鱗癌易轉(zhuǎn)移特征的相關(guān)機(jī)制,并尋找能有效抑制食管鱗癌轉(zhuǎn)移的方法是臨床急需解決問題之一。

臨床已證實(shí),免疫逃逸是腫瘤的重要特征之一,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有至關(guān)重要的作用,腫瘤細(xì)胞能通過分泌細(xì)胞因子或聚集抑制性免疫細(xì)胞而構(gòu)成腫瘤細(xì)胞的生長微環(huán)境,干擾和阻止免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的監(jiān)控繼而發(fā)生腫瘤細(xì)胞持續(xù)增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移[8-9]。T細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫活性細(xì)胞,不僅直接介導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫功能,且在機(jī)體的免疫應(yīng)答中也發(fā)揮關(guān)鍵作用,其中CD8+T細(xì)胞是機(jī)體對(duì)腫瘤發(fā)揮免疫活性的主要效應(yīng)細(xì)胞[10]。國外報(bào)道表明[11],不同腫瘤綜合陽性評(píng)分的食管鱗癌患者腫瘤內(nèi)及瘤周CD8+T細(xì)胞浸潤情況不同,而腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞浸潤的患者生存率更高。國內(nèi)也有研究顯示[12],臨床Ⅲ期食管癌患者放療后CD8+T細(xì)胞比率增加,與患者無進(jìn)展生存期及總生存期顯著相關(guān),是評(píng)估患者預(yù)后的重要指標(biāo)。由此推測(cè),CD8+T細(xì)胞可能參與食管癌的發(fā)生發(fā)展過程。本研究對(duì)食管癌患者外周血CD8+T細(xì)胞比率進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果與上述推測(cè)一致,食管鱗癌患者外周血CD8+T細(xì)胞比率偏低,提示CD8+T細(xì)胞比率降低可能與食管鱗癌發(fā)生有關(guān)。隨著分化程度降低,CD8+T細(xì)胞比率呈降低趨勢(shì)(P<0.05),說明CD8+T細(xì)胞比率與食管鱗癌惡性程度有關(guān)。另外,浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況是評(píng)估食管鱗癌患者預(yù)后的重要依據(jù)。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn),浸潤深度為T3/T4及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者CD8+T細(xì)胞比率低于浸潤深度為T1/T2、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者,提示CD8+T細(xì)胞可能參與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程,或可作為臨床評(píng)估此類患者預(yù)后的依據(jù)。

大量研究顯示,腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫細(xì)胞的數(shù)量、時(shí)間及空間分布均存在高度異質(zhì)性[13-16]。盡管CD8+T細(xì)胞比率降低與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有關(guān),但其在食管鱗癌患者外周血中表達(dá)異常的確切機(jī)制尚未明確。MDSCs是一群由不成熟髓系細(xì)胞無法完成最終分化而形成的異質(zhì)性細(xì)胞,在多種動(dòng)物模型及腫瘤患者中均發(fā)現(xiàn)MDSCs作為一種免疫抑制細(xì)胞在腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促進(jìn)作用[17-18]。本研究也發(fā)現(xiàn),食管鱗癌患者外周血MDSCs比率與腫瘤位置無關(guān),而浸潤深度為T3/T4及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者M(jìn)DSCs比率顯著升高,且相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),MDSCs比率與CD8+T細(xì)胞比率呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)(P<0.05),提示二者可能共同參與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程。結(jié)合現(xiàn)有研究分析此機(jī)制可能包括:(1)正常情況,MDSCs能通過生成精氨酸酶而分解周圍環(huán)境內(nèi)T細(xì)胞活化必需的精氨酸,干擾CD8+T細(xì)胞活化過程,維持機(jī)體免疫功能的穩(wěn)定,而MDSCs異常生成時(shí)則免疫抑制過度[19]。(2)腫瘤細(xì)胞增殖過程中所生成干細(xì)胞因子、白介素-6等炎性因子會(huì)刺激MDSCs形成,并促使MDSCs轉(zhuǎn)移至外周血、外周淋巴器官繼而抑制CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)[20]。(3)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,MDSCs能通過選擇最有效的代謝途徑來感知環(huán)境并作出反應(yīng),如MDSCs在分化及激活過程中表現(xiàn)為糖酵解、戊糖磷酸途徑與三羧酸循環(huán)的增加,從而保護(hù)MDSCs免于凋亡并促進(jìn)其存活,并產(chǎn)生一氧化氮合酶及活性氧,造成CD8+T細(xì)胞增殖受阻[21]。進(jìn)一步Cox回歸模型分析發(fā)現(xiàn),調(diào)整混雜因素后MDSCs比率及CD8+T細(xì)胞比率均與患者病情進(jìn)展獨(dú)立相關(guān)(P<0.05),上述研究說明,MDSCs比率增加可能通過抑制CD8+T細(xì)胞活性而增加食管鱗癌細(xì)胞的免疫逃逸能力,影響患者預(yù)后。繼續(xù)Log-rank檢驗(yàn),MDSCs比率≤25%、CD8+T細(xì)胞比率≥22%的食管鱗癌患者治療后無進(jìn)展生存率更高,進(jìn)一步確定了MDSCs、CD8+T細(xì)胞在評(píng)估食管鱗癌預(yù)后中的價(jià)值。

綜上可知,食管鱗癌患者M(jìn)DSCs比率升高可通過抑制CD8+T細(xì)胞活性來增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力,繼而在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮促癌活性。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

張艷:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,論文撰寫;費(fèi)旭茂:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;張雪梅:資料搜集整理;付曾強(qiáng):提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù);羅洪:參與撰寫,論文審核,修訂論文,論文終審