曹玉清　汪航　徐雄

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murray）屬于茄科枸杞，在藏藥中被稱為“旁瑪”?！毒е楸静荨酚涊d，“旁瑪”味道略甘甜，性平，有養(yǎng)肝明目、生津止渴與補腎益血等功效，在月經(jīng)不調(diào)、心熱病與心臟病治療方面也具有較好的作用。除了具有較高的營養(yǎng)保健價值，黑果枸杞中還含有許多水溶性色素，這種色素具有較好的浸染力，是一種天然的食品著色劑，且具有抗氧化、抗疲勞等作用。

本文主要根據(jù)急性毒性實驗、遺傳毒性實驗以及亞慢性毒性實驗來探究黑果枸杞紅色素的安全性能，為黑果枸杞的開發(fā)利用提供實驗數(shù)據(jù)參考。

一、材料與儀器

1.材料。黑果枸杞的鮮果用含量為70%的乙醇進行浸提，提取出來的液體經(jīng)濃縮之后用大孔樹脂分離，便得到黑果枸杞的紅色素提取物，其中的主要成分是花色苷類物質(zhì)。將實驗要用的材料放置到陰涼、干爽、通風(fēng)處進行保存。

2.試驗環(huán)境與動物。試驗使用清潔級別的健康昆明小鼠，經(jīng)由動物實驗中心繁殖，都帶有合格證號。本次實驗提供的動物室內(nèi)溫度區(qū)間為：22℃-25℃，室內(nèi)相對濕度為：55%-70%。

3.菌株。本次實驗選用的實驗鼠為傷寒沙門菌株氨酸缺陷型，具體分別為TA97、TA98、TA100、TA102，這些菌株均由預(yù)防控制中心提供。

4.試驗儀器。實驗中用到的實驗儀器包括奧林巴斯全自動生化儀、希森美康全自動血球計數(shù)儀、西德茲照相顯微鏡等。

二、試驗方法

實驗嚴格根據(jù)GB 15193-2003《食品安全性毒理學(xué)評價程序和方法》中的具體要求開展。

1.急性毒性實驗。分別選擇大鼠20只、小鼠20只，其中雌鼠和雄鼠分別有10只。在正式開展實驗前需要對這些實驗動物禁食，禁食時間為16h，飲水量不設(shè)限制。稱取提取好的紅色素樣品，配制成500mg/mL的混合懸液，每間隔5h進行一次灌胃，總共3次灌胃，每次灌胃的量控制為0.2mL/10g·bw，共計劑量為30000mg/kg·bw。灌胃結(jié)束后，注意及時觀察實驗鼠的各種表現(xiàn)并做好記錄。實驗動物需要每周進行一次稱重，持續(xù)觀察兩周，實驗結(jié)束后將動物解剖進行觀察，根據(jù)毒性的分級標(biāo)準(zhǔn)評定實驗動物呈現(xiàn)出來的急性毒性強弱狀況。

2.遺傳毒性實驗。此次實驗研究主要運用的是污染物致突變性檢測、Bone marrow cell micronucleus test（骨髓細胞微核試驗）等，實驗全過程都嚴格按照相關(guān)規(guī)定進行。

3.亞慢性毒性實驗。選取60-80g的大鼠總共80只，雌雄各40只，根據(jù)體重隨機分成4個組，喂養(yǎng)90d。實驗分別設(shè)置高劑量、中劑量、低劑量及對照組，每組雌雄分別10只，總共20只。采取灌胃的方式，按照1.0mL/100g·BW的體積對劑量組實驗中的大鼠喂養(yǎng)紅色素樣品，每天灌胃一次，對照組則灌入相同量的純水，周期持續(xù)90d。進入實驗中期時，咽靜脈叢采血，抗凝處理后用實驗儀器血球計數(shù)儀檢測血紅蛋白、紅細胞以及白細胞，并對檢測結(jié)果進行分類處理。實驗完成后在第二天處死實驗鼠，取出部分血進行血清生化與血常規(guī)檢測，采集完成之后解剖，取出實驗動物的腎臟、睪丸、肝臟等臟器稱重，計算出臟器與大體之間的比值，對主要臟器，如肝臟、脾臟等進行病理組織學(xué)檢查。

三、數(shù)據(jù)統(tǒng)計

應(yīng)用SPSS 13.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和兩兩比較。

四、結(jié)果與討論

1.急性毒性實驗結(jié)果。對于急性毒性實驗，整個實驗觀察期間各實驗動物沒有出現(xiàn)中毒現(xiàn)象與死亡問題，觀察期結(jié)束后通過解剖實驗的大體，也沒有發(fā)現(xiàn)異常情況，根據(jù)結(jié)果可知小鼠急性毒性實驗屬于無毒級別。

2.遺傳毒性實驗結(jié)果。（1）Ames試驗。實驗中沒有出現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系，據(jù)此可以得出Ames試驗結(jié)果呈陰性。（2）小鼠骨髓微核試驗。通過分析實驗得出的骨髓微核統(tǒng)計結(jié)果可知，將實驗中的紅色素按照高劑量組、中劑量組、低劑量組中的微核率與對照組比較發(fā)現(xiàn)其存在的差異不具備統(tǒng)計學(xué)意義，但是通過對比環(huán)磷酰胺的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)P<0.01，有統(tǒng)計學(xué)意義。由此可知，試驗樣品中黑果枸杞紅色素對實驗小鼠的骨髓細胞沒有造成損害。（3）小鼠精子畸形試驗。小鼠精子畸形試驗中的低劑量組、中劑量組以及高劑量組和對照組中小鼠精子的畸形率都控制在合理范圍內(nèi)，在1.22%-1.39%。觀察精子畸形的實驗結(jié)果分析得出P>0.05，不具備顯著差異，對比環(huán)磷酰胺發(fā)現(xiàn)P<0.01，具備統(tǒng)計學(xué)意義。由此可知，樣品黑果枸杞紅色素對小鼠的精子沒有致畸作用。

3.亞慢性毒性實驗結(jié)果。（1）動物一般表現(xiàn)。在實驗的全部過程當(dāng)中，各個組別實驗動物的生長狀況都較好，未出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，實驗動物沒有出現(xiàn)死亡。（2）黑果枸杞紅色素對大鼠體重及食物利用率的影響。在整個試驗期間，實驗劑量組雌雄大鼠的總增重量、總進食量及總食物利用率與對照組對比，P<0.05，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，具體數(shù)據(jù)見表1。（3）對大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響。試驗完成后，比較劑量組與對照組之間血紅蛋白、血小板、紅細胞以及白細胞的分類，P>0.05，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，具體數(shù)值見表2。（4）對大鼠血液生化指標(biāo)的影響。各劑量組雌、雄性大鼠中的血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌酐與對照組相比，P>0.05，差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義，具體數(shù)值見表3。（5）對大鼠臟器重量和臟/體比值的影響。各劑量組大鼠的肝臟、腎臟、脾臟以及雄鼠睪丸與對照組相比，P>0.05，差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義，具體數(shù)值見表4。

4.解剖大體觀察及組織學(xué)檢查結(jié)果。黑果枸杞紅色素的試驗結(jié)束后，通過解剖試驗動物發(fā)現(xiàn)均未出現(xiàn)顯著性病變，選擇其中一組劑量組和對照組進行主要臟器組織的病理切片檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高劑量組與對照組中都有2只試驗動物的肝臟匯管區(qū)有輕微的炎癥細胞浸潤；試驗中的各組動物均有1只腎臟皮質(zhì)出現(xiàn)了少量的蛋白管，剩余的其他臟器組織均未發(fā)現(xiàn)病理組織學(xué)上的變化。這些組織病變均是動物本身就會出現(xiàn)的一些自發(fā)性病變，試驗組與對照組的病變程度和現(xiàn)狀比較相似，由此能夠排除是試驗樣品黑果枸杞紅色素所致。

本實驗以最大的實驗給藥量將大鼠、小鼠灌胃之后，均未出現(xiàn)中毒問題和死亡，并且以上3項遺傳毒性結(jié)果都呈陰性，因此可以判斷試驗樣品黑果枸杞紅色素屬于無毒級別。黑果枸杞的整顆果實都可食用，葉子也能食用，有很高的營養(yǎng)與藥用價值，將來可以加大黑果枸杞深加工產(chǎn)品的開發(fā)研究，充分發(fā)揮其價值。

作者簡介：曹玉清（1996-），女，漢族，江西九江人，助理工程師，大學(xué)本科，研究方向為天然色素的安全性。