顏學(xué)慧　梁緣　沈夢茹　王佑棟　劉言龍　李杰勤　詹秋文

摘要：獲得高質(zhì)量的DNA是分子試驗的一個先決條件，常用的植物DNA提取過程及步驟繁雜，需要進行多次離心操作，所需時間較長，并且在DNA提取過程中會用到三氯甲烷和其他一些有毒試劑，對操作人員有一定危害。為了篩選出高粱DNA的最優(yōu)提取方法，進行基因定位等方面的研究，采用十二烷基硫酸鈉（SDS）法、SDS+2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）法、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法、CTAB+2%PVP法和磁珠法，提取高粱不同部位（嫩葉、老葉、根、莖、種子）的DNA，然后對其提取步驟、DNA濃度、吸光度、PCR擴增效果等進行比較。結(jié)果表明，磁珠法步驟簡單、無毒、低成本，所需時間僅為其他幾種方法的1/3，D260 nm/D280 nm為1.8～2.0，DNA的質(zhì)量、純度、濃度優(yōu)于其他方法。各試驗數(shù)據(jù)表明，磁珠法提取的DNA最適于分子生物學(xué)驗，將其應(yīng)用于高粱葉色性狀基因的定位，可將紫色葉片基因PL1初步定位到4號染色體上，白條紋葉基因WSL10初步定位到10號染色體上。

關(guān)鍵詞：高粱；DNA；磁珠法；紫葉；白條紋葉；基因定位

中圖分類號：S514.032 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）12-0050-07

高粱［Sorghum bicolor （L.） Moench］為禾本科高粱屬一年生草本C4植物［1］，是繼小麥、水稻、玉米和大麥之后世界第五大谷類作物，其籽粒富含淀粉、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分［2-3］。高粱光合效率高，生物量大，高效節(jié)水，抗旱，耐鹽堿，耐貧瘠，富含糖分，對土壤和環(huán)境具有極強的適應(yīng)能力和抗逆特性［4］。高粱也是一種很好的飼料作物，營養(yǎng)價值高，適口性好，草食家畜采食后易消化，可顯著提高反芻家畜的消化機能及機體的免疫力和泌乳量［5-7］。另外，高粱還被廣泛用于淀粉、釀酒和乙醇產(chǎn)業(yè)，其中甜高粱作為能源作物在生物燃料方面展現(xiàn)出廣闊的開發(fā)利用前景［8-10］。

近年來，高粱分子標(biāo)記研究及重要農(nóng)藝性狀基因克隆、DNA文庫構(gòu)建、數(shù)量性狀座位（QTL）定位等方面的研究成為分子生物學(xué)研究的熱點［11-14］?？焖佟⒔?jīng)濟、安全、高質(zhì)量的DNA提取方法能夠提高轉(zhuǎn)基因試驗中轉(zhuǎn)基因植株的檢測效率［15］。優(yōu)質(zhì)提取DNA的方法應(yīng)具有高效、快速、簡單、污染小等優(yōu)點，此外安全性、經(jīng)濟價值也是值得注意的關(guān)鍵因素。目前，高粱DNA提取方法主要有十二烷基硫酸鈉（SDS）法、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法、尿素法和NaOH法等［16］，但在DNA提取過程中使用的試劑對DNA的完整性和質(zhì)量都有一定影響，往往安全性差，所耗時間長，難以達到快速且質(zhì)量高的效果。

植物葉色突變體是研究作物光合作用、葉綠素合成與降解及其生長發(fā)育調(diào)控機制的重要材料，國內(nèi)外對葉色的研究主要集中在雜種純度的快速鑒定上，也有將其運用到育種工作中［17］。如楊顏榕等在水稻葉色遺傳機制與基因克隆、分子調(diào)控機制及其在水稻育種上的應(yīng)用方面開展了探索［18］；任永梅等進行了水稻白條紋葉突變體wsl1的生理特性分析及基因定位研究［19］；金怡等對水稻苗期白條紋葉及抽穗期白穗突變體進行鑒定和基因定位，成功克隆了WSLWP基因［20］。高粱葉片基本都為綠色，但因葉片中色素比例不同，也會出現(xiàn)條紋葉、黃化葉、白化葉、斑點葉和紫葉等，育種者希望利用葉色標(biāo)記進行種子純度鑒別［21］。李杰勤等用高粱棕色中脈材料（bmr-6）與白色中脈材料雜交構(gòu)建F2代分離群體，并用SSR分子標(biāo)記對bmr-6進行了基因定位，初步將該基因定位于第7連鎖群［22］。但是，如何構(gòu)建高粱紫色和白條紋葉遺傳作圖群體，并了解其葉色性狀的遺傳和相關(guān)基因定位，目前未見報道。

本研究通過SDS法、SDS+2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）法、CTAB法、CTAB+2%PVP法和磁珠法，分別對高粱不同部位進行DNA提取，再進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳進行擴增條帶的比較，篩選出高粱DNA提取的最優(yōu)方法，并將其應(yīng)用于高粱紫葉、白條紋葉基因的定位，以期為高粱分子遺傳育種提供理論依據(jù)和應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

綠葉高粱Tx430、突變體白條紋高粱WSL10和紫葉高粱IS31557種子由安徽省飼草育種與利用重點實驗室提供。

提取高粱DNA使用的試驗材料為Tx430，于2020年9月種植于安徽科技學(xué)院種植科技園內(nèi)。紫葉性狀基因定位群體的母本為綠葉高粱Tx430，父本為紫葉高粱IS31557。2020年5月，將紫葉性狀的父母本及F2代種植于安徽科技學(xué)院種植科技園內(nèi)，其中Tx430高梁、IS31557高梁各種植30株，F(xiàn)2代分離群體共種植1 000株，種植密度行距為 50 cm，株距為30 cm，每行10株，待表現(xiàn)出紫葉后及時進行調(diào)查統(tǒng)計和分析。白條紋葉高粱基因定位群體的母本為白條紋葉高粱突變體WSL10，父本為綠葉高粱Tx430。2020年11月，將白條紋性狀的父母本高粱及F2代高粱種植于海南省三亞南繁基地，Tx430高粱、WSL10高粱各種植30株，F(xiàn)2代分離群體共種植1 000株。種植密度為行距50 cm，株距30 cm，每行種植10株，待白條紋性狀出現(xiàn)后及時進行調(diào)查統(tǒng)計分析。

1.2 高粱DNA的提取方法

1.2.1 SDS法 取適量試驗材料，清洗干凈后放入研缽中，加入液氮研磨成粉末，將粉末裝入2 mL離心管中（每管0.5 g），加600 μL SDS提取液，65 ℃水浴30 min（每10 min輕輕搖勻1次）；加入120 μL預(yù)冷的醋酸鉀（5 mol/L），輕輕搖勻，冰浴30 min；加入400 μL三氯甲烷-異戊醇溶液（體積比為 24 ∶1），搖勻30 min；12 000 r/min離心5 min；吸取400 μL上清液于1.5 mL離心管中，加入800 μL預(yù)冷的無水乙醇，搖勻后于-20 ℃冰浴30 min，再于12 000 r/min離心5 min；倒去上清液，加入400 μL 70%乙醇，輕輕晃動，靜置5 min；倒出70%乙醇，將離心管倒扣在吸水紙上吸干水分，再加入150 μL ddH2O，充分溶解后放于-20 ℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SDS+2%PVP法 取適量試驗材料，清洗干凈后放入研缽中，加入液氮，研磨成粉末。裝入 2 mL 離心管中（每管0.5 g），加600 μL SDS+2%PVP溶液，于65 ℃水浴30 min，每10 min輕輕搖勻1次。其余步驟同SDS法。

1.2.3 CTAB法 取適量試驗材料，清洗干凈后放入研缽中，加入液氮研磨成粉末，裝入2 mL離心管中（每管0.5 g），加600 μL CTAB溶液，于65 ℃水浴30 min。其余步驟同SDS法。

1.2.4 CTAB+2%PVP法 取適量試驗材料，清洗干凈后放入研缽中，加入液氮研磨成細沫。裝入 2 mL 離心管中（每管0.5 g），加CTAB+600 μL 2%PVP溶液，于65 ℃水浴30 min。其余步驟同SDS法。

1.2.5 磁珠法 取適量試驗材料，清洗干凈后放入研缽中，加入液氮研磨成細沫；裝入2 mL離心管中（每管0.5 g），加入600 μL快速裂解液（1 L配方：9.82 g KAC，18.61 g EDTA，477.65 g鹽酸胍，1.470 5 g 檸檬酸鈉，20 mL 2%TWEEN，pH值5.2），于65 ℃水浴10 min（每隔2～3 min搖晃1次）；于12 000 r/min離心5 min；吸取400 μL上清液于1.5 mL離心管中，分別加入400 μL DNA結(jié)合液［1 L配方：50 g 5%PEG 8000，4 mol/L異硫氰酸胍（GITC），0.5 mol/L NaCl］、400 μL異丙醇、20 μL磁珠懸浮液，充分振蕩；室溫下靜置5 min，將離心管置于磁力架上靜置1 min；將離心管在磁力架上固定好，倒去上清液，再加入400 μL 70%乙醇，充分振蕩、混勻后于室溫下靜置1 min，將離心管放回磁力架上，若離心管中的溶液還有青色，便重復(fù)上一步操作2～3次；將離心管倒置在吸水紙上風(fēng)干 10 min；加入150 μL ddH2O，充分振動后于65 ℃水浴3 min；將離心管放在磁力架中，靜置2 min；吸出上清液，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 檢測DNA擴增效果所用SSR引物及PCR反應(yīng)體系與電泳方法

1.3.1 SSR引物 為了檢測5種方法提取DNA的質(zhì)量，選取2對SSR引物，即RAD1-11（F：5′-ACCCATGAGATCGAGGAA-3′；R：5′-ATCGGACAAGCTAAGTGA-3′）和RAD2-6（F：5′-GGCATCTCCTTCCTTCTCC-3′；R：5′-GGTTGGGTACGGATGTGG-3′），用于下一步的PCR擴增。

1.3.2 PCR反應(yīng)體系和擴增程序 10 μL PCR反應(yīng)體系：2.0 μL DNA，1.5 μL引物，0.5 μL Taq酶，1 μL buffer，1 μL脫氧核糖核苷三磷酸（DNTPS），4 μL 水。擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。

1.3.3 制膠與電泳 稱取3 g瓊脂糖倒入錐形瓶中，加入100 mL TAE緩沖溶液［是由三羥甲基氨基甲烷（Tris base）、乙酸（acetic acid）和乙二胺四乙酸（EDTA）組成的緩沖液］，搖勻后放入微波爐中加熱至透明液體狀，加入2滴溴化乙錠（EB）染色劑，搖勻，倒入制膠板中，待膠板凝固后將其放置在水平電泳槽中，在第1個樣孔中加入8 μL Maker，按順序依次加入8 μL PCR擴增產(chǎn)物，倒入緩沖液，電壓設(shè)為150 V，電泳30 min后取出凝膠于成像儀中，拍照并記錄數(shù)據(jù)。

1.4 DNA質(zhì)量的測定方法

用BioDrop紫外分光光度計檢測樣品的DNA濃度和純度。當(dāng)樣品DNA的D260 nm/D280 nm為1.8～2.0時，表明已達到所要求的純度。當(dāng)樣品中含有蛋白質(zhì)或苯酚等雜質(zhì)時，D260 nm/D280 nm發(fā)生改變。若D260 nm/D280 nm<1.7，說明蛋白質(zhì)沒有去除干凈；若D260 nm/D280 nm>2.0，則表明RNA沒有除干凈或DNA已變性。

1.5 利用磁珠法所提取的DNA對高粱葉色性狀基因定位的方法

用紫葉高粱IS31557（父本）與綠葉高粱TX430（母本）雜交獲得F1代單株，再套袋自交獲得F2代群體，觀察性狀分離情況。采取F2代群體中的隱性性狀綠色植株葉片，用磁珠法快速提取DNA，參考高粱基因組設(shè)計49對SSR引物，并篩選出11對穩(wěn)定、清晰的多態(tài)性引物用于紫葉基因定位，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系和擴增程序同“1.3.2”節(jié)。對親本及隱性遺傳群體進行8%聚丙烯凝膠電泳，經(jīng)銀染顯色后，在膠片觀察燈上查看結(jié)果。

通過EMS誘變獲得高粱白條紋葉突變體植株，將白條紋葉突變體WSL10（母本）與綠葉高粱TX430（父本）雜交，獲得雜交種F1代，再自交得到F2代群體，觀察性狀分離情況。分別提取高質(zhì)量F2代分離群體中30株綠色植株和30株白條紋葉植株的DNA，進行BSA混合池基因組測序。采集F2代群體中全部表現(xiàn)為隱性性狀的白條紋葉植株的葉片，用磁珠法快速提取DNA。參考高粱基因組設(shè)計55對SSR引物，其中21對多態(tài)性良好并用于白條紋葉基因定位（表2）。PCR反應(yīng)體系和擴增程序同“1.3.2”節(jié)。用8%聚丙烯凝膠進行電泳，經(jīng)銀染顯色后，在膠片觀察燈上查看結(jié)果。

最后用Mapmaker計算遺傳距離，分別繪制高粱紫葉基因、白條紋葉基因遺傳的連鎖圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位和方法提取的DNA擴增結(jié)果

選取高粱嫩葉、老葉、根、莖、種子5種部位，通過SDS法、SDS+2%PVP法、CTAB法、CTAB+2%PVP法及磁珠法提取DNA，獲得的PCR擴增結(jié)果見圖1，其中A、B、C、D、E分別為嫩葉、老葉、根、莖、種子在SSR引物RAD1-11、RAD2-6、RAD2-6、RAD2-6、RAD1-11上的擴增結(jié)果。

從圖1-A可以看出，用嫩葉提取的DNA進行SSR擴增，5種方法均能提取出DNA，且PCR擴增條帶清晰，無拖帶現(xiàn)象。從圖1-B可以看出，用老葉提取的DNA進行PCR擴增得到的條帶以磁珠法的完整性最好、亮度清晰、均勻。從圖1-C可以看出，用根提取的DNA進行SSR擴增，以磁珠法最完好，其他方法的效果很差。從圖1-D可以看出，用高粱莖提取的DNA擴增均能成像但不夠清晰，以磁珠法表現(xiàn)較好。由圖1-E可以看出，用高粱種子提取的DNA進行SSR擴增，除磁珠法外，其他方法所得帶型的拖帶現(xiàn)象均較嚴重?？傊瑹o論材料取自哪種部位，磁珠法均可擴出清晰、明亮和完整的條帶。

2.2 不同方法和部位提取DNA的時間和質(zhì)量比較

本試驗結(jié)果表明，不管選取高粱哪種部位，SDS法、SDS+2%PVP法、CTAB法和CTAB+2%PVP法提取高粱組織DNA用時均需要2 h，而采用磁珠法提取DNA的用時僅為40 min，為其他方法的1/3，由此說明磁珠法極大縮短了DNA的提取時間。

更為重要的是，從DNA濃度（ng/μL）和D260 nm/D280 nm來看，5種不同方法提取的DNA質(zhì)量差異明顯（表3）。

從提取的DNA濃度和D260 nm/D280 nm來看，CTAB法提取高粱嫩葉的濃度最大，但D260 nm/D280 nm低于1.8，提取的DNA可能含有大量蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)；磁珠法提取高粱種子的DNA濃度最低，其D260 nm/D280 nm位于1.8～2.0之間，表明用該方法提取DNA中蛋白質(zhì)、酚類物質(zhì)和RNA的含量較低，DNA提取質(zhì)量較高。綜合分析發(fā)現(xiàn)，SDS法、SDS+2%PVP法、CTAB法和CTAB+2%PVP法提取高粱DNA的D260 nm/D280 nm均存在大于2.0或小于1.8的情況；用磁珠法提取高粱DNA的D260 nm/D280 nm均在1.8～2.0內(nèi)，說明用這一方法可從高粱任何組織部位提取到高質(zhì)量的DNA。

2.3 磁珠法提取DNA在高粱葉色性狀基因定位中的應(yīng)用

2.3.1 在高粱紫葉性狀基因定位中的應(yīng)用 通過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，紫葉高粱IS31557（父本）與綠葉高粱TX430（母本）F2代作圖群體中的紫葉與綠葉植株數(shù)[JP+1]符合3 ∶1的分離比，說明紫葉性狀為顯性遺傳，受1對等位基因控制。用磁珠法對高粱紫葉性狀F2代隱性遺傳植株進行DNA提取，PCR擴增結(jié)果的條帶清晰，父母本性狀分型明顯，表明DNA滿足SSR分子標(biāo)記法對基因定位的鑒定。利用已公布的高粱分子圖譜中的標(biāo)記對PL1基因進行連鎖分析，找出與其緊密連鎖的分子標(biāo)記，將基因PL1初步定位在4號染色體SSR標(biāo)記smr6228（62 280 555 bp）和smr6244（62 445 721 bp）之間，基因與兩側(cè)標(biāo)記的遺傳距離分別為1.8、4.0 cM（圖2）。

2.3.2 在高粱白條紋葉基因定位中的應(yīng)用 對白條紋葉突變體WSL10與綠葉高粱TX430雜交構(gòu)建的F2群體中不同葉色性狀植株進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)綠葉與白條紋葉植株數(shù)符合3 ∶1的分離比，說明白條紋葉性狀基因受1對隱性基因控制。通過BSA混合池基因組測序，將控制白條紋葉基因WSL10初步定位在10號染色體上。用篩選出的21對SSR標(biāo)記對F2代群體中的210株隱性白條紋葉性狀進行驗證，發(fā)現(xiàn)WSL10基因與Y5870標(biāo)記（58 706 511 bp）緊密連鎖，遺傳距離為1.0 cM（圖3）。

3 討論

3.1 高粱提取DNA的最優(yōu)方法

植物組織細胞壁比較復(fù)雜，在提取DNA的過程中，多酚、多糖等雜質(zhì)增加了提取難度，這就需要采取不同方法進行處理。王志龍等在提取滇池表層沉積物時發(fā)現(xiàn)，常規(guī)CTAB法、SDS法操作較為繁瑣，不能用于大量樣品的提取［23］。譚小艷等改良了4種CTAB法提取石榴葉片DNA，開展了幾種方法PCR擴增和瓊脂糖凝膠的驗證，在DNA質(zhì)量上有所提高，但其試驗步驟繁瑣，時間較長，且使用了三氯甲烷等有機溶劑，對人體有一定危害［24］；廖云蓉通過改良SDS法對銀杏不同器官進行DNA提取，但只適用于嫩葉，其他部位提取的DNA雜質(zhì)多、帶弱、濃度低，不能滿足基因組研究的要求［25］。王軍等在提取新城疫病毒DNA時發(fā)現(xiàn)，磁珠法的提取過程省去了大量離心步驟，有效地節(jié)省了試驗人員的時間，快速裂解液能代替有機溶劑，且成本低，無毒，安全可靠，不會在試驗中對操作人員產(chǎn)生危害［26］。然而，以往利用磁珠法提取DNA大多局限于植物葉片，缺乏對植物多種部位的研究，尤其是尚未見用磁珠法提取高粱基因組DNA的報道。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用SDS法、CTAB法提取高粱DNA時，若D260 nm/D280 nm小于1.8，加入2%PVP能夠有效去除提取物中的蛋白質(zhì)、酚類物質(zhì)，可以提高DNA質(zhì)量；但是當(dāng)D260 nm/D280 nm大于2.0時，加入2%PVP對提取高粱DNA質(zhì)量無影響。然而，磁珠法能夠在不加入2%PVP的情況下有效去除蛋白質(zhì)、多酚和RNA雜質(zhì)對提取DNA的干擾，并且可應(yīng)用于高粱的多個部位，所提取的DNA質(zhì)量優(yōu)于其他方法，并且在高粱葉色性狀基因定位上取得了理想的試驗結(jié)果。

3.2 高粱提取DNA的最佳部位

從PCR擴增效果來看，用嫩葉提取的DNA質(zhì)量最好，其次是老葉、種子和莖；由于根較硬，磨樣耗時耗力，提取的質(zhì)量、濃度較低，這也許是許多研究者采用葉片提取植物DNA的主要原因［24-25］。本研究發(fā)現(xiàn)，因提取方法不同，提取的DNA質(zhì)量差異較大。若選取嫩葉，采用SDS、CTAB法提取DNA，D260 nm/D280 nm低于1.8，表明DNA中蛋白質(zhì)、酚類物質(zhì)含量比較高；若選取老葉，無論采用哪種方法提取DNA，其D260 nm/D280 nm均在1.8～2.0之內(nèi)；若選取根，用SDS+2%PVP法的D260 nm/D280 nm低于1.8，可能由于提取的DNA中蛋白質(zhì)、酚類物質(zhì)含量較高；若選取莖，用CTAB法、CTAB+2%PVP法提取的DNA的D260 nm/D280 nm均大于2.0，可能由于RNA含量較高；若選取種子，用SDS法、SDS+2%PVP法、CTAB法提取的DNA的D260 nm/D280 nm均超過2.0，說明提取的DNA質(zhì)量較差。但是，如果采用磁珠法，無論選取哪種部位，D260 nm/D280 nm均在1.8～2.0之間，表明提取的DNA中蛋白質(zhì)、RNA的含量少，符合基因定位的純度要求。

3.3 高粱葉色基因定位的意義

葉色可用于分子標(biāo)記輔助育種以培育新品種，還可將葉色標(biāo)記與不育系相結(jié)合，根據(jù)葉色的明顯差異去除不育系的自交種子，從而保證雜種的純度，是解決雄性不育系不純的一條有效途徑［20］。本研究利用磁珠法分別提取了紫葉、白條紋葉群體的DNA進行遺傳分析及基因定位，最終將紫葉基因PL1定位到4號染色體上，將白條紋葉基因WSL10定位在10號染色體上。雖然本研究定位的紫葉基因PL1和白條紋葉基因WSL10只是初定位，下一步尚待開展精細定位，但是本研究結(jié)果驗證了磁珠法提取高質(zhì)量DNA的意義，而且對于高粱分子標(biāo)記輔助育種具有重要利用價值。

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收稿日期：2022-08-21

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31971993）；國家重點研發(fā)計劃（編號：2018YFD0300902）；安徽省支持科技創(chuàng)新有關(guān)政策兌現(xiàn)項目（編號：皖科資秘［2021］475號）；安徽省級學(xué)科建設(shè)重大項目（編號：皖教秘科［2014］28號）；安徽省教育廳高?？茖W(xué)研究項目（編號：KJ2020A0066）。

作者簡介：顏學(xué)慧（1996—），女，安徽天長人，碩士研究生，研究方向為飼料作物遺傳育種。E-mail：2139749277@qq.com。

通信作者：詹秋文，博士，教授，主要從事飼料作物遺傳育種方面的研究。E-mail：qwzhan@163.com。