林鶯 張榮東 陳仁利 陳琦

寧德師范學(xué)院附屬寧德市醫(yī)院血液科，寧德 352100

陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）是一種獲得性造血干細(xì)胞克隆缺陷性疾病。目前，關(guān)于PNH 克隆如何取得增殖優(yōu)勢(shì)的機(jī)制還不清楚，免疫機(jī)制、抗凋亡機(jī)制、二次基因突變或異常表達(dá)機(jī)制以及微環(huán)境改變均可在其中發(fā)揮重要作用［1-2］。Heeney等［3］發(fā)現(xiàn)一些抗凋亡基因在PNH 患者中有明顯的高表達(dá)，抗凋亡基因上調(diào)可能導(dǎo)致PNH 和相關(guān)疾病凋亡抵抗，這也提示了凋亡機(jī)制參與PNH 克隆的增殖。本研究主要探討Mcl-1 基因異常表達(dá)在PNH 克隆增殖中的抗凋亡作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

1.一般資料

選取2020年2月至2022年2月在寧德師范學(xué)院附屬寧德市醫(yī)院住院或門診就診的PNH患者13例，其中男7例，女6 例，中位年齡27（21，56）歲；對(duì)照組為同期健康體檢者15例，且經(jīng)PNH Flaer檢測(cè)未檢測(cè)出PNH 克隆，其中男8例，女7 例，中位年齡38（23，67）歲。病例組與對(duì)照組在性別、年齡等一般資料方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：既往確診或新診斷的PNH 患者，PNH 克隆陽性，無自身免疫性疾病病史、近期無感染史，PNH 診斷符合國內(nèi)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)［4］。排除標(biāo)準(zhǔn)：PNH 克隆陰性存在自身免疫性疾病或近期有嚴(yán)重感染者。

本研究通過寧德師范學(xué)院附屬寧德市醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審查編號(hào)：20200318），受試者均知情同意并簽署知情同意書。

2.主要試劑和儀器

藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的鼠抗人CD59 單抗、抗PE 的免疫磁珠、MS 分選柱均為美國Becton Dickinson 公司；Ficoll-Paque 分離液、磁珠緩沖液、凋亡試劑盒、Trizol RNA Reagent、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒等均購于美國Invitrogen 公司；FACS Calibur 流式細(xì)胞儀為美國Becton Dickinson 公司產(chǎn)品；PCR儀器為日本Takara公司。

3.實(shí)驗(yàn)步驟

（1）標(biāo)本的采集和處理：采集PNH患者及對(duì)照組的骨髓液10 ml，使用Ficoll-Paque 分離液提取骨髓中單個(gè)核細(xì)胞，并洗滌后重懸細(xì)胞。在PNH患者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞中先后加入抗CD59 抗體及抗PE 的免疫磁珠，用分選柱行磁珠分選細(xì)胞，得到CD59-細(xì)胞及CD59+細(xì)胞。使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)磁珠分選后CD59-及CD59+比例，其中CD59-細(xì)胞純度達(dá)96% 以上。（2）CD59-細(xì)胞的培養(yǎng)和處理：將分選出的CD59-細(xì)胞用培養(yǎng)基定容并計(jì)數(shù)細(xì)胞，并將細(xì)胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。將PNH 患者CD59-細(xì)胞接種于6 孔板，每孔2×105細(xì)胞，并用lipofectamin2000 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分為3 組，分別為轉(zhuǎn)染Mcl-1 siRNA 組（siRNA-Mcl-1 轉(zhuǎn)染組）、轉(zhuǎn)染無義序列組（siRNA-scr 轉(zhuǎn)染組）和空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染后檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖、凋亡及細(xì)胞周期分布等生物學(xué)變化。（3）RT-PCR 檢測(cè)各組細(xì)胞Mcl-1 基因mRNA 的表達(dá)：各組細(xì)胞分別提取總RNA，然后進(jìn)行RNA 純度測(cè)定，同時(shí)使用紫外分光光度計(jì)測(cè)OD260∕280的比值，要求吸光度OD260∕280>1.8，然后進(jìn)行RNA 逆轉(zhuǎn)錄，獲得各組的cDNA，行PCR 擴(kuò)增檢測(cè)，各引物由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，并按比例配制反應(yīng)體系，最后計(jì)算機(jī)分析獲得樣本及內(nèi)參的Ct值后行數(shù)據(jù)處理。（4）MTS法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況：收集各組細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于96 孔板中，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)終止前3 h 加入20 μl MTS，3 h 后，振蕩器振蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm 檢測(cè)OD 值。（5）檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，收集各組細(xì)胞，調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞密度為1×106∕ml，用流式細(xì)胞儀以AnnexinV∕PI 雙染法檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。（6）流式檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況：轉(zhuǎn)染培養(yǎng)后，收集各組的CD59-細(xì)胞，用PBS 洗滌并重懸細(xì)胞，按照操作說明，依次加入ABC 液，過濾后收集濾液上機(jī)檢測(cè)。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用Fisher確切概率法，P<0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.患者特征（表1）

表1 13例陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥患者的基本臨床特征

13 例PNH 患者中表現(xiàn)為骨髓衰竭型患者4 例、經(jīng)典型PNH 患者9 例，兩者在性別、年齡、CD59-、CD55-、網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對(duì)值（Ret）方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)值意義（均P>0.05）。

2.PNH 患者CD59-細(xì)胞Mcl-1 基因mRNA 的表達(dá)量（圖1）

圖1 使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)13例陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥患者標(biāo)本磁珠分選后CD59-（A）、CD59+（B）比例

使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PNH 患者標(biāo)本磁珠分選后CD59-及CD59+比例，其中CD59-細(xì)胞純度達(dá)96%以上；PNH患者CD59-細(xì)胞組、CD59+細(xì)胞組、對(duì)照組的Mcl-1基因mRNA的表達(dá)量分別為（2.48±0.25）、（1.61±0.19）、（1.21±0.08），CD59-細(xì)胞組均高于CD59+細(xì)胞組及對(duì)照組（P=0.031、0.022），而CD59+細(xì)胞組和對(duì)照組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.126）；同時(shí)，PNH 患者M(jìn)cl-1 基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量與CD59-克隆細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)（r2=0.523，P=0.012）。

3.沉默Mcl-1基因效果的驗(yàn)證

PNH 患者CD59-細(xì)胞轉(zhuǎn)染靶向siRNA-Mcl-1 后，Mcl-1 mRNA 表達(dá)水平下降，siRNA-Mcl-1 轉(zhuǎn)染組Mcl-1 mRNA 表達(dá)量為（1.05±0.07），低于siRNA-scr 轉(zhuǎn)染組的（1.87±0.21）和空白對(duì)照組的（1.49±0.11），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.038、0.046）。

4.細(xì)胞增殖率檢測(cè)（圖2）

圖2 siRNA-Mcl-1轉(zhuǎn)染后13例陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥患者CD59-細(xì)胞各組不同時(shí)間點(diǎn)的增殖情況

MTS 法檢測(cè)siRNA-Mcl-1 轉(zhuǎn)染前后PNH 患者CD59-細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果提示Mcl-1基因沉默后CD59-細(xì)胞增殖率明顯下降，同時(shí)隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長，其細(xì)胞增殖率進(jìn)一步下降。

5.細(xì)胞凋亡率檢測(cè)（圖3）

圖3 siRNA-Mcl-1轉(zhuǎn)染后13例陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥患者CD59-細(xì)胞各組不同時(shí)間點(diǎn)的凋亡率情況

流式檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率情況，siRNA-Mcl-1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率高于siRNA-scr 轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組［（43.12±16.33）%比（24.07±15.42）%、（21.56±14.85）%］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），提示Mcl-1基因可能有抗凋亡作用。

6.細(xì)胞周期分布情況

流式檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況，siRNA-Mcl-1轉(zhuǎn)染組G0∕G1期細(xì)胞比例高于siRNA-scr轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組［（93.16±3.06）%比（91.52±4.01）%、（90.78±3.62）%］，而S 期細(xì)胞比例低于siRNA-scr 轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組［（4.96±3.21）%比（6.86±3.87）%、（7.05±3.59）%］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。這提示減低Mcl-1 基因后，G0∕G1期細(xì)胞比例增加，S 期細(xì)胞比例減低，表明了細(xì)胞周期向G0∕G1期移動(dòng)，細(xì)胞的增殖能力下降。

討論

目前，關(guān)于PNH克隆如何獲得增殖優(yōu)勢(shì)尚未形成共識(shí)，我們既往的研究提示，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的免疫抑制作用在PNH 患者中增強(qiáng)，可能在PNH 異常克隆中起了逃避免疫監(jiān)視的作用［5］。Horikawa 等［6］和Brodsky［7］分別報(bào)道了PNH 患者的異常血細(xì)胞有抵抗凋亡的能力，現(xiàn)多項(xiàng)研究已表明單獨(dú)的PIG-A 基因突變并不能引起異?？寺?duì)凋亡的抵抗，PNH 克隆在體內(nèi)獲得生存及增殖優(yōu)勢(shì)可能與其他因素有關(guān)［8-12］。凋亡機(jī)制在PNH 克隆增殖中的作用是PNH 發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)。有研究指出，凋亡的減少是由于GPI 陰性細(xì)胞持續(xù)存在及占據(jù)優(yōu)勢(shì)所致，如果突變的PNH 細(xì)胞能夠抵抗凋亡，那么易使其獲得克隆優(yōu)勢(shì)［13-15］。Heeney 等［3］發(fā)現(xiàn)一些抗凋亡基因（Mcl-1、human A1、Hhr23B、RhoA）在PNH 患者有明顯的高表達(dá)，且其外周血中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中又發(fā)現(xiàn)了抗凋亡基因過度表達(dá)。抗凋亡基因上調(diào)可能導(dǎo)致PNH 和相關(guān)疾病凋亡抵抗，這也提示了凋亡機(jī)制參與PNH克隆的增殖。

Mcl-1 基因作為Bcl-2 家族的一個(gè)抗凋亡成員，是在研究人ML-1 髓白血病細(xì)胞系用佛波酯誘導(dǎo)后，沿單核∕巨噬細(xì)胞途徑分化過程中，作為早期誘導(dǎo)基因被首次發(fā)現(xiàn)的，其表達(dá)與調(diào)節(jié)異常與許多疾病有關(guān)［16-18］。相關(guān)研究顯示，通過反義寡核苷酸技術(shù)或小分子干擾RNA 抑制Mcl-1基因的表達(dá)，可引起表達(dá)Mcl-1 的腫瘤細(xì)胞的凋亡［19-21］。另外，阻斷調(diào)節(jié)Mcl-1 基因表達(dá)的信號(hào)途徑也能有效地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［22-23］，表明Mcl-1 的過表達(dá)可以促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞生存。Heeney 等［3］發(fā)現(xiàn)Mcl-1 在PNH 患者有顯著的高表達(dá)，但目前，沒有關(guān)于應(yīng)用siRNA 抑制PNH 患者M(jìn)cl-1 表達(dá)的研究。本研究探討Mcl-1 基因表達(dá)是否降低PNH 克隆的凋亡率，發(fā)現(xiàn)同一PNH 患者CD59-細(xì)胞的Mcl-1 mRNA 的表達(dá)量明顯高于CD59+細(xì)胞和對(duì)照組，且Mcl-1 mRNA 的表達(dá)量與CD59-細(xì)胞克隆數(shù)呈正相關(guān)，表明Mcl-1基因在PNH 的克隆擴(kuò)增中可能起促進(jìn)作用。本研究中利用siRNA 干擾技術(shù)減低Mcl-1 基因的表達(dá)后，PNH 患者CD59-細(xì)胞的增殖率下降，凋亡率增加，同時(shí)，細(xì)胞周期分布提示其向G0∕G1期推進(jìn)，細(xì)胞增殖力下降，進(jìn)一步表明了Mcl-1 基因促進(jìn)CD59-細(xì)胞的增殖，與既往研究發(fā)現(xiàn)抗凋亡基因在PNH 患者體內(nèi)存在高表達(dá)是一致的。

研究表明，PNH 克隆逃逸凋亡可能致增殖優(yōu)勢(shì)，Mcl-1 基因的過表達(dá)可能在PNH 克隆抗凋亡中起作用，但本研究例數(shù)偏少，研究結(jié)論還需要加大病例數(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突