李 暢, 張?jiān)埔? 樊 陽, 孫 瑩, 尹紫良,林宜萌, 葛菁萍, 平文祥

(1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心, 哈爾濱 150500;2.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省普通高等學(xué)校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 哈爾濱 150080)

0 引 言

化石能源的使用帶動了全球經(jīng)濟(jì)的快速進(jìn)步與發(fā)展。自工業(yè)革命開始,全球化石能源的消耗一直處于加劇上升狀態(tài)。美國能源信息管理局預(yù)測,這種消耗狀態(tài)至少還要持續(xù)20年[1]。化石能源的加劇消耗在推動社會進(jìn)步、改善人們生活水平的同時,也導(dǎo)致了氣候變暖[2]和化石能源危機(jī)[3]等問題。因此,大力發(fā)掘清潔環(huán)保、可再生的化石能源替代品,對于滿足國家清潔能源和可持續(xù)發(fā)展的需求及解決因化石能源大量使用導(dǎo)致的諸多問題具有重要意義。

微藻是一類光學(xué)顯微鏡下可見、個體微小、種類繁多、營養(yǎng)價值豐富、分布廣泛、單細(xì)胞或簡單多細(xì)胞、真核或原核的水生生物[4-7]。微藻經(jīng)代謝可以在體內(nèi)累積中性脂肪三酰甘油(Triacylglycerol, TAG),它是生產(chǎn)生物質(zhì)燃料生物柴油的主要原料。生物柴油是當(dāng)前公認(rèn)的可以替代化石能源的清潔能源,利用微藻生產(chǎn)生物柴油具有以下三大優(yōu)勢:(1)微藻環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng),在淡水、海水甚至污水中都可生長,不與糧食作物競爭土地,且在一定程度上有助于污水的回收利用與凈化處理并減少糧食危機(jī)發(fā)生的概率[8-12];(2)微藻的光合速率高、繁殖速度快、生長周期短、單位面積生物量產(chǎn)量高[13-14];(3)微藻具有較高的含油量及產(chǎn)油量,其含油量及產(chǎn)油量可分別高達(dá)傳統(tǒng)產(chǎn)油作物的10倍和103倍[15]。因此,目前科研工作者致力于利用微藻高產(chǎn)生物柴油的研究,以滿足國家清潔能源和可持續(xù)發(fā)展的要求。

微藻在培養(yǎng)和純化過程中容易染菌,針對微藻容易染菌的問題,研究人員通常采用物理及化學(xué)方法對微藻進(jìn)行無菌化處理,以獲得微藻純藻株。不同的無菌化處理方法有其各自不同的特點(diǎn),物理無菌化處理方法操作復(fù)雜、工作量大,且僅可除去微藻培養(yǎng)環(huán)境中的雜菌,而對微藻體內(nèi)共生雜菌的去除效果較差;化學(xué)無菌化處理方法操作方便、技術(shù)簡單,且能夠同時抑制微藻體內(nèi)及培養(yǎng)環(huán)境中的雜菌生長[16-17],對于微藻的無菌化處理更徹底,因此得到研究人員的普遍認(rèn)可。本文分別采用液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩種不同的手段,觀察單針藻4M-18對卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素和青霉素4種抗生素的敏感性,為單針藻4M-18利用抗生素法進(jìn)行無菌化處理提供了參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1供試藻株

單針藻4M-18由黑龍江大學(xué)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要培養(yǎng)基

BG11培養(yǎng)基[18]用于單針藻4M-18種子液的擴(kuò)大培養(yǎng);TAP含氮培養(yǎng)基[19]用于藻株的混合培養(yǎng)。在相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中加入2.0%～2.5%的瓊脂,用于藻株的固體平板培養(yǎng)。

1.1.3主要試劑

冰乙酸購于天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;瓊脂粉、卡那霉素、四環(huán)素、青霉素和氯霉素購于上海索萊寶生物科技有限公司;草酸銨、石碳酸、結(jié)晶紫、復(fù)紅和碘化鉀購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1藻株的培養(yǎng)

利用光照搖床和人工氣候箱,采用混合培養(yǎng)和自養(yǎng)培養(yǎng)兩種方式對藻株進(jìn)行培養(yǎng)。除特別說明外,藻株的培養(yǎng)均按以下方式進(jìn)行:光照搖床的培養(yǎng)條件設(shè)定為:轉(zhuǎn)速100 r·min-1、溫度25 ℃、光照強(qiáng)度3 000 lux,每天下午4點(diǎn)開搖床(開光照和轉(zhuǎn)速按鈕),次日早8點(diǎn)關(guān)搖床(關(guān)光照和轉(zhuǎn)速按鈕);人工氣候箱的培養(yǎng)條件設(shè)定為:培養(yǎng)溫度25 ℃、光照強(qiáng)度3 000 lux、光暗周期比12 h ∶12 h。

1.2.2單針藻4M-18種子液的培養(yǎng)

取單針藻4M-18藻液,按照10%的量接種于BG11自養(yǎng)培養(yǎng)基中,最終裝液量為200 mL/500 mL(三角瓶),于光照搖床中培養(yǎng)至穩(wěn)定期(20～22 d),即得種子液。

1.2.3利用TAP含氮培養(yǎng)基培養(yǎng)藻株

取自養(yǎng)培養(yǎng)的單針藻4M-18種子液,按照終止OD680 nm= 0.3接于TAP含氮培養(yǎng)基中,并接入適宜體積的抗生素母液,TAP含氮培養(yǎng)基最終裝液量為250 mL/500 mL(三角瓶),于光照搖床中培養(yǎng)至穩(wěn)定期。

1.2.4單針藻4M-18在液體培養(yǎng)基中的抗生素敏感性試驗(yàn)

取自養(yǎng)培養(yǎng)至穩(wěn)定期的單針藻4M-18種子液,按照10%的比例接種于TAP含氮培養(yǎng)基中,最終裝液量為100 mL/250 mL(三角瓶),按表1所示的抗生素濃度分別加入適宜體積的抗生素母液后,于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天固定時間早晚各搖晃藻液一次,避免藻細(xì)胞沉底影響其生長;同時,每天早8點(diǎn)取樣測定藻細(xì)胞密度,觀察藻細(xì)胞生長情況。每個濃度抗生素均設(shè)置3個平行試驗(yàn),以降低試驗(yàn)誤差?？股貪舛忍荻鹊恼{(diào)整方法為:在最終裝液量為100 mL/250 mL(三角瓶)的單針藻4M-18培養(yǎng)液中,分別加入濃度為100 mg·mL-1的青霉素母液0、 50、 100、 150、 200和250 μL,調(diào)整培養(yǎng)液中青霉素終濃度分別為0、 50、 100、 150、 200和 250 mg·mL-1。以上為青霉素濃度梯度的調(diào)整方法,其他抗生素與之相同。

表1 不同種類抗生素的濃度梯度設(shè)定

1.2.5單針藻4M-18在固體培養(yǎng)基中的抗生素敏感性試驗(yàn)

取自養(yǎng)培養(yǎng)至穩(wěn)定期的單針藻4M-18種子液,利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算藻細(xì)胞密度,以確定藻液的稀釋倍數(shù)。利用無菌0.9%NaCl溶液稀釋藻液,取稀釋好的藻液100～200 μL均勻涂布于含有不同濃度抗生素(0、100、150和200 mg·L-1)的TAP含氮培養(yǎng)基的固體平板上(保證每個平板上200～300個藻落即可),于人工氣候箱中培養(yǎng)15 d后,觀察不同濃度抗生素在平板上對雜菌的抑制作用及對單針藻4M-18生長的影響。每個濃度抗生素均設(shè)置3個平行試驗(yàn),以減小試驗(yàn)誤差。固體培養(yǎng)基中抗生素的選擇及濃度梯度設(shè)定如表2所示。

表2 不同濃度青霉素處理15 d后單針藻4M-18的生長情況

2 結(jié)果與討論

2.1 單針藻4M-18的雜菌污染情況

在利用TAP含氮培養(yǎng)基培養(yǎng)單針藻4M-18的過程中,發(fā)現(xiàn)藻液極易受雜菌污染,通過革蘭氏染色及鏡檢發(fā)現(xiàn),藻液所染雜菌主要為革蘭氏陽性球菌及革蘭氏陽性桿菌,如圖1所示。

注： 圓圈內(nèi)為藻液中的革蘭氏陽性球菌; 三角形內(nèi)為藻液中的革蘭氏陽性桿菌; 長方形內(nèi)為單針藻4M-18細(xì)胞。

2.2 單針藻4M-18在液體培養(yǎng)基中的抗生素敏感性試驗(yàn)

根據(jù)不同抗生素抗菌譜范圍的不同,選擇卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素和青霉素4種抗生素,在液體培養(yǎng)基中對單針藻4M-18進(jìn)行了抗生素敏感性試驗(yàn)。

2.2.1卡那霉素對單針藻4M-18生長的影響

卡那霉素是一種氨基糖苷類抗生素,對大多數(shù)革蘭氏陰性菌具有強(qiáng)大的抑制作用。圖2為卡那霉素對單針藻4M-18生長的影響結(jié)果,由圖可知,20 mg·L-1卡那霉素處理后的單針藻4M-18細(xì)胞在培養(yǎng)0～4 d時處于延滯期,4～6 d時處于急劇生長期,且藻細(xì)胞密度在6 d時與對照組持平。由于經(jīng)20 mg·L-1卡那霉素處理后的單針藻4M-18細(xì)胞生長延滯期過長,因此不選擇卡那霉素作為最優(yōu)抗生素。余旭亞等利用卡那霉素在液體培養(yǎng)基中對單針藻FXY-10進(jìn)行抗生素敏感試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)25～200 mg·L-1卡那霉素均可顯著抑制藻細(xì)胞的生長[20],本試驗(yàn)結(jié)果與其一致。

圖2 卡那霉素對單針藻4M-18生長的影響

2.2.2四環(huán)素對單針藻4M-18生長的影響

四環(huán)素是一種能防治革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌引發(fā)的疾病、維持人體健康的一類抗生素[21]。圖3為四環(huán)素對單針藻4M-18生長的影響,由圖可知,不同濃度的四環(huán)素對單針藻4M-18生長均有不同程度的抑制作用。當(dāng)四環(huán)素濃度為10 mg·L-1時,微藻有生長的現(xiàn)象,但與未添加抗生素組相比,生長相對緩慢,而其他四環(huán)素濃度下的微藻基本不生長。張茜等研究發(fā)現(xiàn),在液體培養(yǎng)基中的低濃度四環(huán)素(10 mg·L-1)可抑制富油新綠藻(Neochlorisoleoabundans)的生長[22],本試驗(yàn)結(jié)果與其相似。

圖3 四環(huán)素對單針藻4M-18生長的影響

2.2.3氯霉素對單針藻4M-18生長的影響

氯霉素是從委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomycesvenezuela)中分離提取的廣譜抗生素,對許多需氧革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌以及厭氧的菌質(zhì)體都有抑制作用[23]。圖4為氯霉素對單針藻4M-18生長的影響結(jié)果,從圖中可以看出,當(dāng)氯霉素濃度為10 mg·L-1時,單針藻4M-18藻株生長緩慢;在抗生素濃度高于10 mg·L-1時,藻株幾乎不再生長,受到明顯的抑制。這與余旭亞等研究發(fā)現(xiàn)10～200 mg·L-1氯霉素可抑制藻細(xì)胞生長的結(jié)果[23]一致。

圖4 氯霉素對單針藻4M-18生長的影響

2.2.4青霉素對單針藻4M-18生長的影響

青霉素通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁四肽側(cè)鏈和五肽交連橋的結(jié)合,阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁合成,從而發(fā)揮殺菌作用[24]。圖5為青霉素對單針藻4M-18生長的影響結(jié)果,由圖可知,當(dāng)青霉素濃度為50和150 mg·L-1時,藻細(xì)胞呈現(xiàn)S型增長,且在培養(yǎng)周期5～6 d的藻細(xì)胞密度高于對照組。由圖6可知,150 mg·L-1青霉素能夠有效抑制雜菌生長,且經(jīng)兩種濃度青霉素(50和150 mg·L-1)處理后的單針藻4M-18藻液,藻細(xì)胞形態(tài)無明顯變化,均呈現(xiàn)彎曲的月牙型,表明濃度為150 mg·L-1的青霉素對單針藻4M-18的細(xì)胞形態(tài)無影響。有文獻(xiàn)報道,青霉素可以廣泛應(yīng)用于微藻的無菌化處理,其能夠有效抑制微藻共生雜菌的生長,但對微藻的生長抑制不明顯,一定濃度的青霉素還可促進(jìn)微藻細(xì)胞的生長[24],這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。劉曉娟等研究發(fā)現(xiàn),在液體培養(yǎng)基中添加50 mg·L-1青霉素,對眼點(diǎn)擬微綠球藻(Nannochloropsisocutala)的生長無明顯影響,且在添加青霉素2 d后,培養(yǎng)液中的共生雜菌數(shù)目有所減少[25];李靜紅等研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)培養(yǎng)液中的青霉素終濃度為1.5 g·L-1時,波吉卵囊藻(Oocystisborgei)的生長才被抑制[26]。本試驗(yàn)結(jié)果與劉曉娟和李靜紅等的研究結(jié)果有一定差異,可能是由于不同藻株之間存在種屬差異性和特異性。因此,在液體培養(yǎng)基中可選擇添加150 mg·L-1青霉素作為單針藻無菌體系建立的備選抗生素。

圖5 青霉素對單針藻4M-18生長的影響

圖6 不同濃度青霉素處理7 d后單針藻4M-18的染菌情況(400×):(a) 0 mg·L-1 ; (b) 50 mg·L-1;(c) 150 mg·L-1

2.3 單針藻4M-18在固體平板上的抗生素敏感性試驗(yàn)

藻株在固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中對抗生素的耐受濃度是不同的[27],而且固體平板培養(yǎng)法可以直觀地反映微藻在不同濃度抗生素的固體培養(yǎng)基中能否生長存活,方法簡便[20]。以TAP含氮液體培養(yǎng)基中添加的抗生素種類和濃度為基礎(chǔ),進(jìn)一步在固體平板上確定單針藻4M-18所耐受的抗生素濃度。在固體平板上,不同濃度青霉素對單針藻4M-18藻落生長和藻落形態(tài)的影響及對雜菌的抑制情況如表2和圖7所示。

圖7 不同濃度青霉素處理15 d后單針藻4M-18的生長、形態(tài)和染菌情況: (a) 0 mg·L-1;(b) 100 mg·L-1; (c) 150 mg·L-1;(d) 200 mg·L-1

在固體平板上,100 mg·L-1青霉素對單針藻4M-18的生長無顯著影響,同時未見其他雜菌生長。與對照組相比,藻落形態(tài)無明顯變化,均表現(xiàn)為大而飽滿有光澤,該結(jié)果與張茜等報道的“同一種藻在固體和液體培養(yǎng)基中對同一種抗生素敏感度不同”的結(jié)論[22]相似。因此,在固體平板上可選擇添加100 mg·L-1青霉素作為單針藻無菌體系建立的備選抗生素。綜上所述,由于不同藻株之間存在種屬特異性及差異性,在利用抗生素抑菌法對藻株進(jìn)行無菌化處理時, 應(yīng)根據(jù)藻株的性質(zhì)來選擇適宜種類及濃度的抗生素。

3 結(jié) 論

以實(shí)驗(yàn)室保存的單針藻4M-18為出發(fā)藻株,利用4種抗生素對單針藻4M-18進(jìn)行敏感性試驗(yàn),最終選用青霉素對單針藻4M-18進(jìn)行無菌化處理。在液體和固體培養(yǎng)基中,150和100 mg·L-1青霉素能夠有效抑制單針藻4M-18共生雜菌的生長,同時對藻細(xì)胞(藻落)生長及形態(tài)無顯著影響。