薛 嬌, 于 洋, 張彥龍, 雷 虹, 曾偉民

(1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心, 哈爾濱 150500; 2.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 哈爾濱 150080)

0 引 言

黑木耳屬于真菌界,擔(dān)子菌亞門(mén),層菌綱,木耳目,木耳科,木耳屬[1]。黑木耳口感脆嫩,味道鮮美可口,我國(guó)對(duì)其的食用已有上千年的歷史。黑木耳子實(shí)體營(yíng)養(yǎng)豐富,其多糖具有降血脂、抗血栓和抗腫瘤等作用[2],黑色素能夠明顯改善四氯化碳造成的急性肝損傷,多酚類和黃酮類物質(zhì)具有抗氧化和清除自由基等功能。黑木耳在我國(guó)種植廣泛,在云南、貴州、新疆、華北、內(nèi)蒙古、西藏及東北地區(qū)均有分布。西藏黑木耳由于生長(zhǎng)位置海拔較高和紫外線輻射較強(qiáng)的獨(dú)特地理?xiàng)l件而具有抗逆性強(qiáng)、耐低溫、生長(zhǎng)周期短和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的優(yōu)點(diǎn)[3]。

轉(zhuǎn)錄組在廣義上是指整個(gè)細(xì)胞在某一特定條件或狀態(tài)下所轉(zhuǎn)錄出的編碼RNA和非編碼RNA的總和,轉(zhuǎn)錄組學(xué)是在整體水平上研究生物個(gè)體所轉(zhuǎn)錄出RNA的差異情況[4]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是通過(guò)將RNA進(jìn)行測(cè)序,獲得表達(dá)差異基因,注釋到各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)從而進(jìn)行分析。目前,用于轉(zhuǎn)錄組研究的主要有SAGE基因表達(dá)序列分析技術(shù)、大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)和基因芯片技術(shù)[5]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)并不局限于對(duì)已知轉(zhuǎn)錄本信息的樣品進(jìn)行檢測(cè),還可以利用高通量測(cè)序?qū)o(wú)參考序列信息的樣品進(jìn)行檢測(cè)。近年來(lái)隨著測(cè)序成本的降低和其靈敏度高、檢測(cè)范圍廣和重復(fù)性好的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用到各個(gè)領(lǐng)域。王思雨等對(duì)成菇期和變色期雞腿菇子實(shí)體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)變色期DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯能力下降,這可能與雞腿菇自溶現(xiàn)象有關(guān)[6]。劉璐等通過(guò)對(duì)羊肚菌正常菌絲和退化菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,篩選出一些差異表達(dá)基因,注釋后得出羊肚菌菌絲退化與代謝過(guò)程有關(guān),為后續(xù)解決菌絲退化問(wèn)題提供參考[7]。趙震宇等通過(guò)對(duì)不同濃度單寧處理過(guò)的玉木耳菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,得到2 012個(gè)差異基因,為進(jìn)一步研究單寧對(duì)玉木耳菌絲的影響機(jī)制提供參考[8]。本試驗(yàn)采用課題組分離選育出的西藏黑木耳高產(chǎn)菌種,對(duì)其子實(shí)體3個(gè)不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析研究。對(duì)黑木耳子實(shí)體的unigene使用生物信息學(xué)分析工具,進(jìn)行功能注釋和分析。該研究為下一步篩選和挖掘有關(guān)黑木耳子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育的功能基因提供重要數(shù)據(jù)參考,以及為黑木耳品種改良提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1供試菌株

西藏黑木耳高產(chǎn)菌種(專利號(hào):ZL 2013 1 0278146.8)由本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)比選育分離得到,命名為西藏6號(hào)[3]。

1.1.2樣品的采集

黑木耳子實(shí)體采摘自黑龍江省勃利縣黑木耳種植基地,在黑木耳子實(shí)體生長(zhǎng)的三個(gè)發(fā)育階段(幼耳期、旺盛期和成熟期),采取無(wú)雜菌、無(wú)污染、品質(zhì)優(yōu)良的黑木耳置于放有冰袋的泡沫盒中,立即運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室,轉(zhuǎn)移至凍存管后,使用液氮將樣品速凍0.5 h,置于-80 ℃超低溫冰箱中用于RNA提取,委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。

1.1.3儀器

DU530紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)Beckman公司);DYY-12電泳儀(北京六一生物科技有限公司);DYCZ-24DN水平電泳槽(北京六一生物科技有限公司);Agilent 2100生物芯片分析系統(tǒng)(美國(guó)Agilent科技有限公司);Illumina NovaSeq 6000測(cè)序系統(tǒng)(美國(guó)Illumina公司);Elite超低溫冰箱(美國(guó)Revco公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1總RNA樣品提取

分別在西藏6號(hào)黑木耳幼耳期、旺盛期和成熟期取樣,每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),共9個(gè)樣品。每個(gè)樣品取50 mg,分別加入250 μL NucleoZOL裂解細(xì)胞組織,再加入200 μL RNase-free的水沉淀污染物,分別用250 μL異丙醇和250 μL 75%乙醇沉淀和洗滌RNA。用NanoDrop[9]檢測(cè)RNA吸收峰是否正常,利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取到的待測(cè)樣品RNA進(jìn)行檢測(cè),使用Agilent 2100[10]精確檢測(cè)RNA的RIN值、28S/18S和5S峰。所有指標(biāo)均需符合測(cè)序的質(zhì)量要求。

1.2.2RNA測(cè)序

提取后的RNA為總RNA,需要對(duì)其中的mRNA進(jìn)行富集。將堿基末端帶有T的磁珠與測(cè)序RNA 3′末端的ployA結(jié)合,加入buffer將富集后的mRNA打成短片段。以mRNA為模板,加入六堿基隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶,合成單鏈cDNA,再加入dDNTPs、DNA聚合酶和緩沖液合成第二條鏈,最后加A尾,PCR擴(kuò)增15個(gè)循環(huán),對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序[11]。RNA測(cè)序服務(wù)由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供。

1.2.3轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)處理

測(cè)量后的數(shù)據(jù)中包含測(cè)序接頭序列、不確定堿基信息N率較高的序列、一些低質(zhì)量的讀段片段和一些影響分析的長(zhǎng)度過(guò)短的片段,這些因素都會(huì)影響后續(xù)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)于需要去除接頭序列,并且序列中含有質(zhì)量小于10的堿基的reads,整條序列都需要剔除。為了得到高質(zhì)量的有效讀數(shù)片段,需要剔除不確定堿基信息N率大于10%的片段和修剪后片段長(zhǎng)度小于30 bp的序列。本研究無(wú)參考基因組,利用Trinity[12](https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq)將所有質(zhì)量控制后的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝,組裝后利用TransRate[13](http://hibberdlab.com/transrate/)和CD-HIT[14](http://weizhongli-lab.org/cd-hit/)對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化過(guò)濾,利用BUSCO[15](Benchmarking universal single-copy orthologs, http://busco.ezlab.org)對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行評(píng)估,評(píng)估基因組或轉(zhuǎn)錄組的組裝完整性。取測(cè)序數(shù)據(jù)最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本作為unigene進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.4差異表達(dá)基因篩選

使用DESeq2軟件[16]對(duì)Unigene進(jìn)行分析,以篩選差異表達(dá)基因,FDR<0.05的基因?yàn)轱@著差異基因。

1.2.5Unigene功能注釋

將所有的Unigene與六大數(shù)據(jù)庫(kù)(GO、KEGG、COG、Nr、Swiss-Prot和Pfam)進(jìn)行比對(duì),獲得Unigene和Transcript的注釋情況,并對(duì)各注釋信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6GO和KEGG功能富集分析

利用Goatools軟件[17](https://github.com/tanghaibao/GOatools)和R語(yǔ)言編寫(xiě)腳本對(duì)基因集中的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO和KEGG通路富集均默認(rèn),P值(Pvalue_corrected)<0.05時(shí),GO和KEGG通路存在顯著富集情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

黑木耳子實(shí)體轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)如表1所示。由表1可以看出,從西藏黑木耳的9個(gè)樣品中共獲得51 482 040～77 672 734條統(tǒng)計(jì)過(guò)濾后測(cè)序數(shù)據(jù),Clean bases為7 685 784 278～11 565 940 347 G。樣品測(cè)序的Q20含量超過(guò)98%,GC含量為60.54%～61.48%,Q30堿基含量均不小于94.84%。根據(jù)結(jié)果對(duì)比統(tǒng)計(jì)得出,各樣品的Reads測(cè)序錯(cuò)誤率為0.023 9～0.024 3。熊宇晴等對(duì)無(wú)患子葉片進(jìn)行高通量測(cè)序后,得出數(shù)據(jù)質(zhì)量情況,GC占總堿基數(shù)的42.73%,Q20和Q30含量分別為97.79%和94.00%,符合下一步的組裝要求[18]。從西藏6號(hào)黑木耳質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)結(jié)果得出,樣品測(cè)序結(jié)果較好,符合轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行組裝和注釋的要求。

表1 質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)表

2.2 轉(zhuǎn)錄組從頭組裝結(jié)果

對(duì)Transcript有效讀取片段進(jìn)行組裝拼接,去掉其中冗雜多余的片段,共生成28 817個(gè)Transcript(表2),組裝得到的所有Transcript堿基為36 006 442個(gè),平均長(zhǎng)度為1 249.49 bp。Unigene共有13 765個(gè),將所有的Unigene組裝得到的堿基為15 530 526個(gè),平均長(zhǎng)度為1 128.3 bp。西藏6號(hào)黑木耳Unigene的N50數(shù)值為1 954。在物種差異、拼接算法和測(cè)序平臺(tái)都正確的前提下,N50數(shù)值能夠作為評(píng)估序列測(cè)度的重要參數(shù),反映拼接所得序列的完整程度。E90N50長(zhǎng)度分別為2 891和2 640。所有樣本質(zhì)控后的有效數(shù)據(jù)合并后與組裝Unigene/Transcript進(jìn)行比較,獲得的mapped率分別為59.606%和66.171%?？倝A基數(shù)量中的58.19%和58.91%是GC堿基。李方東利用BUSCO對(duì)茶樹(shù)中直系同源單拷貝基因完整性進(jìn)行考察,以評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)錄本組裝的準(zhǔn)確性和完整性,相似性評(píng)分越高,組裝結(jié)果越好[19]。用BUSCO評(píng)估Unigene和Transcript,得分分別為83.5%和90.0%,表明組裝結(jié)果完整性和準(zhǔn)確性較高。

表2 優(yōu)化組裝結(jié)果評(píng)估表

如表3所示,過(guò)濾后測(cè)序數(shù)據(jù)為25 741 020～38 836 367條,可以對(duì)比到組裝Transcript上的過(guò)濾后測(cè)序數(shù)據(jù)為17 330 951～27 367 399條,可以追蹤到組裝Transcript上的過(guò)濾后測(cè)序數(shù)據(jù)所占百分比為67.03%～70.47%。

表3 測(cè)序數(shù)據(jù)與組裝結(jié)果對(duì)比

2.3 差異表達(dá)基因分析

表4為差異基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)表,從獲得的差異表達(dá)基因集的基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)得出,西藏黑木耳子實(shí)體旺盛期和成熟期差異基因?yàn)? 225個(gè),上調(diào)基因?yàn)?61個(gè),下調(diào)基因?yàn)?64個(gè)。幼耳期和旺盛期差異基因?yàn)? 096個(gè),比旺盛期和成熟期的差異基因多,同時(shí)上調(diào)基因也比下調(diào)基因表達(dá)得更多,上調(diào)基因?yàn)? 225個(gè),下調(diào)基因?yàn)?71個(gè)。

表4 差異基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)表

圖1 差異基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)圖(a)和維恩圖(b)

圖1為差異基因數(shù)目的統(tǒng)計(jì)圖和信息圖。維恩圖顯示,西藏6號(hào)黑木耳幼耳期、旺盛期和成熟期3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的共同差異基因有13 281個(gè)。其中,成熟期和旺盛期的差異基因有14 335個(gè),幼耳期和成熟期的差異基因有13 717個(gè),幼耳期和旺盛期的差異基因有14 093個(gè)。

2.4 功能注釋及統(tǒng)計(jì)

將組裝后的黑木耳子實(shí)體轉(zhuǎn)錄組序列與六大數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比,所有的Unigene和Transcript數(shù)量分別為27 529個(gè)和57 634個(gè),表達(dá)的Unigene和Transcript數(shù)量分別為27 444個(gè)和57 406個(gè),注釋到數(shù)據(jù)庫(kù)的表達(dá)Unigene和Transcript數(shù)量分別為18 258個(gè)和40 469個(gè)。在六大數(shù)據(jù)庫(kù)上表達(dá)的Unigene分別注釋了1 1967個(gè)(GO)、7 658個(gè)(KEGG)、5 252個(gè)(COG)、17 132個(gè)(Nr)、9 240個(gè)(Swiss-Prot)和11 328個(gè)(Pfam),表達(dá)的Transcript分別注釋到27 232個(gè)(GO)、15 425個(gè)(KEGG)、9 090個(gè)(COG)、38 968個(gè)(NR)、19 555個(gè)(Swiss-Prot)和24 214個(gè)(Pfam)。

表5 轉(zhuǎn)錄本功能注釋統(tǒng)計(jì)表

2.5 GO功能富集分析

對(duì)西藏6號(hào)黑木耳子實(shí)體幼耳期和旺盛期差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析,結(jié)果如圖2所示。基因集中的基因可以分成BP(Biological Process, 生物過(guò)程)、MF(Molecular Function, 分子功能)及CC(Cellular Component, 細(xì)胞組分)三個(gè)類別。在“生物過(guò)程”類別中,參與類異戊二烯生物合成過(guò)程(GO:0008299)的基因有6個(gè),類異戊二烯代謝過(guò)程(GO:0006720)的基因有6個(gè),谷氨酸脫羧成琥珀酸過(guò)程(GO:0006540)基因有3個(gè),GO term顯著富集,表明黑木耳子實(shí)體在生長(zhǎng)發(fā)育和代謝調(diào)節(jié)等方面活動(dòng)頻繁。在“細(xì)胞組分”類別中,差異表達(dá)基因主要富集在膜的組成部分(GO:0016021)和膜的固有組分(GO:0031224),分別有415個(gè)。在“分子功能”類別中,最為富集的Unigene具有催化活性和結(jié)合活性。表明黑木耳子實(shí)體中大量的Unigene可以翻譯為具有催化活性的酶和具有結(jié)合功能的蛋白。

圖2 黑木耳子實(shí)體幼耳期和旺盛期差異表達(dá)基因GO功能富集分析圖

將黑木耳子實(shí)體旺盛期和成熟期的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析,結(jié)果如圖3所示。在“細(xì)胞組分”類別中,參與膜的固有組分(GO:0031224)和膜的組成部分(GO:0016021)的差異表達(dá)基因分別有168個(gè)。在“分子功能”類別中,參與金屬末端肽酶活性(GO:0004222)的基因有12個(gè),參與肽鏈內(nèi)切酶活性(GO:0004175)的基因有23個(gè),表明黑木耳子實(shí)體中具有催化肽類活性的Unigene最為富集。從GO功能富集分析結(jié)果可以看出,在生物學(xué)過(guò)程類別中,差異表達(dá)基因主要富集在異類戊二烯的合成和代謝過(guò)程,說(shuō)明差異表達(dá)基因在“生物學(xué)過(guò)程”主要參與細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的各種異類戊二烯的合成和代謝活動(dòng)。在“細(xì)胞組分”類別中,富集到膜的固有組分和膜的組成部分的差異表達(dá)基因最多,表明細(xì)胞膜成分隨著西藏6號(hào)黑木耳不斷生長(zhǎng)而發(fā)生改變。在“分子功能”類別中,在催化活性通路的差異表達(dá)基因最多。曾倩倩等對(duì)小麥葉片差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析,檢測(cè)到的1 207個(gè)DEGs富集到3個(gè)類別的34個(gè)條目下,主要參與催化、代謝和水解酶活性等,表明小麥?zhǔn)芨珊淡h(huán)境的脅迫作用是多方面的[19]。

圖3 黑木耳子實(shí)體旺盛期和成熟期差異表達(dá)基因GO功能富集分析圖

2.6 KEGG功能富集分析

將西藏6號(hào)子實(shí)體幼耳期和旺盛期差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG功能富集分析,結(jié)果如圖4所示。富集到的Unigene有6個(gè)類別,20個(gè)亞類。在子類別中,p<0.05的有8個(gè)亞類。Unigene最為富集的途徑是碳水化合物代謝(16%)、氨基酸代謝(15%)、脂質(zhì)代謝(12%)、輔助因子和維生素代謝(9%)、其他氨基酸代謝(7%)以及運(yùn)輸和分解代謝(7%),說(shuō)明西藏6號(hào)黑木耳子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中碳代謝和氮代謝較為旺盛,為黑木耳子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)與能量。

圖4 黑木耳子實(shí)體幼耳期和旺盛期差異表達(dá)基因KEGG功能富集分析圖

曾倩倩等對(duì)小麥葉片DEGs的KEGG通路富集發(fā)現(xiàn),存在淀粉和蔗糖代謝、葉綠素代謝、光合作用、苯丙烷生物合成、甘油磷脂代謝、氨基酸代謝及光合生物中的碳固定等通路。表明植物受干旱環(huán)境的脅迫,光合作用-天線蛋白、葉綠體組分、氨基酸代謝和碳代謝等通路受到影響,光合作用和物質(zhì)積累受到抑制,這可能與小麥葉片相對(duì)含水量降低及MDA含量增加有關(guān)[20]。盧園萍等通過(guò)對(duì)巴氏蘑菇子實(shí)體3個(gè)階段的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),原基期上調(diào)DEGs主要富集在核糖體蛋白和DNA復(fù)制,表明原基期細(xì)胞代謝旺盛,其中核糖體蛋白基因上調(diào)為后期蛋白質(zhì)合成提供重要場(chǎng)所;采收期和開(kāi)傘期差異表達(dá)基因主要富集在碳水化合物代謝、脂肪酸降解和氨基酸代謝等途徑,為巴氏蘑菇子實(shí)體的生長(zhǎng)發(fā)育與成熟提供營(yíng)養(yǎng)和能量[21]。吳曉梅等對(duì)雙孢蘑菇子實(shí)體3個(gè)發(fā)育時(shí)期進(jìn)行KEGG富集分析,發(fā)現(xiàn)DEGs參與了氨基酸代謝、碳水化合物代謝、核苷酸代謝、脂類代謝和能量代謝這五大代謝通路,其中差異基因主要富集在氨基酸代謝通路中,氨基酸合成相關(guān)的多數(shù)基因上調(diào)表達(dá),表明雙孢蘑菇子實(shí)體發(fā)育形成需要一系列代謝反應(yīng)協(xié)同調(diào)控,氨基酸代謝相關(guān)基因可能在雙孢蘑菇子實(shí)體發(fā)育過(guò)程中起重要作用[22]。

將西藏6號(hào)黑木耳子實(shí)體旺盛期和成熟期差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG功能富集分析,結(jié)果如圖5所示。富集到的Unigene主要有6個(gè)類別,19個(gè)亞類。有5個(gè)亞類在子類別中p<0.05,Unigene最為富集的途徑是氨基酸代謝(19%)、碳水化合物代謝(13%)、脂質(zhì)代謝(12%)、聚糖的生物合成和代謝(9%)、運(yùn)輸和分解代謝(7%)、其他氨基酸代謝(6%)及能量代謝(4%)。表明黑木耳生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中代謝過(guò)程極其豐富,氨基酸代謝在黑木耳子實(shí)體生長(zhǎng)中提供能量和營(yíng)養(yǎng)。與吳曉梅等對(duì)雙孢蘑菇子實(shí)體不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果[21]類似,氨基酸代謝和碳水化合物代謝也有大量的差異基因富集。

圖5 黑木耳子實(shí)體旺盛期和成熟期差異表達(dá)基因KEGG功能富集分析圖

3 結(jié) 論

對(duì)黑木耳子實(shí)體發(fā)育過(guò)程中3個(gè)不同階段樣品的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序,并對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行注釋以及GO和KEGG功能富集分析。對(duì)黑木耳子實(shí)體9個(gè)樣品的測(cè)序共獲得 81.93 Gb Clean data,組裝后得到Unigene為13 765個(gè),Transcript為28 817個(gè),平均長(zhǎng)度為1 128.30 bp,N50長(zhǎng)度為1 954 bp。以上結(jié)果表明,黑木耳子實(shí)體轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和組裝質(zhì)量都較高。采用生物信息學(xué)進(jìn)行分析,將組裝后黑木耳子實(shí)體轉(zhuǎn)錄組序列與六大數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比,注釋到數(shù)據(jù)庫(kù)的Unigene共有18 258個(gè),占全部Unigene的66.53%。注釋到數(shù)據(jù)庫(kù)的Transcript共有40 469個(gè),占全部Transcript的70.5%。

從GO功能富集分析的結(jié)果可以看出,在“生物學(xué)過(guò)程”類別中,差異表達(dá)基因主要富集在異類戊二烯的合成和代謝過(guò)程,說(shuō)明差異表達(dá)基因在生物學(xué)過(guò)程主要參與細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的各種異類戊二烯的合成和代謝活動(dòng)。在“細(xì)胞組分”類別中,富集到膜的固有組分和膜的組成部分的差異表達(dá)基因最多,表明隨著西藏6號(hào)黑木耳不斷生長(zhǎng),細(xì)胞膜成分發(fā)生改變,細(xì)胞膜能夠調(diào)節(jié)物質(zhì)運(yùn)輸,維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。在“分子功能”類別中,在催化活性通路的差異表達(dá)基因最多。KEGG富集分析有利于了解基因的生物學(xué)功能,本研究對(duì)西藏6號(hào)黑木耳子實(shí)體3個(gè)不同時(shí)期發(fā)育階段差異基因進(jìn)行KEGG分析,篩選出多條與黑木耳子實(shí)體不同生長(zhǎng)發(fā)育階段有關(guān)的代謝途徑,包括氨基酸代謝、碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝和聚糖的生物合成和代謝等。表明黑木耳生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中代謝過(guò)程極其豐富,氨基酸代謝在黑木耳子實(shí)體生長(zhǎng)中提供營(yíng)養(yǎng)和能量。本研究結(jié)果為下一步篩選和挖掘有關(guān)西藏黑木耳子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育的功能基因提供重要數(shù)據(jù)參考,為黑木耳品種改良提供了科學(xué)依據(jù)。