張?zhí)戽? 楊希國 陳玉艷 李麗 劉石鑫

【摘要】建立一種采用Aminex？HPX-87H有機酸分析柱分離，高效液相色譜法同步檢測飼料酸化劑中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸含量的方法。樣品采用水超聲提取，應用Aminex？HPX-87H有機酸分析柱，以0.01 mol/L硫酸溶液為流動相，二極管陣列檢測器在210 nm進行定量檢測。結果表明：有機酸標準溶液線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.995，回收率均大于90.0%，變異系數(shù)小于10%。該方法具有專屬性強、準確度高的特點。

【關鍵詞】高效液相色譜法；酸化劑；有機酸

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.02.029 Study on the Application of Organic Acid Analysis Column in the Quality Detection of Feed Acidifier

ZHANG Tianshu1，YANG Xiguo2，CHEN Yuyan1，LI Li2，LIU Shixin2

（1.Liaoning Inspection，Examination & Certification Centre，Shenyang 110036，China；2.Liaoning General Fair Testing Co.，Ltd.，Shenyang 110026，China）

Abstract：To establish an Aminex？HEPX-87H organic acid analytical column for the simultaneous determination of formic acid，acetic acid， propionic acid，butyric acid，lactic acid，citric acid and malic acid in feed acidifiers by HPLC. The samples were extracted by ultrasonic water. Aminex？HEPX-87H organic acid analysis column was used for the quantitative detection at 210 nm with 0.01 mol/L sulfuric acid solution as the mobile phase and a diode array detector. The results showed that the linear relationship of organic acid standard solution was good，the correlation coefficients were all greater than 0.995，the recoveries were all greater than 90.0%，and the coefficient of variation was less than 10%. The method has the characteristics of strong specificity and high accuracy.

Key words：high-performance liquid chromatography；feed acidifier；organic acid

飼料酸化劑是指能提高飼料酸度（降低pH值）的一類物質(zhì)。它能改變飼料的適口性，降低腸道pH值，提高消化酶活性，影響胃腸道微生物組成，并且可以直接參與體內(nèi)代謝、增強免疫功能，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[1-3]。近年來，抗生素禁止用在動物飼料上，酸化劑被視為在豬飼料中能夠有效替代抗生素的產(chǎn)品之一，在動物飼養(yǎng)中得到廣泛應用[4]。

飼料酸化劑一般分為無機酸和有機酸，其中有機酸在飼料工業(yè)中作為飼料酸化劑被廣泛應用。為了更好地掌握酸化劑產(chǎn)品質(zhì)量，規(guī)范產(chǎn)品生產(chǎn)和使用，檢測機構需要建立一種高效、便捷、快速、準確的有機酸檢測方法。目前飼料中有機酸的分析方法有比色法和色譜法，比色法只能測定單一的有機酸，色譜法可以同時測定多種有機酸。應用比色法復雜而且誤差大，很難滿足常規(guī)測定要求。食品加工業(yè)中多采用反相色譜柱分離測定有機酸[5-7]，其準確性高、特異性強，可以同時測定多種有機酸。但同時測定甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸含量的檢測方法未見報道。本實驗建立了采用Aminex？HPX-87H有機酸專用分析柱分離，高效液相色譜法同步檢測飼料酸化劑中7種酸含量的方法。

1材料與方法

1.1儀器和試劑

電子天平（梅特勒）；Waters 2695型高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器（Waters公司）；超聲波水浴器；美國伯樂Bio-Rad Aminex？HPX-87H色譜分析柱：300 mm×7.8 mm；甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸標準品：含量大于98.0%，購置于德國Dr.Ehrenstorfer公司；硫酸為優(yōu)級純試劑；實驗用水為二級水；二氧化硅由市場購買而得。

1.2標準溶液配置

0.01 mol/L硫酸溶液：準確量取0.3 mL硫酸，緩緩注入1 L水中，冷卻搖勻。標準儲備液：精密稱取0.1 g（精確到0.00001 g）甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸標準品，用水溶解并定容至10 mL容量瓶。該標準貯備液每毫升含甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸均為10 mg。

1.3樣品提取

準確稱取樣品1 g（精確至0.0001 g），置于100 mL容量瓶中，加入70 mL去離子水，在40℃下超聲提取30 min，放至室溫，用去離子水定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后用高效液相色譜儀測定。

1.4色譜條件

色譜柱：Aminex？HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm）。柱溫：30℃。流動相：0.01 mol/L硫酸溶液。流速：1.0 mL/ min。檢測器：二極管陣列檢測器。波長：210 nm。進樣體積：20.00μL。

2結果與分析

2.1色譜柱的選擇

有機酸為弱酸，易在水系流動相中發(fā)生解離而不被非極性鍵合相保留，通常采用酸性磷酸氫鹽溶液抑制解離，改善有機酸的保留和分離。所以文獻中大部分選擇C18色譜柱，磷酸氫鹽溶液作為流動相，但是磷酸氫鹽溶液會對色譜柱造成損害。

Aminex HPX-87H是BioRad的離子交換色譜柱（H+型），pH范圍在1～3之間，用于對含有羧酸、揮發(fā)性脂肪酸、短鏈脂肪酸、醇類、酮類以及許多中性新陳代謝副產(chǎn)物的溶液中的碳水化合物進行分析，而且該色譜柱的典型流動相是低濃度的硫酸。故本實驗選用該色譜柱進行飼料酸化劑中有機酸的研究，其特異性強、準確度高。

2.2流動相的選擇

Aminex？HPX-87H色譜柱的典型流動相為硫酸溶液。本實驗研究了0.001 mol/L、0.005 mol/L和0.01 mol/L硫酸溶液作為流動相時的出峰情況。結果表明：3種不同濃度的硫酸溶液作為流動相時，目標峰均可以得到很好的分離，但0.001 mol/L、0.005 mol/L硫酸溶液作為流動相時，出峰時間過長，故本研究采用0.01 mol/L硫酸溶液作為流動相為最佳?；旌蠘藴嗜芤簣D譜見圖1。

2.3提取液的選擇

甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸均易溶于水，并且酸化劑的成分也比較簡單，大部分是有機酸與無機載體混合物，所以不需要進一步凈化，水提取后過濾膜直接上機測定即可。

2.4色譜柱溫度的選擇

Aminex？HPX-87H色譜柱的適宜溫度應不超過65℃?？疾?0℃、35℃、40℃、50℃不同溫度下各種酸的出峰情況。結果表明：隨著溫度的升高，各種有機酸的分離度降低，峰型不佳，經(jīng)過試驗研究，確定本試驗的色譜柱溫度為30℃。

2.5標準曲線測定

準確移取合適濃度的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸混合標準儲備液適量，用水配制成濃度為5μg/mL、20μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的標準溶液，上機測定。以目標化合物峰面積為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。結果表明：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸在5μg/mL至1000μg/mL范圍內(nèi)相關系數(shù)均大于0.995，線性關系良好。在本實驗條件下，將標準儲備液連續(xù)稀釋后添加到空白試樣中，進行添加回收，根據(jù)信噪比大于10、稱樣量和進樣量計算，得出方法定量限。結果見表1。

2.6準確度和精密度試驗

采用二氧化硅為載體，準確稱取空白載體1 g（精確至0.0001 g）至100 mL容量瓶中，添加不同濃度的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸混合標準溶液，密封放置24小時后按上述確定的樣品提取和色譜條件進行檢測，以回收率衡量準確度，以回收率的精密度衡量方法的精密度。七種有機酸的添加回收率在92.6%～102.4%之間，精密度在0.6%～ 3.5%之間，詳見表2。

2.7實際樣品檢測

應用建立的檢測方法，選取市售4種有機酸飼料添加劑進行檢測，樣品檢測結果見表3，色譜圖見圖2-圖5。

對實際樣品的測定結果表明：利用有機酸分析柱可同時測定飼料酸化劑中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸的含量。此方法操作簡單，效率高，可以滿足日常檢測需求。

【參考文獻】

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[3]秦圣濤，張宏福，唐湘方，等.酸化劑主要生理功能和復合酸選配依據(jù)[J].動物營養(yǎng)學報，2007（增刊1）：515-520.

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【作者簡介】

張?zhí)戽?985年出生，高級畜牧師，碩士，研究方向為動物營養(yǎng)與飼料安全。

（編輯：李加鵬）