宋蕊蕊

（河南科技大學第一附屬醫(yī)院消化內科，河南 洛陽 471003）

功能性便秘（Functional constipation，F(xiàn)C）是全球高發(fā)疾病，指腸道功能紊亂導致機體出現(xiàn)大便干結、排便難、次數(shù)減少或排便不盡等癥狀，屬中醫(yī)學“便秘”、“陽結”或“陰結”范疇。西醫(yī)治療存在易復發(fā)，副作用大，長期療效一般等缺點。中醫(yī)治療功能性便秘歷史悠久，方法多樣，主張辨證施治，整體調節(jié)臟腑氣血陰陽，祛邪不傷正，標本兼治[1]。當歸與肉蓯蓉是治療功能性便秘常用方濟川煎的主要組成藥物，二者也是數(shù)據(jù)挖掘治療便秘常用方的經典藥物組合前三名[2]。當歸-肉蓯蓉藥對溫腎益精，潤腸通便，可用于老年人、久病體虛、婦人產后、溫病后期等功能性便秘患者，但其作用機制尚不明確。此外，F(xiàn)C發(fā)病原因復雜，與飲食、生活習慣、自主神經功能異常、藥物或年齡等相關，給其作用機制探討帶來更大困難。

網絡藥理學結合藥物、成分、作用靶點和疾病靶點信息，多角度、多方面探索藥物和疾病之間的分子關聯(lián)，從而更好的揭示藥物治療疾病的分子機制[3]。尤其是在中醫(yī)藥研究中，網絡藥理學與中醫(yī)整體觀不謀而合，從而探討中藥多成分、多靶點、多途徑治療疾病的方式。本文借助網絡藥理學方法，探討當歸肉蓯蓉對FC的治療作用及機制，為其臨床應用提供理論依據(jù)，并為后期試驗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 當歸-肉蓯蓉化學成分、對應靶點和功能性便秘疾病靶點的篩選

基于TCMSP數(shù)據(jù)庫（https://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索當歸和肉蓯蓉的化學成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-like properties，DL）≥0.05作為條件，篩選當歸和肉蓯蓉的活性成分?；赥CMSP、STITCH（http://stitch.embl.de/）等數(shù)據(jù)庫收集當歸-肉蓯蓉活性成分對應靶點，并于Uniport（https://www.uniprot.org /）數(shù)據(jù)庫轉換基因名，去重。

GeneCards數(shù)據(jù)庫（http://www.genecards.org）檢索“functional constipation”，獲得FC疾病靶點。

1.2 藥物-活性成分-靶點網絡構建和生物信息學分析

采用Cytoscape 3.7.0軟件進行“當歸-肉蓯蓉-活性成分-靶點網絡”的構建，以度（degree）≥6為閾值篩選，得到“當歸-肉蓯蓉-活性成分-靶點網絡”。DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）進行當歸-肉蓯蓉成分靶點的基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。

1.3 藥物-活性成分-共有靶點網絡構建

收集當歸、肉蓯蓉活性成分和FC疾病靶點的交集靶點，稱共有靶點，Cytoscape 3.7.0軟件構建“當歸-肉蓯蓉-活性成分-FC共有靶點網絡”。

1.4 關鍵基因篩選和蛋白互作網絡構建

于STRING數(shù)據(jù)庫（https://string- db.org/）檢索共有靶點，收集蛋白互作信息，CytoNCA插件基于點度中心性（Degree Centrality，DC）、接近中心性（Closeness Centrality，CC）、中介中心性（Betweenness Centrality，BC）篩選關鍵基因，進行關鍵基因的蛋白質互作網絡（Protein-Protein Interaction Networks，PPI）構建[4]。

1.5 當歸-肉蓯蓉治療FC的關鍵基因生物信息學分析

DAVID數(shù)據(jù)庫進行當歸-肉蓯蓉治療FC的關鍵基因的GO功能和KEGG通路富集分析，GO功能富集分析以P＜0.01，count≥5為閾值，KEGG通路富集分析以P＜0.01且count≥10為閾值。

2 結果

2.1 當歸-肉蓯蓉的活性成分收集

共檢索到當歸化學成分125個，肉蓯蓉化學成分75個。其中，OB≥30%和DL≥0.05的當歸活性成分25個，肉蓯蓉13個。最終得到無重復且有相應靶標的活性成分39個，見表1。

表1 當歸和肉蓯蓉的主要活性成分

2.2 藥物活性成分靶點和FC疾病靶點的收集

數(shù)據(jù)庫收集到當歸活性成分相關靶點56個，肉蓯蓉活性成分相關靶點143個，交集靶點16個。FC疾病靶點5199個，其中，Relevance score≥3的靶點為2428個。當歸、肉蓯蓉與FC三者交集靶點13個，當歸-肉蓯蓉藥物靶點與FC疾病靶點交集靶點132個，見圖1。

圖1 藥物與疾病靶點韋恩圖

2.3 當歸-肉蓯蓉的藥物成分-靶點網絡和生物信息學分析

“當歸-肉蓯蓉-活性成分-靶點網絡”包含276個節(jié)點和330條邊。網絡中，當歸-肉蓯蓉共有活性成分β-谷甾醇，肉蓯蓉活性成分槲皮素，當歸活性成分豆甾醇、阿魏酸、菖蒲二烯等degree值高，提示這些成分可能為當歸-肉蓯蓉配伍中的主要有效成分。

前列腺素內過氧化物合成酶（Prostaglandin G/H synthase and cyclooxygenase，PTGS2、PTGS1）、γ氨基丁酸A受體（Gamma-Aminobutyric Acid Type A Receptor Subunit Alpha1，GABRA1）、毒蕈堿型膽堿受體（Muscarinic Acetylcholine receptor，CHRM2、CHRM1、CHRM3）、去甲腎上腺素轉運體基因（Sodium-dependent noradrenaline transporter，SLC6A2）、細胞腫瘤抗原p53（Cellular tumor antigen p53，TP53）、半胱氨酸蛋白酶（Caspase，CASP）和分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）等靶點的degree值較高，提示這些靶點可能在當歸-肉蓯蓉配伍中起主要作用，網絡中degree值排名前20的當歸-肉蓯蓉相關成分和靶點見表2。對當歸-肉蓯蓉的靶點富集分析結果顯示，藥對靶點的GO功能主要富集在細胞外空間、質膜組成、核質等細胞成分，酶結合、RNA聚合酶II轉錄因子活性、類固醇激素受體活性等分子功能，炎癥反應、凋亡過程的負調控、血管收縮的正向調節(jié)等生物學過程，均與FC疾病機制相關，提示當歸-肉蓯蓉藥對可用于FC等胃腸道疾病的治療，見圖2。

圖2 當歸-肉蓯蓉藥物靶點GO功能富集結果

表2 當歸-肉蓯蓉-活性成分-靶點網絡重要節(jié)點

2.4 當歸-肉蓯蓉治療FC的藥物-活性成分-共有靶點網絡和關鍵基因篩選

“當歸-肉蓯蓉-活性成分-FC共有靶點網絡”共有146個節(jié)點和226條邊。β-谷甾醇、槲皮素、豆甾醇、阿魏酸等成分的degree值高。PTGS2、PTGS1、GABRA1、CHRM2、CHRM1、CHRM3和SLC6A2等靶點的degree值較高，提示這些靶點可能在當歸-肉蓯蓉治療FC中起主要作用，見圖3。CytoNCA插件按DC≥44、CC≥48.415613、BC≥0.517432975為閾值篩選，最終得到關鍵基因74個，PPI網絡有節(jié)點74個，邊1334條。AKT蛋白激酶（Threonine-protein kinase，AKT1）、血管內皮生長因子A（Vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）、轉錄因子（Transcription factor Jun，JUN）、TP53、CASP和MAPK等節(jié)點degree值大，結合分數(shù)高，在網絡最中心，預測為當歸-肉蓯蓉治療FC的潛在關鍵靶點，見圖4。

圖3 當歸-肉蓯蓉-活性成分-FC共有靶點網絡（節(jié)點大小與degree值成正比）

圖4 當歸-肉蓯蓉治療FC的關鍵基因PPI網絡

2.5 當歸-肉蓯蓉治療FC的關鍵基因的生物信息學分析

關鍵基因GO分析的結果可知，當歸、肉蓯蓉配伍治療功能性便秘的機制多與缺氧的反應、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、凋亡過程的負調控、類固醇激素受體活性等多個生物過程和分子功能有關，見圖5。KEGG 通路主要有TNF信號通路、HIF-1信號通路、p53信號通路、PI3KAkt 信號通路、MAPK信號通路等，見圖6。

圖5 GO功能富集分析

圖6 KEGG通路分析

3 討論

FC多與患者生活習慣、精神因素、腸道菌群失調、胃腸激素和神經遞質異常等有關，病程長且治療難度大[5]。西醫(yī)藥物治療存在療效欠佳，易引起復發(fā)，易形成依賴性等缺點[6]。中醫(yī)用以活血養(yǎng)血、滋陰補陽、疏肝健脾、潤腸通便的中藥，改善患者陰虛血虛、肝氣郁結、脾胃不和等狀態(tài)[7]。當歸-肉蓯蓉為治療FC常見藥對，當歸滋陰生血，補血活血，潤腸通便；肉蓯蓉補腎壯陽，滋陰養(yǎng)血，軟堅通便。二者配伍，行中有補，補而不峻，起到調肝養(yǎng)血，潤腸通便的功效。因此，本研究基于網絡藥理學技術進行了當歸-肉蓯蓉藥對配伍治療FC作用機制。的

最終收集到當歸-肉蓯蓉藥對活性成分39個，成分相關靶點237個，F(xiàn)C疾病靶點2428個。其中，當歸-肉蓯蓉藥對靶點與疾病靶點的交集靶點132個，篩選到關鍵基因74個。β-谷甾醇、槲皮素、豆甾醇、阿魏酸等成分可能是藥對治療FC的活性成分，β-谷甾醇為當歸-肉蓯蓉的共有活性成分，具有抗炎、抗氧化、抑菌等作用[8]。研究表明，β-谷甾醇和豆甾醇可改善小鼠實驗性結腸炎，保護大鼠胃和十二指腸，預防消化性潰瘍[9]。改善功能性便秘可通過減少炎癥反應實現(xiàn)[10]。PTGS與胃腸道功能關系密切，是炎癥反應的主要介質[11]。PTGS2在慢性和急性炎癥反應中明顯上調，可加重胃腸道毒性。在機械性腸梗阻模型中，表達上調甚至誘發(fā)結直腸癌發(fā)病[12]。AKT1依賴PI3K途徑激活，對PI3K-AKT 通路的激活，可影響腸道傳輸功能從而參與功能性便秘、慢性傳輸性便秘等多種便秘[13]。

TP53信號通路、MAPK信號通路和NF-κB信號通路已被報道與功能性便秘發(fā)病機制密切相關[14-15]。MAPK信號通路通過調節(jié)水通道蛋白的表達，促進水分運輸，調節(jié)慢性傳輸型便秘大鼠結腸水代謝平衡[16]。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學技術分析，發(fā)現(xiàn)當歸-肉蓯蓉可能通過β-谷甾醇、豆甾醇、阿魏酸等關鍵活性成分，作用于PTGS2、AKT1、TP53、CASP和MAPK等核心靶點，參與TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等，發(fā)揮其多成分、多靶點、多通路治療FC的作用，為深入研究其作用機制提供了理論依據(jù)和思路。