王梓宇，張智慧，吳 鵬，李浩然，趙 夢，何夢嬌，張學(xué)蘭，趙 鑫

基于腸道菌群和短鏈脂肪酸代謝探討甘草制遠(yuǎn)志降低腸道炎癥的作用機制

王梓宇，張智慧，吳 鵬，李浩然，趙 夢，何夢嬌，張學(xué)蘭*，趙 鑫*

山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟南 250355

研究遠(yuǎn)志甘草制前后對正常大鼠腸道菌群和短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）代謝的影響，探討甘草制遠(yuǎn)志降低腸道炎癥的機制。SD大鼠連續(xù)15 d ig遠(yuǎn)志或制遠(yuǎn)志后，ELISA法檢測十二指腸組織中炎癥因子白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腸組織病理變化；采用16S rDNA測序技術(shù)檢測大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)變化；運用氣相色譜法測定大鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸含量。甘草制遠(yuǎn)志可顯著降低遠(yuǎn)志引起的大鼠十二指腸組織中IL-6、IL-8、TNF-α水平升高和腸道炎癥損傷（＜0.05、0.01）。16S rDNA測序結(jié)果顯示，甘草制遠(yuǎn)志后可改善遠(yuǎn)志引起的大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)改變和物種多樣性減少，在門水平上主要表現(xiàn)為厚壁菌門（Firmicutes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）相對豐度回升（＜0.05、0.01），擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteriota）相對豐度下調(diào)（＜0.05、0.01）；在屬水平上，遠(yuǎn)志甘草制后可上調(diào)有益菌乳酸桿菌屬、毛螺菌屬、顫螺旋菌屬等菌屬的豐度（＜0.05、0.01），下調(diào)潛在的致病菌擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬等菌屬的豐度。甘草制遠(yuǎn)志可一定程度逆轉(zhuǎn)遠(yuǎn)志引起的大鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸含量降低（＜0.05、0.01）。遠(yuǎn)志引起的腸道炎癥可能與其引起腸道菌群和SCFAs紊亂有關(guān)，甘草制遠(yuǎn)志可通過改善腸道菌群和SCFAs代謝來降低腸道炎癥反應(yīng)。

遠(yuǎn)志；甘草制；腸道炎癥；腸道菌群；短鏈脂肪酸；遠(yuǎn)志𠮿酮III；3,6′-二芥子?；崽?/p>

遠(yuǎn)志為臨床常用中藥，具有安神益智、交通心腎、祛痰、消腫的功效[1]。遠(yuǎn)志生用具有刺激咽喉、令人嘔吐的不良反應(yīng)，大劑量服用會產(chǎn)生胃腸毒性，抑制實驗動物的胃腸運動，造成胃腸黏膜損傷[2]。甘草制遠(yuǎn)志可緩和燥性，消除麻味，免刺咽喉，并可增強遠(yuǎn)志安神益智作用，故遠(yuǎn)志臨床應(yīng)用時一般需要炮制后入藥[3]。研究表明，遠(yuǎn)志經(jīng)甘草制后皂苷、糖酯和有機酸類成分含量發(fā)生明顯變化，并可緩解遠(yuǎn)志引起的腸道炎癥和腸黏膜損傷[4-6]。但甘草制遠(yuǎn)志減輕腸道炎癥的機制尚未闡明。

腸道菌群為在腸道中定植的細(xì)菌組成的生態(tài)系統(tǒng)，具有促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育、拮抗外來致病菌定植的作用[7]。腸道微生物群改變會使黏膜免疫反應(yīng)失調(diào)，導(dǎo)致宿主發(fā)生腸道炎癥。調(diào)節(jié)腸道菌群平衡可以恢復(fù)免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，從而改善腸道炎癥[8]。短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）是腸道菌群主要代謝產(chǎn)物，包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等，其在大鼠糞便中含量高低可間接反映腸道內(nèi)微生物變化，并對人體健康起著重要作用[9]。SCFAs可調(diào)節(jié)宿主能量代謝和能量供應(yīng)，具有抑制病原菌、維持腸屏障功能及抗炎作用[10]。目前遠(yuǎn)志炮制前后對正常大鼠腸道菌群及SCFAs代謝的影響未見報道。本研究從甘草制遠(yuǎn)志調(diào)節(jié)腸道菌群和糞便中SCFAs代謝角度探討遠(yuǎn)志甘草制減輕腸道炎癥的機制，進(jìn)一步豐富遠(yuǎn)志炮制減毒的科學(xué)內(nèi)涵，為遠(yuǎn)志的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物合格證號SCXK（魯）20190003。動物于溫度（23±1）℃、相對濕度（60±5）%、自然晝夜節(jié)律光照環(huán)境，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。動物實驗經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號SDUTCM20220525002）。

1.2 藥材

遠(yuǎn)志購自山東百味堂中藥飲片有限公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院徐凌川教授鑒定為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志W(wǎng)illd.的干燥根。

制遠(yuǎn)志按《中國藥典》2020年版一部炮制方法制備[1]：取凈遠(yuǎn)志段1 kg，置鍋內(nèi)，加甘草汁和適量水，煮至湯液吸盡，口嘗無刺喉感，取出，干燥。每1千克遠(yuǎn)志用甘草60 g。

1.3 藥品與試劑

白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號分別為190729KE1、190729KE2、190729KE3）均購自江蘇晶美生物科技有限公司；Qiagen凝膠提取試劑盒購自德國Qiagen公司；Phusion?型高保真PCR預(yù)混液購自美國New England Biolabs公司；Universal DNA純化回收試劑盒購自中國天根生化科技有限公司；NEBNext?Ul tra?Ⅱ DNA Library PrepKit建庫試劑盒購自美國Illumina公司；對照品乙酸、丙酸、丁酸、戊酸（批號分別為CHB180927、CHB180603、CHB180606、CHB180126，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%）購自成都克洛瑪生物科技有限公司。

1.4 儀器

352型酶標(biāo)儀（長沙平凡儀器儀表有限公司）；Qubit 2.0熒光計、Ec250-90型電泳儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Gene-Amp?9700型PCR擴增儀（美國ABI公司）；NEBNext?Ultra? II DNA Library PrepKit型Illumina NovaSeq平臺、Illumina Novaseq型測序儀（美國Illumina公司）；Tanon 1600型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；H3-18KR型臺式高速冷凍離心機（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）；FA1604N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；Agilent 6890型氣相色譜儀（美國Agilent公司）。

2 方法

2.1 遠(yuǎn)志與制遠(yuǎn)志提取物的制備及其主要成分定量分析

取遠(yuǎn)志和制遠(yuǎn)志粉末（過2號篩）各1 kg，分別加10、8、8倍量的70%乙醇超聲提取3次，每次超聲1 h，抽濾，濾液合并，減壓濃縮至一定體積，冷凍干燥。按照課題組前期建立的方法[6]，采用HPLC法對遠(yuǎn)志與制遠(yuǎn)志提取物中主要成分進(jìn)行定量分析。

2.2 分組與給藥

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機分為空白組及遠(yuǎn)志低、高劑量（4、8 g/kg）組和制遠(yuǎn)志低、高劑量（4、8 g/kg，以生藥量計）組，每組6只。取凍干粉適量，臨用前用蒸餾水配成折合生藥量1.00 g/mL的藥液。各給藥組ig相應(yīng)藥物，1次/d，連續(xù)15 d，空白組ig等體積的生理鹽水。

2.3 大鼠十二指腸組織中炎癥因子IL-6、IL-8和TNF-α水平的測定

給藥結(jié)束后，取大鼠十二指腸組織，剪碎，稱定，加磷酸緩沖鹽溶液勻漿（組織∶溶液＝1 g∶9 mL），將勻漿器下端插入冰水中上下研磨6～8 min，4 ℃、3000 r/min離心15 min，取上清液，按照試劑盒說明書檢測IL-6、IL-8和TNF-α水平。

2.4 大鼠小腸組織病理學(xué)檢查

將各組大鼠相同部位小腸組織用4%多聚甲醛固定48 h，進(jìn)行石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅（HE）染色后置于顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察并拍照。

2.5 大鼠腸道菌群16S rDNA基因測序與分析

末次給藥后，按摩大鼠腹部促其排便，將糞便裝入無菌凍存管中，液氮速凍后放置?80 ℃冰箱保存。采用十六烷基三甲基溴化銨法提取各組大鼠糞便樣品總DNA，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取純度和濃度。采用特異性引物515F（5’-ACTCCTACGGGAG-3’）、806R（5’-GCAGCAGT- CTAAT-3’）通過PCR擴增樣品的V3～V4區(qū)域。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%瓊脂糖凝膠電泳驗證，Universal DNA純化試劑盒對目的條帶進(jìn)行回收。使用 NEBNext?Ultra? II DNA Library PrepKit制備文庫，Qubit進(jìn)行文庫定量，使用Illumina Novaseq高通量測序平臺測定腸道微生物群。對所有樣本有效Tags以97%的一致性進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類。對以上得到的有效數(shù)據(jù)使用QIIME2軟件中的DADA2模塊進(jìn)行降噪，并過濾豐度小于5的序列，從而獲得最終的ASVs（擴增子序列變異）以及特征表（序列在樣本中的豐度表）。使用QIIME2軟件中的classify-sklearn模塊將得到的ASVs與數(shù)據(jù)庫比對從而得到每個ASV的物種信息。根據(jù)OTU分類對腸道微生物的物種多樣性及物種差異進(jìn)行分析。

2.6 大鼠糞便中SCFAs含量測定

參照蔣愷憧等[11]建立的檢測方法，分別精密稱取乙酸、丙酸、丁酸和戊酸對照品適量，以乙醚配制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的對照品溶液，再稀釋成不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取大鼠糞便約0.2 g，加2 mL超純水混勻，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL，加入50%硫酸200 μL、無水乙醚2 mL，混勻，4 ℃、10 000 r/min離心30 min，取醚層進(jìn)氣相色譜檢測。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 遠(yuǎn)志甘草制前后主要成分定量分析

如表1所示，遠(yuǎn)志經(jīng)過甘草制后，球腺糖A和3,4,5-三甲氧基肉桂酸含量增加，而西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6、遠(yuǎn)志𠮿酮III、遠(yuǎn)志蔗糖酯B、3,6′-二芥子?；崽?、黃花遠(yuǎn)志素A、遠(yuǎn)志蔗糖酯A、遠(yuǎn)志蔗糖酯C、遠(yuǎn)志寡精H、遠(yuǎn)志寡精A、遠(yuǎn)志皂苷B含量降低。

3.2 遠(yuǎn)志甘草制前后對大鼠十二指腸組織中炎癥因子IL-6、IL-8和TNF-α水平的影響

如圖1所示，與空白組比較，遠(yuǎn)志低、高劑量組和制遠(yuǎn)志高劑量組大鼠十二指腸組織中炎癥因子IL-6、IL-8和TNF-α水平均顯著增加（＜0.05、0.01），而制遠(yuǎn)志低劑量組大鼠十二指腸組織中各炎癥因子水平無明顯變化。與等劑量遠(yuǎn)志組比較，制遠(yuǎn)志組大鼠十二指腸組織中炎癥因子水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。表明遠(yuǎn)志經(jīng)甘草制后可減輕大鼠腸道炎癥反應(yīng)。

表1 遠(yuǎn)志甘草制前后主要成分含量

Table 1 Contents of main components in Polygalae Radix before and after licorice processing

成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)/% 遠(yuǎn)志制遠(yuǎn)志 西伯利亞遠(yuǎn)志糖A50.432 0.393 西伯利亞遠(yuǎn)志糖A60.307 0.278 遠(yuǎn)志𠮿酮III0.782 0.718 球腺糖A0.253 0.332 遠(yuǎn)志蔗糖酯B0.276 0.239 3,6′-二芥子?；崽?.7041.426 黃花遠(yuǎn)志素A0.1100.094 遠(yuǎn)志蔗糖酯A0.8900.731 遠(yuǎn)志蔗糖酯C0.4120.370 3,4,5-三甲氧基肉桂酸0.1760.313 遠(yuǎn)志寡精H0.2930.214 遠(yuǎn)志寡精A0.5670.534 遠(yuǎn)志皂苷B4.9293.943

與空白組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與等劑量遠(yuǎn)志組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，圖5、6同

3.3 遠(yuǎn)志甘草制前后對大鼠小腸組織病理特征的影響

如圖2所示，空白組大鼠小腸腸壁完整且平坦，各層結(jié)構(gòu)比較清晰，小腸黏膜絨毛內(nèi)未見糜爛及潰瘍，炎細(xì)胞較少，絨毛內(nèi)血管略有充血，黏膜下及肌層未見明顯異常；遠(yuǎn)志低、高劑量組未見完整絨毛結(jié)構(gòu)，部分切片有淋巴組織增生現(xiàn)象，小腸黏膜絨毛內(nèi)可見大量炎細(xì)胞浸潤，絨毛黏膜上皮脫落、壞死，黏膜下及肌層未見炎細(xì)胞浸潤，并見血管擴張充血；制遠(yuǎn)志低劑量組可見完整絨毛結(jié)構(gòu)，小腸黏膜絨毛內(nèi)僅有微量炎細(xì)胞浸潤，血管擴張不明顯，黏膜下及肌層未見炎細(xì)胞浸潤；制遠(yuǎn)志高劑量組可見完整絨毛結(jié)構(gòu)，小腸黏膜絨毛內(nèi)有少量炎細(xì)胞浸潤，血管擴張不明顯，黏膜下及肌層未見炎細(xì)胞浸潤。表明遠(yuǎn)志經(jīng)甘草制后可減輕大鼠小腸組織的黏膜損傷和炎癥反應(yīng)。

3.4 遠(yuǎn)志甘草制前后對大鼠腸道菌群的影響

3.4.1 對大鼠腸道菌群α多樣性的影響 如表2所示，各組Coverage值均大于0.9，表明序列測序覆蓋良好。與空白組比較，各給藥組的Chao1、Ace、Shannon、Simpson指數(shù)均顯著降低（＜0.05、0.01）；與等劑量遠(yuǎn)志組比較，制遠(yuǎn)志組Chao1、Ace、Shannon、Simpson指數(shù)均顯著升高（＜0.05、0.01）。表明遠(yuǎn)志經(jīng)甘草制后能有效改善遠(yuǎn)志所致大鼠腸道菌群物種多樣性減少現(xiàn)象。

圖2 遠(yuǎn)志甘草制前后對大鼠小腸組織病理特征的影響(HE, ×100)

表2 遠(yuǎn)志甘草制前后對大鼠腸道菌群α多樣性的影響(, n = 6)

與空白組比較：P＜0.05P＜0.01；與等劑量遠(yuǎn)志組比較：P＜0.05P＜0.01

P< 0.05P< 0.01blank group;P< 0.05P< 0.01group with same dose

3.4.2 對大鼠腸道菌群β多樣性的影響 采用主成分分析（principal component analysis，PCA）比較不同樣本間的群落組成差異。提取各樣品的16S rDNA序列的主成分因子，繪制PCA圖（圖3）。結(jié)果顯示，與空白組的距離，制遠(yuǎn)志低劑量組最近，其次是制遠(yuǎn)志高劑量組，遠(yuǎn)志低、高劑量組與空白組的距離較遠(yuǎn)。說明遠(yuǎn)志顯著改變了大鼠腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，遠(yuǎn)志經(jīng)甘草制后可改善這一變化。

3.4.3 基于門水平的菌群結(jié)構(gòu)差異分析 如圖4-A所示，在門水平上，各組大鼠腸道菌群主要包括厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroides）、變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和放線菌門（Actinobacteriota），其中，以厚壁菌門豐度最高，其次是擬桿菌門。如圖5-A所示，與空白組比較，遠(yuǎn)志低、高劑量組厚壁菌門和疣微菌門豐度顯著降低（＜0.05、0.01），擬桿菌門、變形菌門、放線菌門的豐度顯著增加（＜0.050.01）；與等劑量遠(yuǎn)志組比較，制遠(yuǎn)志組厚壁菌門和疣微菌門豐度顯著增加（＜0.05、0.01），擬桿菌門、變形菌門和放線菌門豐度顯著降低（＜0.05、0.01），制遠(yuǎn)志低劑量組腸道菌群組成與空白組更相似。說明遠(yuǎn)志在門水平上可導(dǎo)致大鼠腸道菌群紊亂，而甘草制可一定程度地調(diào)節(jié)這一紊亂。

圖3 遠(yuǎn)志甘草制前后對大鼠腸道菌群β多樣性的影響

3.4.4 基于屬水平的菌群結(jié)構(gòu)差異分析 如圖4-B所示，各樣品組中相對豐度較高的菌屬為擬桿菌屬、乳酸桿菌屬、毛螺菌屬、毛螺菌屬-NK4A136、梭狀芽孢桿菌屬、普雷沃氏菌屬-UCG-001、雷爾氏菌屬和顫螺旋菌屬。如圖5-B所示，與空白組比較，遠(yuǎn)志低、高劑量組擬桿菌屬、-NK4A136和梭狀芽孢桿菌屬顯著增加（＜0.05、0.01），乳酸桿菌屬顯著減少（＜0.05、0.01），遠(yuǎn)志高劑量組毛螺菌屬、-UCG-001和顫螺旋菌屬顯著減少（＜0.01）。與等劑量遠(yuǎn)志組相比，制遠(yuǎn)志組乳酸桿菌屬、毛螺菌屬、顫螺旋菌屬的豐度顯著增加（＜0.05、0.01），擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬呈降低趨勢。說明遠(yuǎn)志甘草制后可上調(diào)有益菌乳酸桿菌屬、毛螺菌屬、顫螺旋菌屬的豐度，下調(diào)潛在的致病菌擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬的豐度。

圖4 腸道菌群分類門水平 (A)和屬水平 (B)的物種組成分析

圖5 腸道菌群分類門水平 (A)和屬水平 (B)的物種組成差異分析(, n = 6)

3.5 遠(yuǎn)志甘草制前后對大鼠糞便中SCFAs水平的影響

如圖6所示，與空白組比較，遠(yuǎn)志低、高劑量組大鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸和戊酸含量均顯著降低（＜0.05、0.01）；與等劑量遠(yuǎn)志組比較，遠(yuǎn)志經(jīng)甘草制后，乙酸、丙酸、丁酸和戊酸含量明顯回升（＜0.05、0.01）。說明遠(yuǎn)志可引起大鼠糞便中SCFAs水平紊亂，而甘草制可改善這一紊亂。

圖6 遠(yuǎn)志甘草制前后對大鼠糞便中SCFAs水平的影響(, n = 6)

4 討論

以往對遠(yuǎn)志炮制減毒研究主要聚焦在遠(yuǎn)志炮制前后成分、急性毒性和胃腸毒性變化方面，忽略了其對腸道菌群和SCFAs的影響。研究表明，腸道菌群失調(diào)，可誘導(dǎo)腸道免疫反應(yīng)，損傷腸道黏膜屏障能力，進(jìn)而導(dǎo)致腸道炎癥[12]。SCFAs可抑制腸道內(nèi)致病菌定植，維持腸上皮細(xì)胞形態(tài)、功能及腸道黏膜的完整性，并可調(diào)節(jié)機體的免疫炎癥反應(yīng)[13]。本研究表明，遠(yuǎn)志能夠?qū)е麓笫竽c道黏膜損傷和腸道炎癥，顯著升高大鼠十二指腸組織中炎癥因子水平，甘草制遠(yuǎn)志可改善遠(yuǎn)志導(dǎo)致的腸道炎癥和腸道黏膜損傷。

腸道菌群紊亂常表現(xiàn)為菌群多樣性的降低和結(jié)構(gòu)組成的變化[14]。本研究結(jié)果表明，遠(yuǎn)志可導(dǎo)致大鼠腸道菌群豐富度和多樣性減少，并可引起腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，而甘草制遠(yuǎn)志可不同程度改善遠(yuǎn)志導(dǎo)致的上述變化。遠(yuǎn)志可降低大鼠腸道中厚壁菌門和疣微菌門豐度，增加擬桿菌門、放線菌門、變形菌門豐度，可使正常大鼠腸道中有益菌乳酸桿菌屬、毛螺菌屬、顫螺旋菌屬豐度顯著降低，而潛在的致病菌擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬豐度顯著增加；遠(yuǎn)志經(jīng)甘草制后可在一定程度上調(diào)節(jié)遠(yuǎn)志引起的上述腸道菌群門、屬豐度變化，其調(diào)控結(jié)果與空白組更為接近。研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門有眾多有益菌，其中，乳酸桿菌有助于維護(hù)腸道微生態(tài)穩(wěn)定，但當(dāng)發(fā)生病毒感染和炎癥反應(yīng)時，腸道乳酸桿菌易受影響導(dǎo)致豐度下降[15]。變形菌門豐度提高會破壞腸道菌群穩(wěn)態(tài)，加劇腸道疾病進(jìn)展[16]。梭狀芽孢桿菌屬與腸道炎癥疾病的發(fā)生密切相關(guān)[17]。而乳酸桿菌屬作為腸道中重要的益生菌，在調(diào)節(jié)腸道菌群平衡方面發(fā)揮著重要的作用[18]。遠(yuǎn)志導(dǎo)致腸道內(nèi)有益菌與致病菌比例失調(diào)，打破腸道內(nèi)環(huán)境的平衡，引起腸道菌群紊亂。而遠(yuǎn)志經(jīng)甘草汁煮制后可通過上調(diào)有益菌豐度并減少致病菌數(shù)量，改善菌群結(jié)構(gòu)，從而維持腸道菌群平衡。遠(yuǎn)志甘草制后緩解腸道炎癥分析與甘草制可調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂有關(guān)。

厚壁菌門是腸道菌群中產(chǎn)生SCFAs的優(yōu)勢菌種，其下的梭菌科是產(chǎn)生丁酸的主要菌種[19]。SCFAs可調(diào)節(jié)腸道內(nèi)環(huán)境平衡，減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生[20]。SCFAs可緩解結(jié)腸炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，為結(jié)腸上皮細(xì)胞提供充足的能量，加快細(xì)胞增殖，從而增強腸道的免疫屏障[21]。丙酸能夠減少促炎因子的表達(dá)，有利于修復(fù)黏膜炎癥，還可提高腸上皮細(xì)胞閉鎖連接蛋白-1表達(dá)水平，從而提高腸道黏膜的屏障功能[22]。本研究結(jié)果表明，正常大鼠ig遠(yuǎn)志提取物后，其糞便中乙酸、丙酸、丁酸和戊酸水平顯著降低，而制遠(yuǎn)志提取物大鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸和戊酸水平較遠(yuǎn)志明顯回升，其原因分析與甘草制遠(yuǎn)志可調(diào)節(jié)腸道菌群有關(guān)。遠(yuǎn)志甘草制后降低腸道炎癥與甘草制可調(diào)節(jié)腸道SCFAs代謝紊亂有關(guān)。

課題組前期研究表明，遠(yuǎn)志經(jīng)甘草炆制后遠(yuǎn)志皂苷B含量顯著降低，并增加新成分甘草苷、甘草酸[23]。甘草中主要成分甘草苷和甘草酸具有抗炎作用[24]。另有研究報道，皂苷類成分為遠(yuǎn)志的主要毒性成分，遠(yuǎn)志總皂苷、遠(yuǎn)志皂苷B均可顯著增加兔離體腸管的收縮幅度，遠(yuǎn)志皂苷B對大鼠胃腸道刺激和損傷作用明顯大于細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷[25]。本研究結(jié)果表明，遠(yuǎn)志引起的腸道炎癥可能與其引起腸道菌群和SCFAs紊亂有關(guān)，甘草制遠(yuǎn)志可通過改善腸道菌群和SCFAs代謝來降低腸道炎癥反應(yīng)。據(jù)本研究結(jié)果結(jié)合文獻(xiàn)報道，推測遠(yuǎn)志甘草制后腸毒性降低可能與皂苷含量降低和輔料甘草的添加有關(guān)，有待深入研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of licorice-boiledon reducing intestinal inflammation based on intestinal flora and short-chain fatty acid metabolism

WANG Zi-yu, ZHANG Zhi-hui, WU Peng, LI Hao-ran, ZHAO Meng, HE Meng-jiao, ZHANG Xue-lan, ZHAO Xin

College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China

To study the effects of Yuanzhi () on intestinal flora and metabolism of short chain fatty acids (SCFAs) in normal rats before and after licorice processing, and explore the mechanism of licorice-boiledon reducing intestinal inflammation.SD rats were igor licorice-boiledfor 15 d, levels of inflammatory factors such as interleukin-6 (IL-6), IL-8 and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in duodenal tissue were detected by ELISA; Pathological changes of intestinal tissue were observed by hematoxylin-eosin staining; 16S rDNA sequencing technique was used to detect the structural changes of intestinal flora in rats; Contents of acetic acid, propionic acid, butyric acid and valeric acid in feces of rats were determined by gas chromatography (GC).Licorice-boiledsignificantly reduced the levels of IL-6, IL-8 and TNF-α in duodenal tissue and intestinal inflammatory damage caused by(< 0.05, 0.01).The results of 16S rDNA sequencing showed that licorice-boiledcould improve the structural changes of intestinal flora and decrease the species diversity caused byin rats. At the phylum level, the relative abundance of Firmicutes and Verrucomicrobia were increased (< 0.05, 0.01), while the relative abundance of Bacteroidetes, Proteobacteria and Actinobacteriota were decreased (< 0.05, 0.01). At the genus level, the abundance of beneficial bacteria such as,andwere increased (< 0.05, 0.01), and the abundance of potential pathogenic bacteria such asandwere decreased after licorice-boiling. Licorice-boiledcould reverse the decrease of acetic acid, propionate, butyric acid and valerate in rat feces caused byto a certain extent (< 0.05, 0.01).The intestinal inflammation caused bymay be related to the disorder of intestinal flora and SCFAs. Licorice-boiledcan reduce the intestinal inflammatory reaction by improving the metabolism of intestinal flora and SCFAs.

; licorice-boiled; intestinal inflammation; intestinal flora; short chain fatty acids; polygalaxanthone III; 3,6′-disinapoyl sucrose

R285.5

A

0253 - 2670(2023)14 - 4556 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.016

2023-02-27

國家自然科學(xué)基金面上項目（82173974）；國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制技術(shù)傳承地項目（國中醫(yī)藥科技中藥[2022]59號）；國家重點研發(fā)計劃課題（2018YFC1707204）

王梓宇（1997—），女，碩士研究生，研究方向為中藥炮制原理與飲片質(zhì)量控制。E-mail: wangziyu5899@163.com

張學(xué)蘭（1963—），女，博士生導(dǎo)師，教授，主要從事中藥炮制原理與飲片質(zhì)量控制研究。E-mail: zhang8832440@sina.com

趙 鑫（1991—），女，講師，主要從事中藥飲片制備技術(shù)與質(zhì)量控制研究。E-mail: 137462537@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]