王 璇，陳林珍，林瑞超，陳美琳，范琦琦，李芝奇，趙崇軍，李向日

重樓皂苷I對斑馬魚發(fā)育毒性、抗血管新生活性及其機制研究

王 璇，陳林珍，林瑞超，陳美琳，范琦琦，李芝奇，趙崇軍*，李向日*

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥品質(zhì)評價北京市重點實驗室/中藥炮制研究中心，北京 102488

基于模式生物斑馬魚研究重樓皂苷I的發(fā)育毒性、抗血管新生活性，并利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究重樓皂苷I抗血管新生的作用機制。將受精后6 h（6 h post fertilization，6 hpf）的斑馬魚胚胎暴露于不同濃度的重樓皂苷I中96 h，在實驗終點確認重樓皂苷I對斑馬魚胚胎的致死曲線，計算20%致死濃度（20% lethal concentration，LC20）。在實驗終點，以斑馬魚自主抽動次數(shù)、96 hpf心率、斑馬魚肝臟面積、靜脈竇-動脈球間距、總膽固醇（total cholesterol，T-CHO）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）含量等指標，結(jié)合吖啶橙、油紅O染色觀察綜合評價重樓皂苷I的發(fā)育毒性及其相關(guān)靶器官毒性。安全劑量條件下，以斑馬魚肝臟面積和靜脈竇-動脈球間距評價重樓皂苷I對相關(guān)靶器官的影響，同時以節(jié)間血管數(shù)評價重樓皂苷I對斑馬魚節(jié)間血管生長的影響。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測重樓皂苷I抗血管新生的作用機制并通過qRT-PCR技術(shù)進行驗證。重樓皂苷I對斑馬魚胚胎的致死曲線為＝270－23.62，LC20為0.16 μg/mL；在亞致死濃度暴露條件下的實驗終點，與對照組比較，0.16 μg/mL重樓皂苷I能夠誘導(dǎo)斑馬魚幼魚出現(xiàn)卵黃囊吸收延遲，脊柱彎曲，尾巴畸變等明顯的毒性特征，且T-CHO、TG、LDL-C含量明顯升高（＜0.05、0.01）；吖啶橙染色及油紅O染色表明0.16 μg/mL重樓皂苷I能引起斑馬魚肝臟細胞凋亡和脂肪變性。在安全劑量條件下，與對照組比較，0.06、0.09 μg/mL重樓皂苷I對主要臟器沒有明顯影響，但可以抑制節(jié)間血管數(shù)（＜0.01）。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)重樓皂苷I可通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、類固醇受體共激活因子（steroid receptor coactivator，SRC）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）等關(guān)鍵靶點，調(diào)控EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性等相關(guān)信號通路，進而發(fā)揮抗血管新生的作用，qRT-PCR實驗結(jié)果驗證了以上靶點。重樓皂苷I過高劑量使用會造成斑馬魚胚胎發(fā)育毒性，而在安全劑量條件下，重樓皂苷I通過調(diào)節(jié)EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性等相關(guān)通路發(fā)揮明顯的抗血管新生活性，為重樓皂苷I的臨床用藥安全及開發(fā)利用提供了思路，同時也為毒性中藥的“有效性-安全性”綜合評價提供了參考。

重樓皂苷I；斑馬魚；發(fā)育毒性；抗血管新生；血管內(nèi)皮生長因子A；雷帕霉素靶蛋白；類固醇受體共激活因子；表皮生長因子受體

毒性中藥是中藥臨床使用中的特色，且大多數(shù)毒性中藥在臨床疑難雜癥中發(fā)揮著顯著的治療作用。然而，目前大多數(shù)研究者更多關(guān)注于毒性中藥中活性物質(zhì)基礎(chǔ)篩選以及活性機制探討，對毒性中藥的安全性研究相對缺乏，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用中毒-效之間的聯(lián)系和轉(zhuǎn)化不明確，限制了毒性中藥的廣泛使用。因此，選擇合適的技術(shù)和方法對毒性中藥的毒-效進行同步評價，能夠為闡釋毒性中藥的內(nèi)涵和本質(zhì)特征、指導(dǎo)臨床安全使用提供參考。重樓皂苷I是中藥重樓中含量最高的甾體皂苷類成分[1]，具有抗炎[2]、抗腫瘤[3]、抗菌[4]和心血管保護[5]等作用，然而，重樓皂苷I也存在毒性報道，且多集中于肝毒性[6-7]、溶血作用[8]、生殖毒性[9]等，但目前未見胚胎發(fā)育毒性相關(guān)報道。同時，重樓皂苷I活性機制及毒-效關(guān)系尚不明確，一定程度上限制了其在臨床中的應(yīng)用。

血管新生是在原有血管的基礎(chǔ)上構(gòu)建新血管的過程[10]，腫瘤的增殖、分化依賴于血管新生，抗血管新生可能是治療癌癥的有效方法[11]。目前抗血管新生藥物及與血管新生有關(guān)的靶點識別已成為腫瘤靶向治療的重要研究方向之一[12]。研究表明，重樓皂苷I在抗腫瘤方面療效顯著[3]，但目前在其抑制血管新生方面研究較少。因此本研究對重樓皂苷I是否具有抗血管新生作用進行考察，并在假設(shè)成立的前提下對其作用機制進行初步探究，旨在為重樓皂苷I抗腫瘤治療提供新的思路。

斑馬魚與人類具有87%的基因同源性，其胚胎透明且實驗周期短，被廣泛應(yīng)用于藥物研究[13]，既具有細胞等體外實驗用藥量少、實驗費用低、高通量等特點[14]，又具備整體動物實驗可同步觀察多個器官、進行藥效學(xué)及安全性評價等優(yōu)勢[15-16]。因此，本研究以斑馬魚為模式生物，對重樓皂苷I的發(fā)育毒性及抗血管新生活性進行探究，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測重樓皂苷I抗血管新生的作用機制并通過qRT-PCR加以驗證，以期為重樓皂苷I的臨床用藥安全及開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物

AB系野生型斑馬魚和Tg（fabp10a:dsRed；ela3l:EGFP）、Tg（VHL:cmlc-gfp）熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚購自中國科學(xué)院水生生物研究所，由北京中醫(yī)藥大學(xué)斑馬魚實驗平臺養(yǎng)殖于集中式斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)。斑馬魚的養(yǎng)殖、繁育和實驗所需樣本的收集和處理均按照標準[17]進行。

1.2 藥品與試劑

重樓皂苷I（批號PCB153，質(zhì)量分數(shù)≥98%）購自德國Dr. Ehrenstorfer公司；總蛋白測定試劑盒（批號20220322）、總膽固醇（total cholesterol，T-CHO）試劑盒（批號20211023）、三酰甘油（triglyceride，TG）試劑盒（批號20210716）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒（批號20210719）購自南京建成生物工程研究所；4%多聚甲醛（批號p1110）購自北京生物科技有限公司；20×SSC緩沖液（批號DE0176）、丙二醇（批號0575-41）、油紅O染料（批號S19039）購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；丙三醇（批號1198677873）購自北京虹湖聯(lián)合化工產(chǎn)品有限公司；NaCl、KCl、Na2HPO4、K2HPO4、MgSO4、NaHCO3、CaCl2均為分析純，購自北京化工廠；TransZol Up Plus RNA Kit（批號ER501）、Fast King cDNA第一鏈合成試劑盒（批號KR116）購自蘭博利德生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

Stemi508型體視顯微鏡（卡爾·蔡司股份公司）；TE-2000-S型光學(xué)倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；HPG-280BX型光照培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)公司）；ESEN-AW-S型斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（北京愛生生物科技有限公司）；Gene5型酶標儀（伯騰儀器有限公司）；CFX96型Real-Time PCR System（美國Bio-Rad公司）；NanoDrop 2000型微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 給藥溶液的配制

參照課題組前期研究方法[18]配制斑馬魚胚胎養(yǎng)殖水和給藥溶液，精密稱取0.003 mg重樓皂苷I溶于200 μL的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解液（DMSO體積分數(shù)小于0.5%），充分搖勻后待完全溶解即為儲備液。實驗前，用胚胎培養(yǎng)液將儲備液稀釋至所需質(zhì)量濃度即可。

2.2 重樓皂苷I的安全性評價

2.2.1 重樓皂苷I的安全性評價及安全劑量的確定 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，將受精后6 h（6 h post fertilization，6 hpf）的健康胚胎隨機轉(zhuǎn)入含有不同濃度的重樓皂苷I溶液的12孔板中暴露96 h，以胚胎水為對照組，于藥物不同處理時間觀察并記錄胚胎死亡率和健康狀態(tài)。在實驗終點，利用Graph Pad Prism 9軟件繪制劑量-反應(yīng)曲線，計算20%致死濃度（20% lethal concentration，LC20）。

2.2.2 重樓皂苷I對不同發(fā)育階段斑馬魚胚胎主要臟器發(fā)育表型的影響 在安全劑量條件下（＜LC0）暴露給藥，觀察藥物暴露24、48、72、96 hpf后胚胎的發(fā)育情況與形態(tài)變化，并拍照記錄；于倒置顯微鏡下觀察各劑量組斑馬魚幼魚心臟發(fā)育情況，錄像記錄各劑量組24 hpf時1 min內(nèi)胚胎魚尾的自主抽動次數(shù)（＝6）及96 hpf時斑馬魚幼魚10 s內(nèi)心臟跳動次數(shù)（＝6）；每組收集80尾幼魚樣本，于PBS（1∶9）中勻漿，2500 r/min離心10 min，取上清液按照試劑盒說明書測定T-CHO、TG、LDL-C水平；暴露終點時，使用2.5 μg/mL吖啶橙染色確認重樓皂苷對主要臟器的影響；通過油紅染色方法確認主要臟器脂肪堆積狀態(tài)。

2.3 重樓皂苷I的抗血管新生活性評價

在安全劑量條件下（＜LC0）進行暴露給藥，同時設(shè)置對照組（斑馬魚培養(yǎng)水），在實驗暴露終點，于倒置顯微鏡下觀察各濃度組斑馬魚的節(jié)間血管、肝臟及心臟表型，拍照記錄。觀察完整體節(jié)間血管（intersegmental vessel，ISV）和缺陷ISV的形態(tài)，手動統(tǒng)計各組ISV數(shù)目，以評估重樓皂苷I的抗血管新生活性；斑馬魚的SV-BA距離即靜脈竇（sinusvenosus，SV）和動脈球（bulbus arteriosus, BA）的間距，若斑馬魚心臟受到影響，其心房和心室的位置將發(fā)生改變，SV-BA距離隨之改變，故以此作為本研究心臟毒性評估指標，用Image J軟件測量各濃度組SV-BA距離及肝面積變化。

2.4 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究重樓皂苷I抗血管新生的作用機制

2.4.1 活性靶點預(yù)測及抗血管新生靶點獲取 通過PubChem（https: //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http://www. swisstargetprediction.ch/）中進行重樓皂苷I的靶點基因預(yù)測。以“antiangiogenic”在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）中篩選獲得抗血管新生的靶點基因。取重樓皂苷I靶點基因與抗血管新生靶點基因的交集作為重樓皂苷I發(fā)揮抗血管新生作用的潛在靶點基因，并運用Venny2.1（https:// string-db.org/）繪制Venny圖，通過STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，并利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

2.4.2 基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 將關(guān)鍵靶點基因輸入Metascape數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org/），獲得GO功能注釋及KEGG通路富集分析結(jié)果，并利用微生信平臺（http://www.bioinformatics.com. cn/login/）進行可視化分析。

2.4.3 qRT-PCR驗證 取“2.2.1”項下處理的斑馬魚，加入Trizol試劑提取總RNA后，通過凝膠電泳和紫外分光度計檢測RNA的完整性，再用FastKing cDNA合成試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行qRT-PCR分析。、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，）、類固醇受體共激活因子（steroid receptor coactivator，）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，）、、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，）、表皮生長因子受體2（epidermal growth factor receptor 2，）、趨化因子受體4（chemokine receptor 4，）、成纖維細胞生長因子2（fibroblast growth factor 2，）引物序列見表1。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因序列(5’-3’) β-actinF: GGCTGTGCTGTCCCTGTAT R: GGGCGTAACCCTCGTAGAT VEGFAF: TACATCCCGTCCTGTGTGGTTCTC R: TTGACCCGCAGCACCTCCATAG mTORF: GGGAGAGCGTATGAGAGAGGAGATG R: AAACTGGTGAAGGGCGTGATGTG SRCF: AACCGCAGTCCACCAGTAGAGG R: ACGCCGCCTAATATGCCGATTC EGFRF: CTGGACGAGACGGAAGAGGAGTATC R: GCTGAAGAAGGGCTTTGTGGAGAG JUNF: GAGAGCCAGGAGCGGATTAAAGC R: TGCGACTTCAGGGTCTTGACTTTG CASP3F: CGGAGACTGTGTGGACGCAAAG R: GAAGGCATGGGATTGAGGCTTGG ERBB2F: GAGGCTTATGTGATGGCAGGTGTAG R: CCGTATGGCATGAGCTGAGTAACC CXCR4F: ATGGACTTGTGGTGCTTGTGATGG R: AAATGGCAGGGTGAGGACAAACAG FGF2F: AAGGCATCTGTACCAACCGTTTCC R: AGTCGGGATACTTGCGGGATCTG

3 結(jié)果

3.1 重樓皂苷I的安全性評價

3.1.1 劑量-反應(yīng)曲線的繪制 依據(jù)統(tǒng)計藥物處理后96 hpf胚胎的死亡率，用GraphPad Prism 9軟件曲線擬合繪制劑量-反應(yīng)曲線（圖1-A），擬合所得曲線方程為＝270－23.62，2＝0.997 5可計算出LC20為0.16 μg/mL。

A-不同質(zhì)量濃度的重樓皂苷I處理24 h后斑馬魚幼魚的量-毒曲線 B-重樓皂苷I對不同發(fā)育階段斑馬魚胚胎發(fā)育影響的表型觀察 C-重樓皂苷I對斑馬魚胚胎24 h自主抽動次數(shù)及對幼魚96 h心率的影響 D-重樓皂苷I對T-CHO、TG及LDL-C含量的影響 E-吖啶橙和油紅O染色（圖E-a中箭頭表示肝細胞區(qū)域，圖E-b中箭頭表示肝臟脂肪變性區(qū)域） 與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.1.2 重樓皂苷I對不同發(fā)育階段斑馬魚胚胎主要臟器發(fā)育表型的影響 亞致死濃度暴露條件下，與對照組比較，各暴露組24、47、72 hpf的胚胎及幼魚未見明顯異常；96 hpf的0.16 μg/mL組幼魚均出現(xiàn)明顯的毒性特征，如卵黃囊吸收延遲，脊柱彎曲，尾巴畸變等（圖1-B）。與對照組比較，0.09、0.16 μg/mL組斑馬魚在24 hpf的1 min內(nèi)自主抽動次數(shù)及96 hpf的10 s內(nèi)心臟跳動次數(shù)差別不大，均無顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（圖1-C）；此外，0.16 μg/mL組中T-CHO、TG、LDL-C含量均明顯升高（＜0.05、0.01，圖1-D）。吖啶橙染色結(jié)果顯示，0.16 μg/mL組肝臟區(qū)域出現(xiàn)黃綠色熒光小點，表明存在肝細胞凋亡現(xiàn)象（圖1-E-a），同時油紅O染色結(jié)果顯示該濃度組斑馬魚肝臟區(qū)域呈現(xiàn)紅色，提示存在肝臟脂肪變性（圖1-E-b）。

3.2 重樓皂苷I的抗血管新生活性評價結(jié)果

安全劑量條件下，與對照組比較，各組斑馬魚肝臟均形態(tài)清晰，呈透明狀，未見明顯肝損傷（圖2-A），同時各組肝臟面積無顯著性差異（圖2-C）。斑馬魚的SV-BA距離，即SV和BA的間距，會在斑馬魚心臟受到影響后，隨心房和心室位置的改變而改變，而在本實驗中，各組SV-BA間距無顯著性差異（圖2-B、C）。然而，0.06、0.09 μg/mL組的節(jié)間血管新生缺失且雜亂、斷裂（圖2-D），同時節(jié)間血管數(shù)下降且與對照組存在顯著性差異（＜0.01，圖2-C）。

3.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測重樓皂苷I抗血管新生的作用機制

3.3.1 活性靶點預(yù)測及抗血管新生靶點獲取 重樓皂苷I在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫中共預(yù)測得靶點基因208個，在GeneCards數(shù)據(jù)庫中預(yù)測抗血管新生相關(guān)靶點共237個，將二者取交集所得重樓皂苷I發(fā)揮抗血管新生活性的24個潛在靶點基因（圖3-A）。將篩選基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，選取置信度＞0.4的蛋白互作關(guān)系數(shù)據(jù)并通過Cytoscape 3.7.2構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，得到度值前10位的關(guān)鍵靶點VEGFA、mTOR、SRC、EGFR、JUN、CASP3、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、ERBB2、CXCR4、FGF2（圖3-B）。

3.3.2 GO功能與KEGG通路分析 使用Metascape數(shù)據(jù)庫對10個關(guān)鍵靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并利用微生信平臺進行可視化分析（圖3-C、D）。

3.3.3 qRT-PCR驗證 如圖4所示，與對照組比較，0.06、0.09 μg/mL重樓皂苷I組、、、、、和mRNA表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；0.09 μg/mL組mRNA表達水平顯著升高（＜0.01），mRNA表達水平顯著降低（＜0.05）。

A-重樓皂苷I對斑馬魚肝臟影響的表型觀察 B-重樓皂苷I對斑馬魚心臟影響的表型觀察 C-重樓皂苷I對斑馬魚SV-BA間距、肝面積和節(jié)間血管數(shù)的影響 D-重樓皂苷I對斑馬魚節(jié)間血管的影響

A-重樓皂苷I成分與抗血管新生靶點取交集 B-交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點篩選 C-重樓皂苷I抗血管新生關(guān)鍵靶點的GO分析 D-重樓皂苷I抗血管新生關(guān)鍵靶點的KEGG分析

圖4 qRT-PCR驗證基因表達情況

4 討論

近年來，斑馬魚因其在基因組序列、信號通路、細胞分子機制方面與哺乳動物（包括人類）存在較高的一致性的顯著優(yōu)勢使其廣泛被應(yīng)用于中藥藥效及安全性評價中。此外，斑馬魚生命周期的短暫性、胚胎發(fā)育的透明性、發(fā)育階段的明確性等優(yōu)勢能夠為復(fù)雜化學(xué)體系中藥的多生物效應(yīng)提供準確的評價終點[19-20]?；诖?，本實驗以斑馬魚胚胎為模型，系統(tǒng)評價了重樓皂苷I的發(fā)育毒性及抗血管新生活性，以期為重樓的臨床安全使用以及其他毒性中藥的綜合評價提供參考。

安全性評價結(jié)果表明，在一定條件下（0.16 μg/mL）的重樓皂苷I暴露確實能夠引起幼魚出現(xiàn)明顯的毒性表型特征，同時主要能夠引起肝細胞凋亡、脂肪變性及部分生活功能指標顯著異常等，與前期課題組的研究結(jié)果一致。然而，在較低質(zhì)量濃度暴露條件下，重樓皂苷I不會引起斑馬魚肝臟和心臟表型出現(xiàn)明顯變化，卻能夠顯著抑制斑馬魚節(jié)間血管新生。本研究采用斑馬魚模型成功地對重樓皂苷I的“安全性-有效性”進行了系統(tǒng)評價，證明了斑馬魚在多生物學(xué)事件綜合評價中的顯著優(yōu)勢，也為其他毒性中藥的綜合評價提供了思路。

基于此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和qRT-PCR技術(shù)對重樓皂苷I抗血管新生機制做進一步探討，發(fā)現(xiàn)重樓皂苷I的抗血管生成活性可能與VEGFA、EGFR、FGF2、JUN、CASP3等10個關(guān)鍵靶點的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。GO生物功能分析結(jié)果顯示，細胞增殖、細胞信號調(diào)控、化學(xué)刺激等可能為重樓皂苷I抗血管新生的關(guān)鍵生物過程，涉及催化活性、受體結(jié)合等階段。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，重樓皂苷I可作用于EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染等通路，影響血管新生相關(guān)疾病發(fā)展過程。EGFR可抑制EGFR酪氨酸激酶活性，阻斷EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性信號通路，誘導(dǎo)細胞凋亡[21]；VEGF能促進血管通透性增加，其表達水平與原發(fā)腫瘤的大小、血管生成、淋巴管轉(zhuǎn)移等多種因素呈正相關(guān)[22]，其中VEGFA在腫瘤新生血管的生成中發(fā)揮主導(dǎo)作用，其與內(nèi)皮細胞增殖、血管通透性增加等密切相關(guān)[23]；mTOR信號通路下游為促血管生成性缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α），抑制mTOR表達有利于下調(diào)HIF-1α，進而發(fā)揮抗血管新生作用[24]；SRC信號傳導(dǎo)的激活通過上調(diào)各種腫瘤中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)促血管生成分子來促進血管生成[25]；凋亡性的Caspase具有特有的半胱氨酸酶活性，啟動者Caspase被激活，其他的執(zhí)行者Caspase，包括CASP3可以降解細胞成分并產(chǎn)生凋亡[26]；ERBB2為抗EGFR單克隆抗體的的生物標志物，研究表明ERBB2抑制劑在不同類型的腫瘤細胞中下調(diào)血管生成生長因子的表達或使抗血管生成因子上調(diào)[27]。CXCR4是一種G蛋白偶聯(lián)受體，在缺氧、應(yīng)激、損傷、損傷血管組織時表達上調(diào)[28]。FGF可以促進新生血管生成，為腫瘤生長提供營養(yǎng)，在FGFR配體中，F(xiàn)GF2已被報道具有促血管新生作用，能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞的增殖和遷移[29]。以上說明，重樓皂苷I可能是通過上述通路及作用靶點發(fā)揮抗血管新生作用，從而阻止疾病進一步發(fā)展。

綜上，本研究以重樓皂苷I為例，首次利用斑馬魚對其安全性和抗血管生成活性進行統(tǒng)一評價，證實了科學(xué)合理使用藥物，在發(fā)揮藥效的同時不會造成明顯的不良反應(yīng)。此外，本研究推測，重樓皂苷I發(fā)揮抗血管新生活性，其潛在機制可能與EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性信號通路等相關(guān)。為重樓皂苷I的臨床用藥安全及開發(fā)利用提供了思路，同時也為其他毒性中藥的“有效性-安全性”綜合評價提供了參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Developmental toxicity, anti-angiogenesis activity and mechanism of polyphyllin I on zebrafish

WANG Xuan, CHEN Lin-zhen, LIN Rui-chao, CHEN Mei-lin, FAN Qi-qi, LI Zhi-qi, ZHAO Chong-jun, LI Xiang-ri

Beijing Key Laboratory for Quality Evaluation of Chinese Materia Medica/Chinese Medicine Processing Research Center, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

To study the developmental toxicity and anti-angiogenesis of polyphyllin I based on the model organism zebrafish, and explore the anti-angiogenesis mechanism of polyphyllin I by network pharmacology.The zebrafish embryos 6 h post fertilization (6 hpf) were exposed to different concentrations of polyphyllin I for 96 h. The lethal curve of polyphyllin I on zebrafish embryos was confirmed at the end of the experiment, and 20% lethal concentration (LC20) was calculated. At the end point of the experiment, the developmental toxicity of polyphyllin I and its related target organ toxicity were comprehensively evaluated by the number of spontaneous twitches of zebrafish, the heart rate of 96 hpf, the liver area of zebrafish, the distance between venous sinus and arterial bulb, the contents of total cholesterol (T-CHO), triglyceride (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), and the observation of acridine orange and oil red O staining. Under the safe dose condition, effect of polyphyllin I on related target organs was evaluated by the liver area of zebrafish and the distance between venous sinus and arterial bulb, and effect of polyphyllin I on growth of zebrafish internode vessels was evaluated by the number of internode vessels. The mechanism of polyphyllin I against angiogenesis was predicted based on network pharmacology and verified by qRT-PCR technology.The lethal curve of polyphyllin I on zebrafish embryos was= 270－23.62, LC20was 0.16 μg/mL. The end point of the experiment under the sublethal concentration exposure, 0.16 μg/mL polyphyllin I showed obvious toxic characteristics such as delayed absorption of yolk sac, curvature of spine and tail distortion in larvae zebrafish, and the contents of T-CHO, TG and LDL-C were significantly increased (< 0.05, 0.01). Acridine orange and oil red O staining showed that 0.16 μg/mL polyphyllin I could induce liver cell apoptosis and steatosis. Compared with control group at safe dose, 0.06, 0.09 μg/mL polyphyllin I had no significant effects on main organs, but could inhibit the number of internode vessels (< 0.01). Network pharmacology prediction found that polyphyllin I could regulate the resistance of epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitors and other related signaling pathways by regulating vascular endothelial growth factor A (VEGFA), mammalian target of rapamycin (mTOR), steroid receptor coactivator (SRC), EGFR and other key targets, so as to play the role of anti-angiogenesis. The results of qRT-PCR experiment confirmed the above targets.Excessive dosage of polyphyllin I can cause developmental toxicity of zebrafish embryos. Under safe dose conditions, polyphyllin I exerts significant anti-angiogenesis activity by regulating EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance and other related pathways. This study provided a way of thinking for the safety and development of clinical drug use of polyphyllin I, and also provided a reference for the comprehensive evaluation of “efficacy-safety” of toxic traditional Chinese medicine.

polyphyllin I; zebrafish; developmental toxicity; anti-angiogenesis; vascular endothelial growth factor A; mammalian target of rapamycin; steroid receptor coactivator; epidermal growth factor receptor

R285.5

A

0253 - 2670(2023)14 - 4548 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.015

2023-02-01

國家自然科學(xué)基金資助項目（82204753）；國家中藥標準化項目（ZYBZH-Y-YN-44）

王 璇（2000—），碩士研究生，研究方向為中藥安全性評價及主要活性/毒性物質(zhì)基礎(chǔ)篩選。E-mail: wangxuan9962@163.com

趙崇軍（1988—），博士，助理研究員，研究方向為中藥安全性評價及主要活性/毒性物質(zhì)基礎(chǔ)篩選。E-mail: 1014256537@qq.com

李向日（1972—），博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥炮制、質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。E-mail: lixiangri@sina.com

[責任編輯 李亞楠]