張 曦，朱明芳，吳淑輝，張娟娟，鄭慧娥，王 云，鞠 強，Christos C. Zouboulis

基于TRPV1/AMPK通路探討石榴皮總多酚對亞油酸誘導的人皮脂腺細胞脂質(zhì)合成的影響

張 曦1, 2，朱明芳1*，吳淑輝1，張娟娟1，鄭慧娥1，王 云1，鞠 強3，Christos C. Zouboulis4

1. 湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005 2. 湖南工商大學體育與健康學院，湖南 長沙 410205 3. 上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院，上海 200127 4. 德國勃蘭登堡醫(yī)學院 勃蘭登堡健康科學學院 德紹城市醫(yī)院，德國 德紹 06847

探討石榴皮總多酚（pomegranate peel polyphenols，PPPs）對亞油酸（linoleic acid，LA）誘導的永生化人皮脂腺SZ95細胞脂質(zhì)合成的影響及其作用機制。體外培養(yǎng)SZ95細胞，運用LA誘導構建脂質(zhì)過度合成模型，采用CCK-8法檢測不同質(zhì)量濃度PPPs對SZ95細胞活力的影響；尼羅紅染色檢測細胞脂質(zhì)合成情況；qRT-PCR檢測瞬時受體電位香草酸亞型1（transient receptor potential vanilloid 1，）、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，）mRNA表達；Western blotting檢測TRPV1、AMPK、磷酸化AMPK（phosphorylated AMPK，p-AMPK）蛋白表達。采用siRNA進行細胞轉染，觀察沉默TRPV1后PPPs對LA誘導的SZ95細胞脂質(zhì)合成及TRPV1/AMPK通路的影響。1.25、2.5、5 μg/mL的PPPs對SZ95細胞活性無明顯影響，且均可顯著抑制LA誘導的脂質(zhì)過度合成（＜0.01），其中5 μg/mL PPPs的抑制效應最為明顯。與對照組比較，模型組細胞脂質(zhì)合成明顯增加（＜0.01），、mRNA表達及TRPV1、p-AMPK/AMPK蛋白表達水平均明顯降低（＜0.01）；PPPs對無LA誘導的SZ95細胞基礎脂質(zhì)合成無明顯影響，TRPV1、AMPK mRNA表達水平升高（＜0.01），但TRPV1、p-AMPK/AMPK蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義。與模型組比較，PPPs明顯減少LA誘導下的SZ95細胞脂質(zhì)合成（＜0.01），明顯提高、mRNA表達及TRPV1、p-AMPK/AMPK蛋白表達水平（＜0.05、0.01）。沉默TRPV1顯著增加了LA誘導下的SZ95細胞脂質(zhì)合成（＜0.01），并顯著減弱了PPPs對SZ95細胞脂質(zhì)過度合成的抑制（＜0.01），顯著降低其、的mRNA及TRPV1、p-AMPK/AMPK蛋白表達水平（＜0.05、0.01）。PPPs可有效抑制LA誘導的SZ95細胞脂質(zhì)合成，其作用機制可能與TRPV1/AMPK通路有關。

石榴皮總多酚；永生化人皮脂腺SZ95細胞；脂質(zhì)合成；痤瘡；瞬時受體電位香草酸亞型1；腺苷酸活化蛋白激酶

痤瘡是發(fā)生于人類毛囊皮脂腺的慢性炎癥性皮膚病，以粉刺、丘疹、膿皰、結節(jié)及囊腫為主要表現(xiàn)。皮脂腺大量分泌脂質(zhì)是痤瘡發(fā)生發(fā)展的必要前提，可進一步致角化異常、微生物增殖、誘發(fā)炎癥等，產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應，加重痤瘡表現(xiàn)[1-4]。目前，痤瘡發(fā)病率與疾病負擔位居全球皮膚病第2位[5]，也是我國就診率最高的皮膚病，截面統(tǒng)計發(fā)病率高達8.1%[6-7]，造成了較大的個人及社會負擔。但治療痤瘡的一線藥物及光電療法多具有明確不良反應、費用昂貴等問題，因此，越來越多國內(nèi)外學者致力于中草藥及其有效成分在痤瘡治療及調(diào)節(jié)皮脂方面的研究與開發(fā)[8]。

石榴皮為石榴科植物石榴L.的干燥果皮，性溫，味酸、澀，歸大腸經(jīng)，除澀腸止瀉外，還具有調(diào)血脂、治瘤瘡等功效[9]。石榴皮總多酚是石榴皮中多酚類物質(zhì)總稱，包括鞣花酸、安石榴苷、安石榴林等活性成分，結構穩(wěn)定，生物利用度高，具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化、促進皮膚愈合、改善糖脂代謝紊亂等多重藥理功效[10-12]?，F(xiàn)代研究表明石榴皮提取物具有抑制脂肪酶活性及抗角質(zhì)形成細胞增殖的作用[13]。同時，本課題組前期動物實驗結果表明石榴皮總多酚具有抑制皮脂腺增生、抗角化、抗炎、抑菌等多重抗痤瘡作用，提出石榴皮總多酚在治療痤瘡方面具有良好的作用效果及研究前景[14-22]。但痤瘡作為人類特有的皮脂腺疾病，動物模型無法完全模擬其生理病理變化，石榴皮總多酚是否影響人皮脂腺細胞脂質(zhì)合成及其作用機制尚不明確。

瞬時受體電位香草酸亞型1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）在人類皮脂腺細胞原位表達，能選擇性地抑制永生化人皮脂腺SZ95細胞增殖，減少花生四烯酸誘導的脂質(zhì)合成，在人類皮脂代謝中具有重要作用[23]。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）參與多種脂質(zhì)的合成、氧化、分解等代謝過程，是調(diào)控脂質(zhì)代謝的關鍵通路蛋白[24]。研究報道，TRPV1可通過激活AMPK抑制肝臟脂肪蓄積、參與葡萄糖等生物能量代謝，被認為是AMPK調(diào)控脂質(zhì)等活動的關鍵上游靶點[25-32]，而TRPV1在人類皮脂代謝中是否通過AMPK抑制皮脂合成及石榴皮總多酚是否通過TRPV1/AMPK通路發(fā)揮抑制皮脂作用尚不明確。因此，本研究采用亞油酸誘導SZ95細胞模擬痤瘡皮脂過度合成狀態(tài)，探討石榴皮總多酚是否通過激活TRPV1/AMPK抑制SZ95細胞脂質(zhì)合成，以期為石榴皮總多酚治療痤瘡的研究與推廣提供理論及實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞

SZ95細胞由德國勃蘭登堡醫(yī)學院Christos C. Zouboulis教授饋贈（國際專利號WO0046353）。

1.2 藥品與試劑

石榴皮總多酚（批號C0322107106，質(zhì)量分數(shù)≥70%）購自陜西開普勒生物科技有限公司；Sebomed基礎培養(yǎng)基（批號F8205）、CaCl2（批號C5670）、亞油酸（批號L1012）購自美國Sigma公司；胎牛血清（批號10270-106）、人表皮生長因子（批號PHG0311）、Opti-MEM培養(yǎng)基（批號31985-062）購自美國Gibco公司；青鏈霉素混合液（批號P1400）、PBS（批號P1010）、0.25%胰蛋白酶（批號T1350）、CCK-8（批號CA1210）、尼羅紅（批號N8440）、二乙酸熒光素（FDA，批號F804）、抗熒光衰減封片劑（含DAPI，批號S2110）、dNTP Mix（10 mmol/L，批號PC2200）、Triton X-100（批號T8210）、DNase/ RNase-Free Water（批號R1600）購自北京索萊寶科技有限公司；Lipofectamine?RNAiMAX（批號13778030）購自美國Invitrogen公司；Trizol（批號15596026）購自美國Ambion公司；反轉錄試劑盒（批號RR047A）購自日本Takara公司；TRPV1抗體（批號GTX10296）購自美國GeneTex公司；AMPK抗體（批號5831T）、磷酸化AMPK（phosphorylated AMPK，p-AMPK）抗體（批號2535T）購自美國CST公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號PAB36269）購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；山羊抗兔二抗（批號SA00001-2）購自美國Proteintech公司。

1.3 儀器

311型CO2恒溫培養(yǎng)箱、F3型移液器（美國Thermo Fisher Scientific公司）；DMIL LED型倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）；EnSpire型全功能微孔板檢測儀（美國PerkinElmer公司）；Icen-24R型高速冷凍離心機（杭州奧盛儀器有限公司）；CFX-Connect 96型熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；DYY-6C型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽、DYCZ-40D型轉膜儀（北京六一生物科技有限公司）；ChemiScope 6100型化學發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學儀器有限公司）。

2 方法

2.1 藥物儲存液配制

石榴皮總多酚溶解于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的儲存液，?20 ℃分裝保存，實驗時用Sebomed基礎培養(yǎng)基稀釋至相應質(zhì)量濃度。亞油酸溶解于DMSO，制成濃度為0.1 mol/L的溶液，?20 ℃分裝保存，實驗時用Sebomed基礎培養(yǎng)基稀釋為0.1 mmol/L。

2.2 細胞培養(yǎng)及模型建立

SZ95細胞在添加10%胎牛血清、5 μg/L表皮生長因子、1%青鏈霉素混合液、1 mmol/L CaCl2的Sebomed基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。待SZ95細胞生長至融合度70%～80%后進行實驗，對照組加入0.1% DMSO，模型組加入0.1 mmol/L亞油酸誘導構建脂質(zhì)過度合成模型，其余細胞按照分組情況分別加入相應藥物[33]。

2.3 siRNA細胞轉染

將生長狀態(tài)良好的SZ95細胞以4×105個/孔接種于6孔板，24 h后細胞融合度達到70%左右時進行轉染操作。轉染時取100 pmol siRNA稀釋于250 μL Opti-MEM中，混勻孵育后加入已混勻孵育的含5 μL Lipofectamine?RNAiMAX的250 μL Opti-MEM中，混勻孵育20 min。將500 μL復合物加到含有細胞和新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)板孔中轉染4 h，更換新鮮培養(yǎng)基后培養(yǎng)48 h。由廣州市銳博生物科技有限公司設計3組TRPV1-siRNA序列（siRNA-1：5’-TGACGAGCA- TGTACAATGA-3’，siRNA-2：5’-CCCGATAGCTCCT- ACAACA-3’，siRNA-3：5’-TGGAGACTATTTCCGA- GTT-3’）。不同siRNA序列轉染SZ95細胞后通過qRT-PCR及Western blotting檢測轉染后mRNA及蛋白表達情況，確定最終使用的siRNA序列。

2.4 CCK-8法檢測細胞活力

將生長狀態(tài)良好的SZ95細胞以3×103個/孔接種于96孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，細胞貼壁后，每孔加入新鮮配制的不同質(zhì)量濃度石榴皮總多酚溶液（參考文獻報道[13,34-35]，設置梯度質(zhì)量濃度1.25、2.5、5、10、20、40、80 μg/mL），并設置對照組及僅有培養(yǎng)基無細胞的調(diào)零組，分別培養(yǎng)12、24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在37 ℃細胞培養(yǎng)箱孵育2 h后，采用酶標儀測定450 nm處各孔的吸光度（）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝(實驗－調(diào)零)/(對照－調(diào)零)

2.5 細胞分組

設置對照組、模型組（0.1 mmol/L亞油酸）和石榴皮總多酚（1.25、2.5、5 μg/mL）組，檢測不同質(zhì)量濃度的石榴皮總多酚對亞油酸誘導的SZ95細胞脂質(zhì)合成及TRPV1/AMPK通路的影響。

設置對照組、石榴皮總多酚（5 μg/mL）組、模型組（0.1 mmol/L亞油酸）和亞油酸（0.1 mmol/L）＋石榴皮總多酚（5 μg/mL）組，檢測石榴皮總多酚對SZ95細胞基礎脂質(zhì)合成及亞油酸誘導的脂質(zhì)合成的影響，以及對TRPV1/AMPK通路的作用。

設置NC-siRNA＋亞油酸組（轉染陰性對照siRNA后給予0.1 mmol/L亞油酸）、TRPV1-siRNA＋亞油酸組（轉染特異性TRPV1-siRNA后給予0.1 mmol/L亞油酸）、NC-siRNA＋亞油酸+石榴皮總多酚組（轉染陰性對照siRNA后給予0.1 mmol/L亞油酸＋5 μg/mL石榴皮總多酚）、TRPV1-siRNA＋亞油酸＋石榴皮總多酚組（轉染特異性TRPV1-siRNA后給予0.1 mmol/L亞油酸＋5 μg/mL石榴皮總多酚），進一步觀察石榴皮總多酚是否通過靶向調(diào)節(jié)TRPV1調(diào)控AMPK磷酸化影響SZ95細胞脂質(zhì)合成。

2.6 尼羅紅熒光染色法檢測細胞脂質(zhì)合成情況

將生長狀態(tài)良好的SZ95細胞以2×104個/孔接種于適用24孔板的爬片，次日根據(jù)分組加入不同刺激物，孵育48 h后棄去上清，4%多聚甲醛室溫固定，每孔加入10 μg/mL尼羅紅染料，加入0.5% Triton X-100，室溫避光孵育5 min后滴加抗含DAPI的熒光衰減封片劑，蓋玻片封片。熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，尼羅紅激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長565 nm；DAPI激發(fā)波長358 nm，發(fā)射波長461 nm[33]。

將生長狀態(tài)良好的SZ95細胞以3×103個/孔接種于黑色底透型96孔板中，次日根據(jù)分組加入不同刺激物，培養(yǎng)48 h后棄上清，每孔加入10 μg/ml尼羅紅染料，另設相應孔加入15 μg/mL FDA染料。通過全功能微孔板檢測儀檢測，尼羅紅激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長565 nm；FDA激發(fā)波長494 nm，發(fā)射波長523 nm。脂質(zhì)合成結果用尼羅紅和FDA的比值確定。

細胞內(nèi)脂質(zhì)合成率＝實驗組比值/對照組比值

2.7 qRT-PCR檢測TRPV1和AMPK mRNA表達

收集細胞加入Trizol提取總RNA，使用反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，進行PCR擴增，檢測各組細胞目的基因mRNA表達水平。檢測反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，循環(huán)40次。以為內(nèi)參，目的基因mRNA相對表達量以2?ΔΔCt表示。引物由武漢天一華煜基因科技有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

引物序列(5’-3’)長度/bp TRPV1F: CTTGTTCGGGTTTTCCAC270 R: TTGAGCAGGAGGATGTAGGT AMPKF: CAAGGGCACGCCATACC201 R: GATTCTTCCTTCGTACACGCA GAPDHF: GGGAAACTGTGGCGTGAT299 R: GAGTGGGTGTCGCTGTTGA

2.8 Western blotting檢測TRPV1、AMPK和p-AMPK蛋白表達

收集細胞，每1×106個細胞加入200 μL含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，充分裂解、離心、取上清，BCA法測定蛋白濃度。調(diào)整蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，煮沸變性，電泳，轉膜，封閉。分別加入TRPV1（1∶1000）、AMPK（1∶1000）、p-AMPK（1∶1000）及β-actin（1∶5000）抗體孵育過夜，洗膜3次；加入二抗（1∶6000）室溫孵育1 h，洗膜3次，采用化學發(fā)光系統(tǒng)ECL試劑盒顯影成像。

2.9 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 石榴皮總多酚質(zhì)量濃度篩選

3.1.1 不同質(zhì)量濃度的石榴皮總多酚對SZ95細胞活力的影響 如圖1所示，與對照組比較，經(jīng)1.25、2.5、5 μg/mL石榴皮總多酚處理12、24、48 h后的SZ95細胞活性均無明顯變化；10 μg/mL石榴皮總多酚處理24、48 h及20 μg/mL石榴皮總多酚處理48 h后一定程度上促進了SZ95細胞增殖（＜0.01）；40、80 μg/mL石榴皮總多酚處理12、24、48 h后均明顯抑制了SZ95細胞活性（＜0.01）。因此，選取對SZ95細胞活性無影響的1.25、2.5、5 μg/mL石榴皮總多酚進行后續(xù)實驗。

3.1.2 不同質(zhì)量濃度的石榴皮總多酚對亞油酸誘導的SZ95細胞脂質(zhì)合成的影響 如圖2所示，與對照組比較，模型組尼羅紅染色熒光強度顯著增強，脂質(zhì)合成率顯著增加（＜0.01），即亞油酸的誘導明顯增加了SZ95細胞的脂質(zhì)合成；與模型組比較，石榴皮總多酚（1.25、2.5、5 μg/mL）組尼羅紅熒光強度均明顯減弱，脂質(zhì)合成率均顯著降低（＜0.01），即上述質(zhì)量濃度石榴皮總多酚均減少了亞油酸誘導的SZ95細胞脂質(zhì)合成，其中以5 μg/mL石榴皮總多酚組的熒光強度最低，脂質(zhì)合成率最小，即抑制脂質(zhì)合成效應最為明顯，因此選擇5 μg/mL石榴皮總多酚為后續(xù)實驗質(zhì)量濃度。

PPP-石榴皮總多酚 與對照組比較：**P＜0.01

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01，圖3～5同

3.2 石榴皮總多酚對亞油酸誘導下SZ95細胞的影響

3.2.1 石榴皮總多酚對SZ95細胞基礎脂質(zhì)合成及亞油酸誘導下脂質(zhì)合成的影響 如圖3所示，與對照組比較，石榴皮總多酚處理下SZ95細胞紅色熒光強度無明顯差異，提示石榴皮總多酚對SZ95細胞基礎脂質(zhì)合成無明顯影響；模型組SZ95細胞熒光強度明顯增強，脂質(zhì)合成率顯著增加（＜0.01），即亞油酸誘導下SZ95細胞脂質(zhì)合成明顯增加。與模型組比較，亞油酸＋石榴皮總多酚組熒光強度明顯減弱，脂質(zhì)合成率顯著減少（＜0.01），即石榴皮總多酚明顯減少了亞油酸誘導下的SZ95細胞脂質(zhì)合成。表明石榴皮總多酚可抑制亞油酸誘導下的脂質(zhì)過度合成，且不影響無亞油酸誘導的SZ95細胞基礎脂質(zhì)合成。

圖3 石榴皮總多酚對SZ95細胞基礎脂質(zhì)合成及亞油酸誘導下脂質(zhì)合成的影響(, n = 4)

3.2.2 石榴皮總多酚對SZ95細胞TRPV1/AMPK通路的影響 如圖4所示，與對照組比較，模型組和mRNA表達水平均顯著降低（＜0.01），TRPV1和p-AMPK/AMPK蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；石榴皮總多酚組和mRNA表達水平均顯著升高（＜0.01），TRPV1和p-AMPK/AMPK蛋白表達水平有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。與模型組比較，亞油酸＋石榴皮總多酚組和mRNA表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01），TRPV1和p-AMPK/ AMPK蛋白表達水平均顯著升高（＜0.05）。各組間AMPK表達差異無統(tǒng)計學意義。提示亞油酸可能通過抑制TRPV1及AMPK磷酸化誘導SZ95細胞脂質(zhì)過度合成，而石榴皮總多酚可能通過激活TRPV1及磷酸化AMPK抑制亞油酸誘導下的SZ95細胞脂質(zhì)合成。

3.3 沉默TRPV1后石榴皮總多酚對亞油酸誘導的SZ95細胞的影響

3.3.1 不同siRNA序列轉染SZ95細胞對mRNA及蛋白表達的影響 如圖5所示，與對照組比較，NC-siRNA組mRNA及蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3組mRNA表達和蛋白表達均明顯降低（＜0.01），其中siRNA-1組mRNA及蛋白表達水平最低，提示siRNA-1沉默效果較好，因此選擇siRNA-1用于后續(xù)實驗。

3.3.2 沉默TRPV1后石榴皮總多酚對亞油酸誘導的SZ95細胞脂質(zhì)合成的影響 如圖6所示，與NC-siRNA＋亞油酸組比較，TRPV1-siRNA＋亞油酸組尼羅紅染色熒光強度增強，脂質(zhì)合成率增加（＜0.01），即沉默TRPV1增加了亞油酸誘導下SZ95細胞脂質(zhì)合成；NC-siRNA＋亞油酸＋石榴皮總多酚組熒光強度明顯減弱，脂質(zhì)合成率顯著減少（＜0.01），即石榴皮總多酚在未沉默TRPV1情況下可抑制亞油酸誘導的SZ95細胞脂質(zhì)合成；與NC-siRNA＋亞油酸＋石榴皮總多酚組比較，TRPV1-siRNA＋亞油酸＋石榴皮總多酚組尼羅紅染色熒光強度明顯增強，脂質(zhì)合成率顯著增加（＜0.01）；而與TRPV1-siRNA＋亞油酸組比較，TRPV1-siRNA＋亞油酸＋石榴皮總多酚組尼羅紅染色熒光強度及脂質(zhì)合成率無明顯差異，提示石榴皮總多酚至少部分依賴于激活TRPV1以抑制亞油酸誘導下的皮脂合成。

圖4 石榴皮總多酚對SZ95細胞TRPV1、AMPK mRNA和蛋白表達的影響(, n = 3)

與NC-siRNA組比較：**P＜0.01

與NC-siRNA＋亞油酸組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與NC-siRNA＋亞油酸＋石榴皮總多酚組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，圖7同

3.3.3 沉默TRPV1后石榴皮總多酚對亞油酸誘導的SZ95細胞TRPV1/AMPK通路的影響 如圖7所示，與NC-siRNA＋亞油酸組比較，TRPV1-siRNA＋亞油酸組、mRNA表達水平顯著降低（＜0.01），TRPV1、p-AMPK/AMPK蛋白表達水平顯著降低（＜0.05）；NC-siRNA＋亞油酸＋石榴皮總多酚組、mRNA表達水平顯著升高（＜0.01），TRPV1和p-AMPK/AMPK蛋白表達水平顯著升高（＜0.05、0.01）。與NC-siRNA＋亞油酸＋石榴皮總多酚組比較，TRPV1-siRNA＋亞油酸＋石榴皮總多酚組、mRNA表達水平顯著降低（＜0.01），TRPV1、p-AMPK/AMPK蛋白表達水平顯著降低（＜0.05、0.01）。而與TRPV1-siRNA＋亞油酸組比較，TRPV1-siRNA＋亞油酸＋石榴皮總多酚組、mRNA及TRPV1、p-AMPK/AMPK蛋白表達無明顯差異。各組間AMPK表達差異無統(tǒng)計學意義。提示沉默TRPV1顯著抑制AMPK磷酸化從而誘導SZ95細胞脂質(zhì)過度合成，而石榴皮總多酚抑制亞油酸誘導下皮脂合成的作用可能依賴于靶向調(diào)節(jié)TRPV1調(diào)控下游AMPK。

圖7 TRPV1-siRNA對石榴皮總多酚作用下亞油酸誘導的SZ95細胞TRPV1、AMPK mRNA及蛋白表達的影響 (,n = 3)

4 討論

人類皮脂主要通過皮脂腺中的皮脂腺細胞全漿分泌，生理狀態(tài)下具有滋潤皮膚、抗紫外線損傷等皮膚屏障功能[36]，皮脂缺乏可導致皮膚干燥、氧化損傷等皮膚屏障受損表現(xiàn)，而皮脂大量合成、皮脂成分改變等皮脂代謝紊亂將導致痤瘡等皮脂腺相關疾病的發(fā)生[37]。因此，藥物治療痤瘡應在抑制皮脂過度合成的同時避免影響生理狀態(tài)下的脂質(zhì)合成，以維持皮脂穩(wěn)態(tài)及正常的皮膚屏障功能。課題組前期于臨床中發(fā)現(xiàn)石榴皮組方外敷治療痤瘡具有控油保濕的功效[38]，之后針對石榴皮有效部位石榴皮總多酚進行了系列基礎研究，發(fā)現(xiàn)石榴皮總多酚具有抑制金黃地鼠皮脂腺斑增生的作用[17]，但動物模型不具備人類皮脂腺生理病理特點，永生化人皮脂腺細胞SZ95具有正常皮脂腺細胞的生理病理特征，是目前國際上皮脂腺相關研究最主要的細胞工具，故本研究運用SZ95細胞模擬痤瘡皮脂過度合成狀態(tài)，進一步探究石榴皮總多酚抗痤瘡的作用及機制。

本研究采用的誘導劑亞油酸為ω-6不飽和脂肪酸，在體內(nèi)與相應受體結合后將誘導皮脂腺細胞終末分化以促進皮脂合成，是模擬痤瘡皮脂過度合成狀態(tài)常用的誘導劑之一[39]。通過CCK-8初步篩選出對SZ95細胞活性無影響的1.25、2.5、5 μg/mL石榴皮總多酚進行干預后，尼羅紅熒光染色結果顯示亞油酸的誘導明顯增加了SZ95細胞的脂質(zhì)合成，1.25、2.5、5 μg/mL石榴皮總多酚均可抑制亞油酸誘導的SZ95脂質(zhì)過度合成，其中5 μg/mL石榴皮總多酚抑制效應最明顯，且對無亞油酸誘導的SZ95細胞基礎脂質(zhì)合成無明顯影響，一定程度上說明石榴皮總多酚可抑制SZ95細胞脂質(zhì)過度合成，而不影響生理狀態(tài)下的脂質(zhì)合成需求。

TRPV1是細胞膜上的陽離子通道蛋白，當其被激活時，以Ca2+為主的陽離子通過TRPV1進出細胞產(chǎn)生一系列生理、病理反應，與瘙癢、疼痛等皮膚、黏膜淺感覺密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，TRPV1特異性免疫信號在分化程度較高的皮脂腺細胞上更為突出，激活TRPV1可減少花生四烯酸誘導的皮脂過度合成[23,40]，且細胞內(nèi)Ca2+水平顯著影響SZ95細胞形態(tài)及數(shù)量，Ca2+螯合顯著促進皮脂腺分化[41]。同時，研究發(fā)現(xiàn)激活TRPV1可通過增加細胞內(nèi)Ca2+濃度，活化AMPK上游激酶鈣調(diào)蛋白激酶激酶2（calcium/calmodulin dependent protein kinase kinase 2，CaMKK2），從而磷酸化AMPK α亞基上的蘇氨酸172位點（T172），啟動一系列下游反應，參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成、分泌等代謝過程。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)石榴皮總多酚通過AMPK信號通路抑制金黃地鼠皮脂腺斑增生，本研究qRT-PCR及Western blotting結果顯示，亞油酸誘導下的SZ95細胞、mRNA及TRPV1、p-AMPK/AMPK蛋白表達水平均明顯降低；經(jīng)石榴皮總多酚干預后，顯著提高了在亞油酸誘導下降低的、mRNA及TRPV1、p-AMPK/AMPK蛋白表達，說明石榴皮總多酚抑制SZ95細胞脂質(zhì)過度合成的機制可能與激活TRPV1/AMPK有關。為明確這一結論，本研究進一步轉染siRNA沉默TRPV1后發(fā)現(xiàn)，SZ95細胞脂質(zhì)合成明顯增加，、mRNA及TRPV1、p-AMPK/AMPK蛋白表達水平均明顯降低，說明靶向沉默TRPV1抑制AMPK表達，進一步增加亞油酸誘導的SZ95細胞皮脂合成；而沉默TRPV1后石榴皮總多酚對脂質(zhì)合成的抑制效應亦明顯減弱，、mRNA及TRPV1、p-AMPK/AMPK蛋白表達水平明顯降低，說明石榴皮總多酚抑制亞油酸誘導下SZ95細胞脂質(zhì)合成的作用部分依賴于靶向調(diào)節(jié)TRPV1激活AMPK產(chǎn)生。

綜上，石榴皮總多酚能夠抑制亞油酸誘導下的脂質(zhì)過度合成，并且不影響SZ95細胞生理狀態(tài)下的基礎脂質(zhì)合成，調(diào)節(jié)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)。TRPV1/AMPK可能是治療痤瘡的創(chuàng)新性通路，而石榴皮總多酚抑制SZ95細胞脂質(zhì)過度合成的作用至少部分依賴于TRPV1/AMPK信號通路。本實驗仍存在局限，CCK-8多次重復結果顯示10、20 μg/mL石榴皮總多酚隨著干預時間延長顯著促進細胞增殖，而質(zhì)量濃度達到40 μg/mL時顯著抑制細胞活性，呈先促進后抑制表現(xiàn)，其具體機制值得進一步探究，后續(xù)也將進行石榴皮總多酚與一線藥物的效用及安全性比較，深入研究石榴皮總多酚對TRPV1/AMPK通路的具體調(diào)控機制。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effects of pomegranate peel polyphenols on linoleic acid-induced lipid synthesis in human sebocytes based on TRPV1/AMPK pathway

ZHANG Xi1, 2, ZHU Ming-fang1, WU Shu-hui1, ZHANG Juan-juan1, ZHENG Hui-e1, WANG Yun1, JU Qiang3, Christos C. Zouboulis4

1. The Second Affiliated hospital of Hunan university of Chinese medicine, Changsha 410005, China 2. School of Physical Education and Health Promotion, Hunan University of Technology and Business, Changsha 410205, China 3. Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200127, China 4. Staedtisches Klinikum Dessau, Brandenburg Medical School Theodore Fontane and Faculty of Health Sciences Brandenburg, Dessau 06847, Germany

To investigate the effect and mechanism of pomegranate peel polyphenols (PPPs) on lipid synthesis induced by linoleic acid (LA) in human immortalized SZ95 sebocytes.SZ95 sebocytes were culturedand lipid over-synthesis model were induced by LA. The effect of different concentrations of PPPs on viability of SZ95 sebocytes was measured by CCK-8 assay. Lipid content in cells was measured by nile red staining. qRT-PCR was used to detect the mRNA expressions of transient receptor potential vanilloid 1 () and adenosine monophosphate-activated protein kinase (). Western blotting was used to detect the protein expressions of TRPV1, AMPK and phosphorylated AMPK (p-AMPK). Cells were transfected with siRNA to observe the effect of PPPs on LA induced lipid synthesis and TRPV1/AMPK pathway in SZ95 sebocytes after TRPV1 silencing.PPPs (1.25, 2.5 and 5 μg/mL) had no significant effect on the viability of SZ95 sebocytes but significantly inhibited LA-induced lipid over-synthesis (< 0.01), and 5 μg/mL of PPPs had the most obvious inhibitory effect. Compared with control group, the lipid synthesis of cells was significantly increased in model group (< 0.01), mRNA expressions ofand, and protein expressions of TRPV1 and p-AMPK/AMPK were significantly decreased (< 0.01). PPPs had no significant effect on the basal lipid synthesis of SZ95 sebocytes without LA induction, and the mRNA expression levels ofandwere significantly increased (< 0.01), but there was no significant difference in the protein expression levels of TRPV1 and p-AMPK/AMPK. Compared with model group, PPPs significantly reduced the LA induced lipid synthesis in SZ95 sebocytes (< 0.01), and significantly increased mRNA expressions ofandand protein expressions of TRPV1 and p-AMPK/AMPK (< 0.05, 0.01). Silencing TRPV1 significantly increased the LA induced lipid synthesis in SZ95 sebocytes (< 0.01), significantly weakened the inhibition of PPPs on lipid over-synthesis in SZ95 sebocytes (< 0.01), significantly decreased the mRNA expression levels of,and protein expression levels of TRPV1 and p-AMPK/AMPK (< 0.05, 0.01).PPPs can effectively inhibit LA-induced lipid synthesis in SZ95 sebocytes, and its mechanism may be related to TRPV1/AMPK pathway.

pomegranate peel polyphenols; human immortalized SZ95 sebocytes; lipid synthesis; acne; transient receptor potential vanilloid 1; adenosine monophosphate-activated protein kinase

R285.5

A

0253 - 2670(2023)14 - 4538 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.014

2023-03-14

國家自然科學基金面上項目（82174375）；湖南省中醫(yī)藥科研計劃重點項目（C2022026）；湖南省衛(wèi)生健康委科研項目（202202124772）；湖南省自然科學基金科藥聯(lián)合項目（2023JJ60485）；血管生物學與轉化醫(yī)學湖南省重點實驗室（2023TP1018）；湖南省衛(wèi)生健康高層次人才學科帶頭人（湘衛(wèi)函[2023]78號）；湖南省“十四五”第一批中醫(yī)藥領軍人才培養(yǎng)對象（湘中醫(yī)藥[2022]4號）；湖南省研究生創(chuàng)新項目（CX20200767）

張 曦，博士，研究方向為中醫(yī)藥防治皮膚病。E-mail: 520171570@qq.com

朱明芳，博士，教授，研究方向為中醫(yī)藥防治皮膚病。E-mail: cszmf@163.com

[責任編輯 李亞楠]