何天雨，梅 茜，王曉麗，毛 靖，謝 輝，郭 勇，侯金才，陸兔林，毛春芹*

基于一測多評法含量測定及薄層鑒別的經(jīng)典名方竹茹湯顆粒劑的質(zhì)量評價研究

何天雨1，梅 茜1，王曉麗1，毛 靖1，謝 輝1，郭 勇2，侯金才2，陸兔林，毛春芹1*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023 2. 神威藥業(yè)集團有限公司，河北 石家莊 051430

建立經(jīng)典名方竹茹湯顆粒（Zhuru Decoction Granules，ZDG）特征圖譜及一測多評（quantitative analysis multi-components by single marker，QAMS）法測定其主要成分，優(yōu)化薄層色譜條件，建立同時鑒別葛根素和甘草苷的方法。優(yōu)化并確定HPLC最佳色譜條件并建立特征圖譜，以葛根素作為參照物，建立葛根素、3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、甘草苷、甘草酸的QAMS法，建立主要藥效成分葛根素及甘草苷同時鑒別的薄層條件。得到15批樣品特征圖譜與其對照圖譜的相似度均大于0.95；15批制劑運用QAMS法和外標法得到的各成分含量無顯著性差異，7種成分相對誤差均低于5%；通過穩(wěn)定性考察證明薄層檢測條件穩(wěn)定可行。該方法科學(xué)可行，穩(wěn)定可控，有助于經(jīng)典名方ZDG質(zhì)量控制方法的完善和提高，為經(jīng)典名方的質(zhì)量控制評價提供參考。

經(jīng)典名方；竹茹湯；特征圖譜；一測多評法；薄層鑒別；葛根素；甘草苷；3′-羥基葛根素；3′-甲氧基葛根素；葛根素芹菜糖苷；大豆苷；甘草酸

近年來，經(jīng)典名方成為中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點之一，國家藥監(jiān)局制定了《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑簡化注冊審批管理規(guī)定》[1]傳承發(fā)展中醫(yī)藥事業(yè)。竹茹湯出自宋代許叔微《普濟本事方》，位列《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》第35首，該方重用葛根升陽祛風(fēng)、升清降濁、生津清熱，半夏（姜汁漿水制）、竹茹、生姜用以安胃止嘔，同時發(fā)揮甘草（水炙）、大棗利脾健氣、調(diào)和諸藥的功效，六藥合用，共奏益胃清熱，臨床主要用于治療胃熱嘔吐，癥見手足心俱熱[2-5]。

中成藥復(fù)方制劑由多味中藥材組方而成，多成分協(xié)同作用，作用效果多靶點，目前多指標成分評價模式已被逐步應(yīng)用于相關(guān)質(zhì)量控制中[6-9]，但采用外標法進行多指標含量測定時，往往需要較多成分作為對照品，而對照品存在分離純度難度大，不易獲得，價格相對昂貴等問題限制了外標法在復(fù)方制劑多指標質(zhì)量控制和評價中的應(yīng)用。一測多評法（quantitative analysis multi-components by single marker，QAMS）利用中藥有效成分內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，以樣品中對照品廉價易得的常見成分為內(nèi)參物，計算出其他待測成分間的相對校正因子，實現(xiàn)多個待測成分的同步測定，具有操作成本低、簡單、快捷的優(yōu)點，適用于藥效成分復(fù)雜多樣的中藥及中藥制劑，符合中藥多成分、多功效的作用特點[10-13]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；Waters e2695型高效液相色譜儀，美國Waters公司；色譜柱為Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Merck Purospher Star LP RP-18End Capped柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；FA1104N型電子天平，上海菁海儀器有限公司；KQ-500B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q型純水機。

1.2 試藥

對照品葛根素（批號110752-201615，質(zhì)量分數(shù)95.4%）、6-姜辣素（批號111833-201303質(zhì)量分數(shù)≥98%）購自中國食品藥品檢定研究院；對照品3′-羥基葛根素（批號180102，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、3′-甲氧基葛根素（批號171204，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、葛根素芹菜糖苷（批號171216，質(zhì)量分數(shù)≥98%）均購自南京森貝伽生物科技有限公司；對照品大豆苷（批號20111016，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、大豆苷元（批號YY20101110，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、甘草苷（批號201027BA14，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、甘草酸單銨鹽（批號20120911，質(zhì)量分數(shù)≥98%）均購自上海源葉生物技術(shù)有限公司。甲醇，分析純，山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司；乙腈，色譜純，默克股份兩合公司；甲酸，色譜純，美國恩科公司；水為娃哈哈純凈水。其他試劑均為分析純。薄層板分別購于青島海洋化工有限公司、青島康業(yè)鑫有限公司、上海阿拉丁生化科技股份有限公司芯硅谷廠家。

竹茹湯由葛根、甘草、半夏、竹茹、生姜和大棗6味藥組成，均購自道地產(chǎn)區(qū)或主產(chǎn)區(qū)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定，其中葛根來自陜西，為豆科葛屬植物野葛(Willd.) Ohwi的干燥根；半夏來自江蘇泰州，為天南星科半夏屬植物半夏(Thunb.) Breit.的干燥塊莖；甘草來自甘肅榆中，為豆科甘草屬植物甘草Fisch.的干燥根和根莖；竹茹來自廣東廣寧，禾本科剛竹屬植物淡竹(Lodd.) Munro var.(Mitf.) Stapf ex Rendle的莖稈的干燥中間層；生姜來自四川沐川，為姜科姜屬植物姜Rosc.的新鮮根莖；大棗來自山西聞喜，為鼠李科棗屬植物棗Mill.的干燥成熟果實，甘草、半夏按課題組前期研究制定的《水炙甘草工藝及質(zhì)量標準》（草案）、《姜汁漿水制半夏工藝及質(zhì)量標準》（草案）炮制成符合要求的飲片。藥材及對應(yīng)飲片來源與批號見表1。竹茹湯顆粒（Zhuru Decoction Granules，ZDG），每袋質(zhì)量6 g，批號2022071301、2022071302、2022071303、2022071304、2022071305、2022071306、2022071307、2022071308、2022071309、202207131、2022120101、2022120102、2022120103、2022120104、2022120105，分別編號S1～S15，由神威藥業(yè)集團有限公司提供。

表1 藥材及對應(yīng)飲片來源

Table 1 Source of medicinal materials and corresponding decoction pieces

藥材產(chǎn)地飲片炮制標準 葛根陜西商洛《中國藥典》2020年版一部“葛根” 甘草甘肅榆中《水炙甘草炮制及質(zhì)量標準研究》（草案） 半夏江蘇泰州《姜汁漿水制半夏工藝及質(zhì)量標準研究》（草案） 竹茹廣東廣寧《中國藥典》2020年版一部“竹茹” 生姜四川沐川《中國藥典》2020年版一部“生姜” 大棗山西聞喜《中國藥典》2020年版一部“大棗”

2 方法與結(jié)果

2.1 ZDG的制備

分別稱取1份處方量竹茹湯（葛根13.77 g、甘草3.44 g、半夏3.44 g、竹茹3 g、生姜3 g、大棗3 g），加水600 mL，浸泡60 min，以紅外爐最大功率2200 W加熱至沸騰，調(diào)整火力至900 W，煎煮至半，趁熱采用80目篩濾過，放冷，定容至300 mL，即得竹茹湯基準樣品。

2.2 色譜條件

色譜柱為Kromasil 100-5C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫：0～4 min，0.5%～9.0%乙腈；4～15 min，9.0%～12.0%乙腈；15～20 min，12.0%乙腈；20～35 min，12.0%～16.0%乙腈；35～38 min，16.0%～23.0%乙腈；38～48 min，23.0%～30.0%乙腈；48～63 min，30.0%～75.0%乙腈；63～64 min，75.0～0.5%乙腈；體積流量為1 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量10 μL，檢測波長為280 nm。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液 精密稱取3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、甘草苷、甘草酸對照品適量，用甲醇稀釋，即得含3′-羥基葛根素244 μg/mL、葛根素1350 μg/mL、3′-甲氧基葛根素425 μg/mL、葛根素芹菜糖苷385 μg/mL、大豆苷750 μg/mL、甘草苷114 μg/mL、甘草酸176 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液 取裝量差異項下的ZDG，混勻，取適量，研細，取約0.50 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇10 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲10 min（功率250 W、頻率40 kHz），放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 陰性樣品溶液 按照處方比例［葛根13.8 g、甘草（水炙）3.4 g、半夏（姜汁漿水制）3.4 g、生姜3.0 g、竹茹3.0 g、大棗3.0 g］，按照前期課題組確定的顆粒劑制備方法分別制備缺葛根、缺甘草、缺生姜的陰性樣品，按照“2.3.2”項下方法制備，即得各陰性樣品溶液。

2.3.4 薄層對照品溶液 另取葛根素對照品，加甲醇制成含葛根素1 mg/mL的對照品溶液；另取甘草苷對照品，加甲醇制成含甘草苷1 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。

2.3.5 薄層供試品溶液 取ZDG 2 g，加甲醇30 mL，超聲處理（功率250 W、頻率50 kHz）30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。

吸取竹茹湯基準樣品5 mL，同法將其制備成竹茹湯基準樣品對照溶液。

2.3.6 薄層陰性樣品溶液 取葛根陰性顆粒2 g，同法將其制備成葛根陰性對照溶液；取甘草陰性顆粒2 g，同法將其制備成甘草陰性對照溶液。

2.4 特征圖譜建立

2.4.1 精密度試驗 取同一批ZDG樣品（批號2022071301）按照“2.3.2”項下方法制備成為供試品溶液，并按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，以5號峰（葛根素）為參照峰，計算所有共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果特征圖譜相似度＞0.98，特征峰的相對保留時間RSD均小于0.13%，相對峰面積RSD均小于0.82%，表明儀器的精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗 取同一批ZDG樣品（批號2022071301），按照“2.3.2”項下方法操作條件平行制備6份供試品溶液，并按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣，記錄色譜圖，以5號峰（葛根素）為參照峰，計算所有共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果特征圖譜相似度＞0.96，特征峰的相對保留時間RSD均小于0.13%，相對峰面積RSD均小于3.88%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批ZDG樣品（批號2022071301），按照“2.3.2”項下方法操作制備成為供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h在“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，以5號峰（葛根素）為參照峰，計算所有共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果特征圖譜相似度＞0.96，特征峰的相對保留時間RSD均小于0.05%，相對峰面積RSD均小于0.64%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 特征圖譜的建立及分析 將樣品所得色譜數(shù)據(jù)利用Chromeleon73軟件導(dǎo)出特征圖譜CDF格式，并導(dǎo)入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評個系統(tǒng)》（2012，130723版）軟件進行分析。

選擇分離度較好、純度較高且成分已知的5號峰（葛根素）作為ZDG特征圖譜的參照峰，計算其他共有峰的相對保留時間和相對峰面積。采用中位數(shù)法生成對照特征圖譜，設(shè)定S1為參照圖譜，時間窗寬度為0.1 mm，自動匹配后多點校正，進行全譜峰匹配，得到15批ZDG樣品（S1～S15）的對照特征圖譜（圖1）。

4-3′-羥基葛根素 5-葛根素 7-3′-甲氧基葛根素 8-葛根素芹菜糖苷 9-大豆苷 12-甘草苷 14-甘草酸

全方共確定15個共有峰，經(jīng)對照品、ZDG樣品、陰性樣品的相關(guān)圖譜（圖2）色譜峰比對，確定其中峰4為3′-羥基葛根素、峰5為葛根素、峰7為3′-甲氧基葛根素、峰8為葛根素芹菜糖苷、峰9為大豆苷、峰12為甘草苷、峰14為甘草酸。

1-3′-羥基葛根素 2-葛根素 3-3′-甲氧基葛根素 4-葛根素芹菜糖苷 5-大豆苷 6-甘草苷 7-甘草酸

計算15批ZDG樣品（S1～S15）與其對照特征圖譜的相似度分別為0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、1.000、0.999、0.999、0.998、0.999，均大于0.95，表明ZDG及制備工藝穩(wěn)定，不同批次間的差異較小。

2.5 指標成分含量測定方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.3.1”項下的混合對照品溶液（3′-羥基葛根素244 μg/mL、葛根素1350 μg/mL、3′-甲氧基葛根素425 μg/mL、葛根素芹菜糖苷385 μg/mL、大豆苷750 μg/mL、甘草苷114 μg/mL、甘草酸176 μg/mL）0.2、0.4、0.6、0.8、2.0 mL至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度線，制成系列混合對照品溶液II～VI。

將不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液I～VI，按照“2.2”項下色譜條件進樣測定，以對照品質(zhì)量濃度作為橫坐標（），峰面積積分值作為縱坐標（），繪制標準曲線，進行線性回歸得回歸方程：3′-羥基葛根素＝17 787＋299 860，＝0.999 8，線性范圍24.4～244.0 μg/mL；葛根素＝9 431.4＋93 790，＝0.999 4，線性范圍135.0～1 350.0 μg/mL；3′-甲氧基葛根素＝9 680.3－82 200，＝0.999 9，線性范圍42.5～425.0 μg/mL；葛根素芹菜糖苷＝10 184－59 226，＝0.999 9，線性范圍38.5～385.0 μg/mL；大豆苷＝10 472－193 440，＝0.999 9，線性范圍75.0～750.0 μg/mL；甘草苷＝6 857.0－9 627.4，＝0.999 6，線性范圍11.4～114.0 μg/mL；甘草酸＝2 737.0－11 248，＝0.999 9，線性范圍17.6～176.0 μg/mL；結(jié)果表明，各成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2 專屬性考察 精密吸取“2.3.3”項下陰性樣品溶液、“2.3.1”項下對照品溶液及“2.3.2”項下ZDG供試品溶液各5 μL，按確定的色譜條件進行測定，結(jié)果見圖2，結(jié)果顯示，在此條件下，ZDG中葛根、甘草和生姜的色譜峰分離較好，互不干擾，說明方中各藥味色譜峰的專屬性良好。

2.5.3 精密度試驗 精密吸取“2.3.1”項下混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次進行測定，測得3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、甘草苷、甘草酸峰面積的RSD分別為0.62%、0.59%、0.61%、0.64%、0.45%、0.80%、1.13%，說明儀器的精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液（批號2022071301），室溫下于制備后0、2、4、8、12、24 h在“2.2”項下色譜條件進樣測定，得3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、甘草苷、甘草酸峰面積的RSD分別為2.25%、1.06%、1.21%、1.41%、1.12%、1.21%、0.97%，結(jié)果表明供試品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗 取同一批樣品（批號2022071301），按照“2.3.2”項下條件平行制備6份供試品溶液，在“2.2”項下色譜條件進行測定，測得3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、甘草苷、甘草酸質(zhì)量分數(shù)的RSD分別為1.83%、0.85%、0.93%、0.76%、0.48%、0.83%、0.30%，說明該方法的重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗 取6份裝量差異項下的本品，混勻，取適量，研細，分別取約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，取與供試品等量的對照品，加50%甲醇至10 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W、頻率40 kHz）10 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

分別精密吸取供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，計算各成分的加樣回收率及其RSD。結(jié)果3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、甘草苷、甘草酸的平均加樣回收率分別為102.01%、97.36%、102.12%、99.57%、97.18%、96.96%、101.57%，RSD分別為0.40%、1.75%、0.82%、1.47%、1.63%、1.72%、0.87%，表明該方法的準確度良好。

2.6 QAMS建立

2.6.1 相對校正因子（s/i）的測定 按照“2.2”項下色譜條件，將“2.3.1”項下的混合對照品溶液分別進樣2、5、8、10、15、22 μL，記錄各成分峰面積，以葛根素為內(nèi)參物，采用多點校正法，按照公式s/is/fsC/ACs計算，其中s為葛根素對照品的峰面積，s為葛根素對照品的質(zhì)量濃度，A為待測成分峰面積，C為待測成分的質(zhì)量濃度。

分別計算3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、甘草苷、甘草酸的s/i，結(jié)果5個待測成分與內(nèi)參物s/i的RSD值均小于3%，結(jié)果見表2。

2.6.2 不同儀器和不同色譜柱考察 考察了Waters e2695和Agilent 1260 2種高效液相色譜儀及Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Merck Purospher Star LP RP-18End Capped柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）2種色譜柱對s/i的影響，并計算RSD，結(jié)果均小于2%，表明不同儀器和色譜柱適用性良好。結(jié)果見表3。

表2 各成分fs/i

Table 2 fs/i values of each component

進樣體積/μLf葛根素/3′-羥基葛根素f葛根素/3′-甲氧基葛根素f葛根素/葛根素芹菜糖苷f葛根素/大豆苷f葛根素/甘草苷f葛根素/甘草酸 20.552 20.512 70.545 00.548 70.361 50.145 6 50.553 10.514 50.545 80.555 40.364 30.145 0 80.554 70.516 60.547 30.553 80.369 90.145 1 100.555 00.517 80.548 70.555 40.373 60.145 3 150.547 00.524 20.555 40.563 10.379 10.147 4 220.531 50.542 40.570 70.586 90.382 30.153 5 平均值0.548 90.521 40.552 20.560 50.371 80.147 0 RSD/%1.642.111.772.452.192.25

表3 儀器及色譜柱對fs/i的影響

Table 3 Effect of instrument and chromatographic column on fs/i

儀器色譜柱f葛根素/3′-羥基葛根素f葛根素/3′-甲氧基葛根素f葛根素/葛根素芹菜糖苷f葛根素/大豆苷f葛根素/甘草苷f葛根素/甘草酸 WatersKromasil0.563 40.528 90.559 90.566 40.382 40.148 5 Merck0.556 10.524 20.555 40.563 10.379 10.147 4 Agilent 1260Kromasil0.566 20.520 10.551 20.570 10.380 30.146 9 Merck0.551 20.527 90.539 80.569 30.371 20.142 3 平均值 0.559 20.525 30.551 60.567 20.378 30.146 3 RSD/% 1.220.761.560.561.301.87

2.6.3 不同柱溫對s/i的影響 采用Waters e2695色譜儀和Kromasil C18色譜柱考察了柱溫23、25、27℃對s/i的影響，并計算其RSD，結(jié)果均小于3%，表明不同柱溫對各成分無顯著影響。結(jié)果見表4。

2.6.4 不同體積流量對s/i的影響 采用Waters e2695色譜儀和Kromasil C18色譜柱考察了體積流量為0.8、1.0、1.2 mL/min時對s/i的影響，并計算其RSD，結(jié)果均小于3%，表明不同體積流量的變化對各成分的s/i無明顯影響。結(jié)果見表5。

2.7 待測組分色譜峰定位

取混合對照品溶液，選取2只不同品牌色譜柱，按照“2.2”項下色譜條件測定，以葛根素為內(nèi)參物，計算其他6種成分相對保留時間（s/i），對待測組分進行定位，并計算RSD，結(jié)果各待測成分相對保留值得RSD均小于3%，表明采用相對保留值法對待測成分定位合理。結(jié)果見表6。

2.8 QAMS與外標法結(jié)果對比

取15批樣品，按照“2.3.3”項下條件制備供試品溶液，在“2.2”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，采用QAMS法建立內(nèi)參物葛根素與3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、甘草苷、甘草酸的s/i，對15批ZDG樣品中各成分進行含量測定，同時采用外標法對其進行含量測定，并以相對誤差來表示2種方法測得結(jié)果的差異，相對誤差＝(QAMS－外標法)/外標法（QAMS為QAMS測得的含量，外標法為外標法測得的含量）。結(jié)果見表7。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外標法與QAMS法計算所得到的組分含量基本一致，外標法實測含量值與QAMS法所測成分含量值無顯著性差異。QAMS法簡化了分析過程，降低分析成本，但在實際應(yīng)用中可能還存在著局限性[14-16]，為了使QAMS法在同時測定中藥多成分中得到廣泛應(yīng)用，還需對QAMS法相關(guān)技術(shù)進行深入研究。

表4 柱溫對fs/i的影響

Table 4 Effect of column temperature on fs/i

柱溫/℃f葛根素/3′-羥基葛根素f葛根素/3′-甲氧基葛根素f葛根素/葛根素芹菜糖苷f葛根素/大豆苷f葛根素/甘草苷f葛根素/甘草酸 230.561 30.531 10.562 80.570 00.384 70.149 4 250.556 10.524 20.555 40.563 10.379 10.147 4 270.578 10.538 10.551 60.570 90.388 20.148 5 平均值0.565 20.531 10.556 60.568 00.384 00.148 4 RSD/%2.041.301.020.751.190.66

表5 體積流量對fs/i的影響

Table 5 Effect of volume flow on fs/i

體積流量/(mg?mL?1)f葛根素/3′-羥基葛根素f葛根素/3′-甲氧基葛根素f葛根素/葛根素芹菜糖苷f葛根素/大豆苷f葛根素/甘草苷f葛根素/甘草酸 0.80.569 80.513 10.540 40.573 80.382 70.150 4 1.00.556 10.524 20.555 40.563 10.379 10.147 4 1.20.571 40.528 50.558 80.564 60.374 40.154 1 平均值0.565 80.521 90.551 50.567 20.378 70.150 6 RSD/%1.481.521.781.021.092.22

表6 各成分相對保留時間

Table 6 Relative retention time of each component

儀器色譜柱t葛根素/3′-羥基葛根素t葛根素/3′-甲氧基葛根素t葛根素/葛根素芹菜糖苷t葛根素/大豆苷t葛根素/甘草苷t葛根素/甘草酸 WatersKromasil0.404 90.530 30.662 60.652 81.141 81.459 3 Merck0.404 70.530 40.662 90.653 21.153 31.533 0 Agilent 1260Kromasil0.404 90.530 20.664 00.652 91.147 01.494 6 Merck0.404 80.530 10.662 70.653 01.143 31.472 5 平均值 0.404 80.530 30.663 10.653 01.146 41.489 8 RSD/% 0.020.020.100.030.452.16

表7 QAMS法與外標法測得15批ZDG中7種成分的質(zhì)量分數(shù)

Table 7 Mass concentrations of seven components in 15 batches of ZDG measured by QAMS and external standard methods

批號3′-羥基葛根素/(mg?g?1)3′-甲氧基葛根素/(mg?g?1)葛根素芹菜糖苷/(mg?g?1)葛根素/(mg?g?1) 外標法QAMS法相對誤差/%外標法QAMS法相對誤差/%外標法QAMS法相對誤差/% S18.4768.5080.37914.92014.968 0.321 14.56415.3584.83146.002 S28.6538.6900.43214.981 15.027 0.306 14.82415.5994.86646.160 S38.5098.5450.42714.762 14.808 0.311 13.87814.8464.77045.409 S48.4728.5060.40414.492 14.536 0.303 14.87315.0484.80145.552 S58.1048.1280.30314.629 14.676 0.320 14.37815.1744.86344.965 S68.4948.5280.40614.86314.9160.355 14.64015.4344.86745.652 S78.3058.3370.38014.59214.6420.341 14.42315.1654.86244.947 S88.3308.3630.39414.58314.6320.335 14.33815.1194.85744.890 S98.2108.2410.37414.44814.4950.324 14.19414.9994.86044.493 S108.0468.0720.32614.37014.4130.298 14.41014.8794.85644.210 S118.7058.7440.44915.02315.0720.325 14.74715.6004.86446.183 S128.6568.6930.42715.03715.0900.351 14.24715.6664.87146.257 S138.0738.0990.32114.38214.4290.326 14.13415.0044.86644.431 S148.2098.2420.40714.11314.1530.283 14.39914.6864.83443.971 S158.2298.2610.38614.14714.1900.303 14.51214.6694.80144.393 批號大豆苷/(mg?g?1)甘草苷/(mg?g?1)甘草酸/(mg?g?1) 外標法QAMS法相對誤差/%外標法QAMS法相對誤差/%外標法QAMS法相對誤差/% S114.56114.232?2.312 3.5473.6101.7786.4756.5240.755 S214.82214.497?2.242 3.4313.4841.5626.5316.5810.766 S313.88313.525?2.647 3.0093.0320.7786.4006.4490.768 S414.86914.553?2.171 3.4463.5021.6306.4776.5280.785 S514.36814.051?2.256 3.4183.4741.6466.3306.3780.765 S614.63814.311?2.285 3.4633.5201.6536.4396.4880.765 S714.42214.093?2.334 3.4173.4731.6216.2976.3450.760 S814.34014.007?2.377 3.4363.4931.6626.3056.3530.765 S914.19113.862?2.373 3.3343.3841.5106.3026.3520.790 S1014.41214.088?2.300 3.3683.4211.5876.2316.2800.783 S1114.75314.417?2.331 3.4963.5551.6756.5426.5930.768 S1214.25013.900?2.518 3.5023.5611.6816.5476.5970.764 S1314.12913.798?2.399 3.4543.5131.7156.2946.3440.793 S1414.40314.077?2.316 3.3493.4011.5626.1706.2180.778 S1514.50914.191?2.241 3.3673.4201.5646.1426.1880.739

2.9 薄層色譜鑒別

取“2.3.4”項對照品溶液、“2.3.5”項供試品溶液和“2.3.6”項陰性樣品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（20∶4.5∶0.5）為展開劑展開，取出，晾干，置于紫外燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見圖3-A。再噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置日光和紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見圖3-B、C。

3 討論

3.1 QAMS含量測定色譜條件考察

3.1.1 供試品溶液制備方法的考察 本實驗考察了提取溶劑（水及20%、50%、80%甲醇），結(jié)果發(fā)現(xiàn)選擇用50%甲醇作為提取溶劑，已提取完全，且峰型較好，基線也平穩(wěn)，因此綜合考慮，選用50%甲醇作為提取溶劑。超聲時間（10、15、20 min），結(jié)果顯示，10 min和15 min各共有峰峰面積無明顯差異，說明超聲10 min已經(jīng)提取完全，因此超聲時間定為10 min。

A-葛根成分顯色圖（紫外365 nm） B-甘草成分顯色圖（日光） C-甘草成分顯色圖（紫外365 nm） 1-葛根素對照品 2-甘草苷對照品 3-葛根陰性顆粒 4-甘草陰性顆粒 5-ZDG 2022071301 6-ZDG 2022071302 7-ZDG 2022071303 8-ZDG基準樣品

3.1.2 流動相篩選 本實驗考察了甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液等不同體系流動相，以ZDG中所測成分葛根素、3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、甘草苷、甘草酸分離效果為指標，結(jié)果表明，乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相色譜峰峰型較好，各峰之間的分離度良好，基線較平穩(wěn)，最終選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

3.1.3 檢測波長的選擇 本實驗測定的化學(xué)成分種類較多，分別考察了220、254、280 nm波長下的樣品譜圖，通過比較分析在280 nm下的峰數(shù)目，峰形、分離度、對稱因子、理論塔板數(shù)等參數(shù)，結(jié)果顯示在280 nm波長下檢測到的圖譜出峰較多，基線平穩(wěn)，峰形良好，且干擾少，故選擇以280 nm作為含量測定波長。

3.1.4 內(nèi)參物的選定 建立QAMS法，內(nèi)參物的選定是關(guān)鍵，選定內(nèi)參物的標準是易得、價廉、性質(zhì)穩(wěn)定、峰面積和保留時間穩(wěn)定、供試品中的含量高[17-20]。在本實驗研究的7個指標成分中，葛根素[15]為葛根異黃酮類中主要活性成分之一，且相較價廉易得，含量高、穩(wěn)定性好，因此，本實驗以葛根素為內(nèi)標物，建立QAMS的分析方法，彌補了對照品不足或價格昂貴的缺點，也體現(xiàn)了QAMS法低成本的優(yōu)勢。

3.1.5s/i耐用性考察 采用2個不同品牌高效液相色譜儀和2種不同品牌色譜柱以及不同柱溫和體積流量，分別考察了s/i和相對保留時間的可靠性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同儀器、不同色譜柱、不同柱溫、不同體積流量下s/i的RSD均小于3.0%，相對保留時間的RSD均小于3.0%，說明該QAMS法的系統(tǒng)耐用性良好。

3.2 薄層鑒別條件考察

3.2.1 展開劑考察 分別以三氯甲烷-甲醇-水（20∶4.5∶0.5）（展開劑1）及環(huán)己烷-丙酮-醋酸乙酯（5∶2∶1）（展開劑2）為展開劑，展開，取出，晾干，展開系統(tǒng)2用氨水熏10 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視，后噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置日光和紫外光燈（365 nm）下檢視。根據(jù)薄層色譜的分離情況，選擇分離效果更好的展開系統(tǒng)1三氯甲烷-甲醇-水（20∶4.5∶0.5）作為ZDG同時鑒別葛根及甘草的薄層鑒別方法。

3.2.2 色譜條件穩(wěn)定性考察 按上述確定的方法對薄層鑒別方法考察其穩(wěn)定性，考察不同溫度4、25 ℃及不同濕度25%、70%的影響。結(jié)果表明，與對照品、基準樣品相應(yīng)色譜位置上供試品色譜斑點顏色大小相同，且各考察因素下結(jié)果差異不大，溫度及濕度對葛根及甘草薄層鑒別方法的影響較小。

3.2.3 不同廠家薄層板 按上述方法對葛根進行薄層鑒別，考察青島海洋化工有限公司、青島康業(yè)鑫有限公司、上海阿拉丁生化科技股份有限公司芯硅谷3個廠家生產(chǎn)的硅膠G板對竹茹湯中葛根及甘草薄層鑒別的影響。結(jié)果表明，與對照品、對照藥材相應(yīng)色譜位置上的供試品色譜斑點顏色大小相同，且各考察因素下結(jié)果差異不大，薄層板對葛根及甘草薄層鑒別方法的影響較小。

本研究首次建立了QAMS法結(jié)合特征圖譜技術(shù)同時測定經(jīng)典名方ZDG 7種成分的含量，同時建立薄層色譜法同時鑒別經(jīng)典名方ZDG劑在質(zhì)量控制鑒別中主要成分葛根素和甘草苷，此方法減少了薄層鑒別的工作量及試劑，并為經(jīng)典名方薄層鑒別方法提供參考。15批樣品特征圖譜相似度均大于0.9；同時QAMS法和外標法分別測定15批ZDG 7種成分的含量結(jié)果無顯著差異；薄層鑒別方法穩(wěn)定性良好，特征圖譜與QAMS聯(lián)用的方法，可客觀評價藥效成分復(fù)雜的復(fù)方制劑的整體質(zhì)量，以期為該制劑質(zhì)量控制和評價提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality evaluation of Zhuru Decoction Granules based on quantitative analysis of multi-components with a single-marker content determination and TLC identification

HE Tian-yu1, MEI Xi1, WANG Xiao-li1, MAO Jing1, XIE Hui1, GUO Yong2, HOU Jin-cai2, LU Tu-lin1, MAO Chun-qin1

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Shenwei Pharmaceutical Group Co., Ltd., Shijiazhuang 051430, China

To establish the characteristic chromatogram of Zhuru Decoction Granules (竹茹湯顆粒, ZDG) and determine its main components by quantitative analysis of multi-components with a single-marker (QAMS) method, optimize the TLC conditions, and establish a simultaneous identification method for puerarin and glycyrrhizin.To optimize and determine the best chromatographic conditions of HPLC and establish the characteristic chromatogram. With puerarin as the reference material, establish a QAMS for the identification of puerarin, 3′-hydroxypuerarin, 3′-methoxy puerarin, puerarin apigenide, daidzin, glycyrrhizin and glycyrrhizic acid, and establish the TLC conditions for the simultaneous identification of the main active ingredients puerarin and glycyrrhizin.The similarity between the characteristic profiles of the 15 batches of samples and their control profiles was greater than 0.95; There was no significant difference between the contents of the components obtained by the QAMS method and the external standard method for the 15 batches of preparations, and the relative errors of the seven components were less than 5%; The stability study proved that the thin-layer assay conditions were stable and feasible.The method is scientific, feasible, stable and controllable. The study is helpful to improve the quality control method of ZDG, a classic famous prescription, and is expected to provide a reference for the quality control evaluation of the classical prescription.

classical prescription; Zhuru Decoction; characteristic chromatogram; quantitative analysis multi-components by single marker; thin-layer chromatography identification; puerarin; liquiritin; 3′-hydroxy puerarin; 3′-methoxy puerarin; puerarin apioside; daidzin; glycyrrhizic acid

R283.6

A

0253 - 2670(2023)14 - 4511 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.011

2022-12-13

國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFC1707000）

何天雨（2000—），碩士研究生，主要從事中藥炮制及中藥飲片質(zhì)量標準研究。E-mail: 13844563203@163.com

毛春芹，正高級實驗師，主要從事新藥研發(fā)及中藥質(zhì)量究。E-mail: mcq63@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]