馮冬林　丁玲　劉美琴　鐘開(kāi)勤

關(guān)鍵詞：大白菜；菌核病；轉(zhuǎn)錄組；差異表達(dá)基因

中圖分類(lèi)號(hào)：S436.341.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

大白菜（Brassica campestris syn. rapa L. ssp.pekinensis）原產(chǎn)中國(guó)，屬于十字花科蕓薹屬，是我國(guó)栽培面積最大的蔬菜作物之一。大白菜菌核病是由核盤(pán)菌[Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） deBary]引起的一種具有土傳性的真菌病害，主要危害葉片和莖稈。近年來(lái)大白菜菌核病呈逐年上升趨勢(shì)，在福建省，每年12—4 月為菌核病發(fā)病嚴(yán)重期，少則造成產(chǎn)量損失10%～30%，嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn)50%以上[1]。

菌核病的防治主要以化學(xué)防治為主，但是長(zhǎng)期大量使用化學(xué)藥劑造成土壤污染及食品安全等問(wèn)題，培育大白菜抗病品種是應(yīng)對(duì)生態(tài)友好型最有效的辦法。近年來(lái)， 基因組學(xué)輔助育種（genome-assisted breeding， GAB）將基因組學(xué)與高通量表型分析相結(jié)合創(chuàng)造新種質(zhì)，已成為一種高效的育種模式[2]。

植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，通過(guò)多重防御系統(tǒng)以抵抗病原菌入侵，在病原菌入侵的情況下，利用轉(zhuǎn)錄組全面分析該時(shí)期的全部基因表達(dá)情況，以揭示植物在某一時(shí)刻、某個(gè)組織中轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控機(jī)制[3-4]。本研究以不同抗性大白菜自交系材料接種核盤(pán)菌，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選出抗病相關(guān)差異表達(dá)基因，探討差異表達(dá)基因調(diào)控機(jī)制，為大白菜應(yīng)答菌核病的分子機(jī)制及抗病品種的選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

前期對(duì)20 個(gè)大白菜品種和自交系經(jīng)幼苗進(jìn)行離體葉片菌核病抗性鑒定，篩選出抗性自交系材料H72 及感性自交系材料Y26 作為本研究材料。大白菜核盤(pán)菌菌株從大田分離、鑒定并保存。

1.2 方法

1.2.1 植株培養(yǎng) 將自交系材料H72 與Y26 種子用75%酒精消毒處理90 s，再用蒸餾水沖洗2～3次，置于22 ℃光照培養(yǎng)箱中催芽2 d，將露白的種子點(diǎn)播于穴盤(pán)中，在大棚自然條件下生長(zhǎng)，基質(zhì)由草炭土、椰糠和跖石按1∶2∶1 混勻而成，待試驗(yàn)材料長(zhǎng)至2～3 片真葉后接種。

1.2.2 試驗(yàn)處理 切取活化的核盤(pán)菌菌塊5 mm×5 mm，將有菌絲的一面接種到葉片中央，以無(wú)菌絲的瓊脂塊作為空白對(duì)照，接種葉片時(shí)盡量避開(kāi)葉脈，最后噴灑定量無(wú)菌水，蓋上培養(yǎng)皿，將接種的葉片水平放置于培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)為22 ℃，相對(duì)濕度保持在85%左右。

收集在PDA 平板上培養(yǎng)15 d 的核盤(pán)菌，搗碎并加無(wú)菌水，過(guò)濾后制成濃度為1×106 個(gè)/mL的孢子懸浮液，待植株長(zhǎng)至2～3 片葉期，用接種針刺葉片，將孢子懸浮液均勻噴霧于植株葉片，收集分別接種0、36、48 h 的自交系材料H72 與Y26葉片，每個(gè)樣品0.5 g，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，經(jīng)液氮速凍后于?80 ℃冰箱保存，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2.3 H2O2 檢測(cè) DAB（3，3'-diaminobenzidine-HCl）染色檢測(cè)法參照GUAN 等[5]的方法并加以改進(jìn)。將接種36、48 h 后的大白菜葉片置于pH為3.8 的1 mg/mL DAB 溶液中，染色6 h 后于沸騰的75%酒精中脫色8 min，冷卻后，于無(wú)水乙醇中室溫保存。

1.2.4 文庫(kù)構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序總 RNA 提取應(yīng)用Trizol 法（Invitrogen），使用Agilent 2100 bioanalyzer檢測(cè)RNA 完整性和總量。構(gòu)建cDNA文庫(kù)，使用Qubit 2.0 Fluorometer 和Agilent 2100bioanalyzer 對(duì)文庫(kù)進(jìn)行檢測(cè)，在Illumina NovaSeq6000 平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2.5 測(cè)序原始數(shù)據(jù)分析測(cè)序獲得的圖像數(shù)據(jù)經(jīng)CASAVA 堿基識(shí)別轉(zhuǎn)化為原始序列數(shù)據(jù)（rawreads），去除含接頭、含N（無(wú)法確定堿基信息）、低質(zhì)量reads 后，獲得clean data，與大白菜參考基因組（http：//brassicadb.org/brad/）進(jìn)行序列比對(duì)。使用DESeq2 軟件（1.20.0）進(jìn)行2 個(gè)比較組合之間的差異表達(dá)分析。使用Benjamini-Hochberg 方法調(diào)整所得P 值（P-adjust），以控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率。差異表達(dá)的閾值設(shè)定為P-adjust≤0.05 & |log2FC|≥4。根據(jù)基因在不同處理時(shí)間及抗、感品系中的差異表達(dá)、功能注釋和功能富集等表達(dá)水平進(jìn)行分析。

1.2.6 qPCR 驗(yàn)證 選取8 個(gè)差異表達(dá)基因設(shè)計(jì)引物，以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序用的cDNA 為模板，內(nèi)參基因?yàn)锳ctin（表１），用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序同批次采集樣品的cDNA 為模板，使用熒光定量PCR 儀（ABIQuantStudio 3）進(jìn)行qPCR 分析。設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)，按照2^-ΔΔC_T算法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。使用SPSS 軟件分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2 的累積情況

利用DAB 染色檢測(cè)核盤(pán)菌侵染大白菜葉片過(guò)程中的活性氧（ROS）發(fā)生水平和H2O2 累積情況。結(jié)果顯示，在接種后36、48 h，大白菜H72的染色區(qū)域明顯小于Y26，在36 h 時(shí)已表現(xiàn)出明顯差異（圖1），表明大白菜H72 的抗性強(qiáng)于Y26。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得121.77 Gb 的clean data，對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，各樣品clean data 均達(dá)到6 Gb 以上，Q30 堿基百分比在90%以上，GC含量達(dá)40%以上（表2）。

2.3 差異表達(dá)基因篩選與分析

在差異表達(dá)閾值設(shè)定為P-adjust ≤0.05 &|log2FC|≥4 的基礎(chǔ)上，將抗病H72 和感病Y26 材料分別在接種36、48 h 后進(jìn)行比對(duì)，抗感病材料間及抗感病材料內(nèi)共有差異表達(dá)基因分別為13、11 個(gè)（圖2）。

2.4 抗病調(diào)控關(guān)鍵基因

從菌核病侵染后抗病材料H72 和感病材料Y26 的共有差異表達(dá)基因中，篩選到抗病相關(guān)的差異基因11 個(gè)，差異均達(dá)顯著性水平（P<0.05，表3）。

基因ESP 為上皮硫特異蛋白（epithiospecifier?protein）基因，擬南芥中ESP 基因調(diào)節(jié)吲哚-3-乙腈（IACN）的產(chǎn)生，在植物葉片衰老過(guò)程中起負(fù)調(diào)節(jié)的作用[6-7]。Bra103871086（ESP）在H72 和Y26 均為下調(diào)表達(dá)。

類(lèi)鈣調(diào)磷酸酶B 蛋白基因（CBL1）、天冬氨酸蛋白酶基因（AED3）、熱激蛋白基因（DnaJ 11）能夠調(diào)節(jié)植物應(yīng)答生物脅迫和非生物脅迫，在植物抗逆和次生代謝過(guò)程中起重要作用[8-10]。本研究中CBL1 表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，且在H72 中的表達(dá)量低于Y26；AED3、DnaJ 11 為上調(diào)表達(dá)，且在H72 中的表達(dá)量高于Y26。

轉(zhuǎn)錄因子ERF、MYB 參與脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，在響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫及植物生長(zhǎng)發(fā)育等方面起重要作用[11-12]?；騇YB34 為上調(diào)表達(dá)，ERF003 為下調(diào)表達(dá)。

F-box、類(lèi)甜蛋白基因（TLP1）、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因（ANT1）、生長(zhǎng)素原初反應(yīng)基因（GH3.3）、咖啡酰輔酶A 氧甲基轉(zhuǎn)移酶基因（Cco AOMT）在H72 和Y26 中均上調(diào)表達(dá)，且在H72 中的表達(dá)量顯著高于Y26。

2.5 qPCR 驗(yàn)證

選擇8 個(gè)差異表達(dá)基因，應(yīng)用qPCR 驗(yàn)證其在抗、感大白菜材料中的表達(dá)情況（圖3）。結(jié)果表明，ERF003、CBL1、AED3 在2 個(gè)材料侵染36、48 h 均下調(diào)表達(dá)，其中ERF003、CBL1 在H72 中的表達(dá)量低于Y26，與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致；CcoAOMT、GH3.3、MYB34、ANT1、TLP1 在2 個(gè)材料侵染36、48 h 均上調(diào)表達(dá)，并且在H72 中的表達(dá)量高于Y26，轉(zhuǎn)錄組分析Cco AOMT 在病菌侵染48 h 的H72 中的表達(dá)量低于Y26，其他結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析一致。以上分析表明，qPCR 結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 討論

本研究選用抗、感菌核病的大白菜品系，利用葉片接種菌核病菌，在轉(zhuǎn)錄水平分析2 種材料在接種0、36、48 h 后相關(guān)抗病差異基因的表達(dá)。構(gòu)建了抗病組（H72）與感病組（Y26）大白菜葉片cDNA 文庫(kù)，結(jié)果顯示，抗、感大白菜自交系隨著菌核病菌侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，高質(zhì)量序列和差異表達(dá)基因數(shù)量均顯著增多。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，鑒定出11 個(gè)抗病相關(guān)基因。

3.1 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控大白菜菌核病抗性

MYB34 是調(diào)控芥子油苷代謝通路的R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子之一，不僅可以提高吲哚族芥子油苷的含量，而且還可以提高生長(zhǎng)素的含量[13-14]。核盤(pán)菌、伏馬菌素B1 侵染擬南芥及在ABA 和JA處理下吲哚-3-甲基芥子油苷顯著升高，吲哚類(lèi)芥子油苷很可能參與了擬南芥對(duì)核盤(pán)菌侵染的防衛(wèi)反應(yīng)[15-16]。本研究中MYB34 在病菌侵染48 h后顯著上調(diào)，且在H72 中的表達(dá)量顯著高于Y26，MYB34 表達(dá)量增強(qiáng)，可能調(diào)控了ABA、SA、JA等介導(dǎo)的吲哚類(lèi)芥子油苷的合成，從而調(diào)節(jié)植物的抗逆防御水平。

ERF003 基因?qū)儆贏P2-ERF 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，ERF轉(zhuǎn)錄因子同乙烯響應(yīng)元件相結(jié)合，通過(guò)調(diào)節(jié)乙烯的表達(dá)，從而參與植物脅迫過(guò)程調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和發(fā)育[17]。擬南芥AtERF3/4 與下游基因結(jié)合時(shí)則發(fā)揮抑制子的作用[12]；桃樹(shù)（Prunus persica）轉(zhuǎn)錄因子PpERF3 調(diào)節(jié)PpNCED2/3 的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)桃子果實(shí)的成熟[18]；呂靜[19]認(rèn)為水稻Os ERF3正調(diào)控對(duì)二化螟的抗性而負(fù)調(diào)控對(duì)褐飛虱的抗性；干旱、鹽脅迫處理甘薯后，IbERF3 在根和葉片中的表達(dá)量均顯著上升[20]；王峰等[21]推測(cè)雜交楊絲裂原活化蛋白激酶MAPK6 調(diào)控PtdERF3，正向調(diào)控銹病侵染。本研究中ERF003 在接種后36、48 h 均為下調(diào)表達(dá)，具體如何參與大白菜抗菌核病還需進(jìn)一步研究。

3.2 植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與大白菜菌核病抗性

生長(zhǎng)素（auxin）是植物重要的內(nèi)源激素，能夠誘導(dǎo)早期響應(yīng)基因Aux/IAAs、GH3s 和SAURs的表達(dá)，從而提高對(duì)于脅迫的抵抗能力[22]，生長(zhǎng)素早期響應(yīng)蛋白GH3 基因參與調(diào)控植物多個(gè)生理過(guò)程， 及相應(yīng)生物和非生物脅迫[23]， 水稻OsGH3.3 能夠提高水稻細(xì)菌性病害的抗性[24]，本研究中GH3.3 在菌核病侵染36、48 h 后表達(dá)量顯著上升，且在H72 中的表達(dá)量顯著高于Y26，推測(cè)GH3.3 在抗菌核病過(guò)程中起著重要作用。

3.3 病程相關(guān)基因介導(dǎo)大白菜菌核病抗性

類(lèi)甜蛋白（thaumatin-like proteins， TLPs）屬于病程相關(guān)蛋白（PR）家族的PR-5 亞族，是一種重要的植物病源防御蛋白。TLP 基因?qū)π←溠┟共　⑺炯y枯病、油菜菌核病等具有抗性[25-27]，栗小英等[28]研究表明，TaLr19TLP1 基因受葉銹菌、脫落酸和水楊酸的誘導(dǎo)，參與小麥抗葉銹防御反應(yīng)。TLP1 在菌核病侵染36、48 h 均上調(diào)表達(dá)，且在H72 中的表達(dá)量顯著高于Y26，表明TLP1 可能參與菌核病的防御反應(yīng)。

3.4 其他基因與大白菜菌核病抗性

ESP能對(duì)黑芥子酶催化的芥子油苷水解產(chǎn)物的組成起調(diào)節(jié)作用，芥子油苷及其代謝產(chǎn)物在植物抵御食草動(dòng)物、害蟲(chóng)和病原微生物的防衛(wèi)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。過(guò)表達(dá)擬南芥AtESP 和白菜BcESP 可以調(diào)控芥子油苷的代謝，從而調(diào)節(jié)植物的抗蟲(chóng)和抗病防御[29-32]；植物體內(nèi)參與苯丙烷途徑和水楊酸（SA）途徑的基因在木質(zhì)素生物合成及植物免疫方面具有重要的作用。咖啡酰輔酶A氧甲基轉(zhuǎn)移酶（caffeoyl CoA O-methyltransferase，CcoAOMT）是調(diào)控木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶之一，轉(zhuǎn)基因CcoAOMT 煙草下調(diào)表達(dá)，使木質(zhì)素含量大幅下降[33]，百合花LrCCoAOMT 參與調(diào)節(jié)SA 信號(hào)水平，使維管束組織中的木質(zhì)素含量增加并提高對(duì)灰霉病的抗性[34]。轉(zhuǎn)錄組分析表明，ESP 在侵染葉片36、48 h 后表達(dá)量顯著降低，CcoAOMT在接種48 h 上調(diào)表達(dá)，而ESP 和CcoAOMT 如何參與大白菜菌核病的抗性需進(jìn)一步研究。