袁琳 陸冬筱 李金華

（長(zhǎng)春理工大學(xué)物理學(xué)院，納米光子學(xué)與生物光子學(xué)吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130022）

對(duì)于疾病進(jìn)行有效控制和治療的關(guān)鍵是可以在早期進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)。目前醫(yī)學(xué)診療手段日益豐富，但是如計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）等常規(guī)檢查項(xiàng)目無(wú)法在早期對(duì)一些慢性?。ㄈ缣悄虿　⑼达L(fēng)以及阿爾茨海默病等）進(jìn)行準(zhǔn)確判斷。建立快速、靈敏度高、選擇性好的檢測(cè)方法具有十分重要的意義。納米材料和技術(shù)的快速發(fā)展為生物傳感器的研究和發(fā)展提供了很重要的平臺(tái)和手段，目前已經(jīng)有多種生物傳感器應(yīng)用于生物檢測(cè)，根據(jù)生物傳感器中的信號(hào)不同可以將其分為電化學(xué)生物傳感器、熱學(xué)生物傳感器、壓電生物傳感器、場(chǎng)效應(yīng)管生物傳感器和光學(xué)生物傳感器等。電化學(xué)傳感器在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，對(duì)溫度十分敏感，所以要進(jìn)行內(nèi)部溫度補(bǔ)償，盡可能保持溫度穩(wěn)定，同時(shí)，電化學(xué)傳感器在使用壽命內(nèi)會(huì)老化，需要頻繁校準(zhǔn)；熱學(xué)傳感器在進(jìn)行測(cè)試時(shí)對(duì)測(cè)量溫度的范圍有一定的限制，程序也較為復(fù)雜；壓電型生物傳感器由于傳感器的表面與液體之間的結(jié)構(gòu)會(huì)影響最后模型的建立，情況也比較復(fù)雜；場(chǎng)效應(yīng)管生物傳感器在將生物物質(zhì)與傳感器固化過程中容易引起生物物質(zhì)失活等問題，同時(shí)操作比較復(fù)雜。而作為一種典型的光學(xué)傳感器——基于納米酶的比色生物傳感器，與無(wú)納米酶的比色生物傳感器相比，具有制作成本低、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高以及肉眼可視等特點(diǎn)，所以被越來(lái)越多的研究者所青睞。本文主要綜述基于納米酶的比色生物傳感器的相關(guān)原理、納米酶的分類以及在生物檢測(cè)方面的應(yīng)用和最新進(jìn)展。

1 基于納米酶的比色生物傳感器

1.1 基于納米酶的比色生物傳感器的傳感機(jī)理

比色傳感技術(shù)主要是以顏色變化為基礎(chǔ)，通過肉眼觀察分析物的存在和濃度變化，進(jìn)行定性的判斷，基于納米酶的比色傳感主要是基于過氧化氫（H2O2）可以催化某些顯色底物發(fā)生氧化反應(yīng)，從而使顯色底物變色，達(dá)到可視化檢測(cè)目的。在沒有納米酶存在的情況下也可以對(duì)H2O2進(jìn)行檢測(cè)，但存在耗時(shí)更長(zhǎng)、選擇性一般等不足，因此，基于納米酶構(gòu)建的比色生物傳感器被越來(lái)越多的人認(rèn)可。比色法主要采用目視法和分光光度計(jì)法兩種方法。目視法是直接通過肉眼觀察溶液顏色的深淺變化；分光光度計(jì)法是通過對(duì)物質(zhì)的吸光度值變化進(jìn)行測(cè)定，不僅可以定性地對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行識(shí)別，同時(shí)也可以定量地進(jìn)行分析檢測(cè)，在滿足快速便捷的同時(shí)還具有較好的準(zhǔn)確性。目前檢測(cè)的顯色底物一般為3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），也有其他的顯色底物如2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）或鄰苯二胺（OPD）等。以顯色底物TMB為例，基于納米酶的比色生物傳感器顯色過程主要是，納米酶中的活性位點(diǎn)首先吸附TMB，給納米酶表面提供一定的孤電子對(duì)，導(dǎo)致納米酶的電子密度和遷移率增加，由于此時(shí)體系界面上的強(qiáng)相互作用，活性位點(diǎn)將會(huì)得到電子被還原，同時(shí)將電子轉(zhuǎn)移到H2O2，活性位點(diǎn)在此被氧化，從而加速了納米酶與TMB之間的電子轉(zhuǎn)移過程，使檢測(cè)時(shí)間大大縮短。

1.2 基于納米酶的比色生物傳感器的幾種器件構(gòu)建形式

a. 紙基生物檢測(cè)。首先將沃特曼（Whatman）濾紙穿孔成大小一致的小圓盤，并以納米酶作為基礎(chǔ)，將納米酶載于紙上，以獲得一次性高靈敏度的紙質(zhì)生物分析儀，然后再通過智能手機(jī)應(yīng)用程序（如：Color Assist）在RGB模式下監(jiān)測(cè)添加待測(cè)物質(zhì)后紙質(zhì)設(shè)備上的比色信號(hào)，并進(jìn)行擬合，得到試紙條顏色與待測(cè)物質(zhì)濃度的函數(shù)關(guān)系。紙基的檢測(cè)方法主要是，先將定性濾紙浸入含有TMB的溶液中一段時(shí)間，在室溫下風(fēng)干后，滴加含有納米酶和待檢測(cè)物質(zhì)的溶液，觀察紙張的顏色變化，再進(jìn)一步采用軟件進(jìn)行分析，如Jin等［1］首先制備了具有高靈敏性的氫氧化鈷（CoOOH）納米酶，然后應(yīng)用于制備紙基納米酶試紙條，并通過結(jié)合智能手機(jī)和軟件，成功構(gòu)建了檢測(cè)乙酰膽堿酯酶（AChE）傳感器，圖1為基于納米酶紙基法檢測(cè)H2O2的示意圖。采用紙基生物檢測(cè)可以實(shí)現(xiàn)低成本、快速、便攜檢測(cè)，為臨床應(yīng)用提供了一種有前景的設(shè)計(jì)。

Fig. 1 Schematic diagram of detecting H2O2 based on nanozyme paper-based method圖1 基于納米酶紙基法檢測(cè)H2O2的示意圖

b. 便攜式水凝膠試劑盒檢測(cè)。首先制備納米酶和TMB的水凝膠裝置，然后在加入待檢測(cè)的物質(zhì)，等待一段時(shí)間，讓待測(cè)物質(zhì)更好的擴(kuò)散到水凝膠裝置中，采用數(shù)碼相機(jī)記錄檢測(cè)結(jié)果，然后再用Image J軟件等進(jìn)行量化，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用圖像處理的方法得到待測(cè)物質(zhì)濃度與水凝膠顏色深淺度的線性直方圖。便攜式水凝膠試劑盒具有操作簡(jiǎn)單、選擇性好以及成本低等優(yōu)點(diǎn)，可以滿足頻繁的篩查和診斷跟蹤需要。

c. 瓊脂糖凝膠試劑條檢測(cè)。首先制備瓊脂糖試劑條，然后將納米酶和TMB固定于瓊脂糖凝膠中，用于待測(cè)物質(zhì)的比色檢測(cè)，一段時(shí)間后，可以觀察到瓊脂糖凝膠試劑條的顏色變化，用UV-vis分析儀進(jìn)一步分析，得到試劑條吸光度與待測(cè)物質(zhì)濃度的關(guān)系曲線。瓊脂糖試劑條靈敏度高［2］，有望對(duì)氣體進(jìn)行檢測(cè)。

由于具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)有越來(lái)越多基于比色生物傳感器的器件被成功構(gòu)建，這為生物檢測(cè)提供了更多思路的同時(shí)，也為現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)提供了有力的支持。但是當(dāng)需要對(duì)體內(nèi)的血液、尿液或其他體液進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，則要保證納米酶可以與生物物質(zhì)很好地兼容，所以對(duì)于納米酶生物相容性的要求也大大提高。

1.3 納米酶的特點(diǎn)及分類

納米酶是一類具有類似于天然酶活性的納米材料，既具有接近天然酶的催化活性，又具有性質(zhì)穩(wěn)定、成本低、易于合成等優(yōu)點(diǎn)，所以納米酶在生物檢測(cè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究者發(fā)現(xiàn)，多種納米材料均具有天然酶活性，可以表現(xiàn)出模擬過氧化物酶活性，并將具有過氧化酶活性的納米酶應(yīng)用于比色生物傳感器的制備，目前基于納米酶的比色傳感器為人們的生活以及醫(yī)療方面提供了越來(lái)越多的便捷。對(duì)基于納米酶的比色生物傳感器而言，納米酶的模擬過氧化物酶活性對(duì)傳感器的靈敏度等性能至關(guān)重要。根據(jù)核心材料分類，納米酶大致可分為貴金屬基納米酶、石墨烯基納米酶、過渡金屬基納米酶等。

[15]參見[德]Pro.Manfred Wolf：《德國(guó)物權(quán)法》，吳越、李大雪譯，北京：韋伯文化國(guó)際出版有限公司，法律出版社，2006年，第276頁(yè)。

1.3.1 基于貴金屬納米酶的比色生物傳感器

貴金屬納米材料由于具有獨(dú)特的物理及化學(xué)性質(zhì)、較好的活性位點(diǎn)以及局域表面等離子體共振特性，在一些領(lǐng)域得到較好的應(yīng)用［3-6］。目前，已發(fā)現(xiàn)一些貴金屬具有很好的模擬酶的催化活性，如金、銀、鉑等。Xu等［7］用不同濃度的Cu2+離子對(duì)金納米棒進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，不同Cu2+離子會(huì)誘導(dǎo)金納米棒（Au NRs）出現(xiàn)不同的高指數(shù)晶面，加速了活性電子從納米酶轉(zhuǎn)移到H2O2的過程，從而表現(xiàn)出較好的過氧化物酶活性，在此基礎(chǔ)上對(duì)維生素飲料中的抗壞血酸進(jìn)行了檢測(cè)（圖2），檢測(cè)限可以達(dá)到25 μmol/L，為檢測(cè)抗氧化分子提供了一個(gè)新的平臺(tái)。與此同時(shí)，近年來(lái)對(duì)于金屬Pt的報(bào)道也越來(lái)越多，由于Pt具有類辣根過氧化物酶的特性，也被越來(lái)越廣泛地應(yīng)用，Li等［8］研究基于BSA對(duì)金屬Pt進(jìn)行包覆得到BSA-Pt納米酶，其中Pt（0）參與底物與H2O2的釋放過程，從而顯示出較好的類辣根過氧化物酶活性，而Hg2+離子可以通過與Pt間的親金屬相互作用調(diào)節(jié)其過氧化物酶活性，從而達(dá)到比色的效果。綜上，貴金屬納米酶可以很好地應(yīng)用于比色生物傳感器的構(gòu)建，進(jìn)而很好地應(yīng)用于相關(guān)生物分析檢測(cè)和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)當(dāng)中，本文也列出基于貴金屬納米酶的比色生物傳感器的檢測(cè)物質(zhì)以及靈敏度（表1）。

Table 1 Colorimetric biosensor based on noble metal nanozyme was used for colorimetric detection表1 基于貴金屬納米酶比色生物傳感器用于比色檢測(cè)

Fig. 2 TEM images of Au NRs under different copper ion concentrations and the mechanism of ascorbic acid detection［7］圖2 不同銅離子濃度下Au NRs的透射電子顯微鏡（TEM）照片以及檢測(cè)抗壞血酸機(jī)制［7］

1.3.2 基于石墨烯基納米酶的比色生物傳感器

近年來(lái)，碳納米材料因具有多種良好的物理性質(zhì)而被廣泛地利用［13-17］。作為碳材料中最具代表性的材料之一，石墨烯是一種碳原子以sp2雜化形成的，其中碳原子緊密堆積形成具有二維蜂窩狀結(jié)構(gòu)的材料，石墨烯每一個(gè)晶格內(nèi)的σ鍵都十分穩(wěn)定，同時(shí)都貢獻(xiàn)p軌道上一個(gè)電子形成大π鍵，由于π電子可以自由運(yùn)動(dòng)，所以石墨烯具有良好的導(dǎo)電性［18］。

石墨烯的重要衍生物之一是氧化石墨烯和還原氧化石墨烯。氧化石墨烯的表面含有較多的含氧官能團(tuán)（如：羥基、羧基和環(huán)氧基等），因此氧化石墨烯具有更好的水溶性，也更易與其他分子偶聯(lián)，尤其是單層的氧化石墨烯，具有更大的比表面積以及π電子結(jié)構(gòu)，其他分子可以更加容易地通過非共價(jià)的形式結(jié)合在其表面［19］。Li等［20］采用簡(jiǎn)單的鐵自催化過程，在室溫下成功合成還原石墨烯（RGO）-鐵納米顆粒（INs），原位形成的氧化殼可以有效引導(dǎo)鐵的循環(huán)，同時(shí)產(chǎn)生具有高活性的羥基自由基（·OH），從而表現(xiàn)出良好的過氧化物酶活性（圖3），基于此建立了基于該納米酶的比色生物傳感器，成功采用比色法對(duì)過氧化氫和葡萄糖進(jìn)行檢測(cè)。碳基納米材料由于具有良好的導(dǎo)電性、水溶性和生物相容性，被越來(lái)越多的研究者應(yīng)用于比色傳感的分析檢測(cè)中，本文也列出基于石墨烯納米酶的比色生物傳感器的檢測(cè)物質(zhì)以及靈敏度（表2）。

Table 2 Colorimetric biosensor based on graphene nanozyme is used for colorimetric detection表2 基于石墨烯納米酶比色生物傳感器用于比色檢測(cè)

Fig. 3 Characterization and synthesis of RGO-Ins圖3 RGO-Ins表征及合成示意圖

1.3.3 基于過渡金屬納米酶的比色生物傳感器

過渡金屬通常是指由元素周期表的d區(qū)域中（如Mn、Fe、Ni、Cu、Zn、Mo等）的金屬元素組成的單質(zhì)，且這些金屬都有很強(qiáng)的電化學(xué)特性和促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移性質(zhì)。過渡金屬納米材料具有極好的導(dǎo)電性、光學(xué)、化學(xué)穩(wěn)定性，擁有大量的活性催化位點(diǎn)，其晶體結(jié)構(gòu)可調(diào)，帶隙與材料厚度息息相關(guān)。上述優(yōu)勢(shì)激發(fā)起愈來(lái)愈多研究者對(duì)過渡金屬納米材料的研究和關(guān)注［26-31］。過渡金屬材料一定的修飾后會(huì)表現(xiàn)出其他材料無(wú)法比擬的物理特性［32］，同時(shí)也憑借著較大的比表面積以及良好的導(dǎo)電性成為了可以檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)或者生物物質(zhì)的新型材料。

二硫化鉬（MoS2）是一種典型的過渡金屬硫化物，具有二維層狀結(jié)構(gòu)，因其較大的比表面積以及較高的載流子遷移率等優(yōu)點(diǎn)，被研究者們稱為“無(wú)機(jī)石墨烯”。MoS2合成方法也較多，主要有化學(xué)氣相沉積法［33］、水熱法［34］、溶劑熱法［35］以及剝離法［36］等，所以受到越來(lái)越多研究者們的關(guān)注。本課題組采用化學(xué)氣相沉積法制備了MoS2薄膜，然后將金納米陣列與單層的MoS2進(jìn)行復(fù)合，用于水產(chǎn)品抗菌藥物殘留的檢測(cè)，在此基礎(chǔ)上，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)蝦體內(nèi)的抗菌藥物殘留的檢測(cè)［37］。同時(shí)我們還對(duì)單層、雙層二硫化鉬的超快動(dòng)力學(xué)特性進(jìn)行了研究［38］。

Lin等［39］首次發(fā)現(xiàn)，MoS2納米片具有固有的類過氧化物酶活性，可以催化H2O2氧化TMB，產(chǎn)生藍(lán)色的氧化物，在此基礎(chǔ)上建立了一種具有較高靈敏度可以對(duì)血清中葡萄糖進(jìn)行檢測(cè)的方法，同時(shí)也構(gòu)建了瓊脂糖水凝膠試劑盒，可以更加簡(jiǎn)單、廉價(jià)、便攜地對(duì)血清中的葡萄糖進(jìn)行檢測(cè)。研究表明，MoS2納米粒子的過氧化物酶活性與其表面所帶的電荷息息相關(guān)，檢測(cè)示意圖如圖4所示［40-41］。很多研究者對(duì)其進(jìn)行了一定的表面修飾以獲得較高的靈敏度。MoS2因比表面積大、電子遷移率高等優(yōu)點(diǎn)被很好地應(yīng)用于比色分析中。單純裸露的MoS2不溶于水，所以通常要對(duì)其表面進(jìn)行修飾或與其他材料復(fù)合以增強(qiáng)其穩(wěn)定性和分散性。MoS2催化活性往往受其層數(shù)、厚度和形狀等的影響，目前對(duì)其如何調(diào)控還需要進(jìn)一步的研究。此外，研究表明，還有一些過渡金屬硫化物也具有良好的類酶特性，如二硫化鎢（WS2）、硫化鈷（CoS）等。Lin等［42］首次發(fā)現(xiàn)，WS2具有過氧化物酶活性，可以對(duì)葡萄糖采用比色法進(jìn)行檢測(cè)和分析；Das課題組［43］基于CoS/還原石墨烯的復(fù)合材料較好的納米酶特性，研制了一種簡(jiǎn)單的比色法對(duì)Hg2+進(jìn)行分析。對(duì)于過渡金屬硫族化合物的研究越來(lái)越廣泛，也成功地應(yīng)用于比色生物傳感領(lǐng)域，這為相關(guān)醫(yī)學(xué)檢測(cè)的應(yīng)用提供了有力幫助，本文也列出基于過渡金屬納米酶的比色生物傳感器的檢測(cè)物質(zhì)以及靈敏度（表3）。

Table 3 Colorimetric biosensors based on transition metal nanoenzymes are used for colorimetric detection表3 基于過渡金屬納米酶比色生物傳感器用于比色檢測(cè)

Fig. 4 Preparation process of SDS-MoS2 NPs and schematic diagram of detecting H2O2 and glucose［40］圖4 SDS-MoS2 NPs的制備過程以及檢測(cè)H2O2和葡萄糖示意圖［40］

目前已經(jīng)有越來(lái)越多的材料被發(fā)現(xiàn)可以作為納米酶，納米酶的出現(xiàn)不僅彌補(bǔ)了天然酶的穩(wěn)定性差等不足，也大大推進(jìn)了在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)方面的進(jìn)步和應(yīng)用，讓疾病的早期干預(yù)和治療變成可能，同時(shí)也為人們的生活提供了更多的保障。

2 基于納米酶的比色生物傳感器在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用

與天然酶相比，納米酶具有性質(zhì)穩(wěn)定、成本低、易于合成同時(shí)可以將一些信號(hào)放大等優(yōu)點(diǎn)?；诩{米酶的比色生物傳感器具有較高的靈敏度和較低的成本，因此，在生物環(huán)境檢測(cè)、生物體內(nèi)相關(guān)標(biāo)志物檢測(cè)和癌癥早期篩查等有方面有著較好的應(yīng)用前景。

2.1 生物環(huán)境檢測(cè)應(yīng)用

生物環(huán)境與人們的生產(chǎn)生活等方面息息相關(guān)，尤其在食品安全方面的相關(guān)檢測(cè)需要更加準(zhǔn)確且便捷。其中常見的檢測(cè)物質(zhì)是H2O2，H2O2經(jīng)常作為穩(wěn)定劑、防腐劑、漂白劑或于消毒劑來(lái)使用，尤其是牛奶等相關(guān)飲品的處理和包裝當(dāng)中，殘留的H2O2可能對(duì)人體造成一定的危害，所以對(duì)于食品中H2O2的檢測(cè)具有重要意義。Fu等［49］通過簡(jiǎn)單的溶劑熱方法制備了MIL-88B-Fe-MOF納米酶，證明其具有良好的酶活性，并建立基于該納米酶的比色傳感平臺(tái)。該傳感平臺(tái)在10~100 μmol/L范圍內(nèi)表現(xiàn)出較高的靈敏度，其用于牛奶和啤酒樣品中H2O2的可行性得到了初步驗(yàn)證。上述工作體現(xiàn)了納米酶在食品分析檢測(cè)中的巨大潛力。與大尺寸的Fe基納米酶相比，超小型的量子點(diǎn)水溶性可以大大提高，同時(shí)也增強(qiáng)了其與底物之間的親和能力。2022年，Li等［50］通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用兩步水熱法制備的超小型Fe3O4量子點(diǎn)，比Fe3O4納米顆粒具有更高的酶活性，并用海藻酸鈉（SA）將所制備的量子點(diǎn)包覆，不僅提高了量子點(diǎn)的水溶性同時(shí)也顯著增強(qiáng)了其酶活性。酶活性的顯著提高可能歸因于SA基質(zhì)的引入可以很好地增強(qiáng)納米酶與TMB之間的親和力。此外，利用SA的強(qiáng)成膜功能，他們將TMB涂覆在陣列毛細(xì)管上，開發(fā)并建立了一種陣列毛細(xì)管的快速比色分析方法，其濃度檢測(cè)范圍可以達(dá)到10~400 μmol/L，這種便攜式比色傳感裝置可以提高現(xiàn)場(chǎng)評(píng)估能力，同時(shí)也有望應(yīng)用于食品安全的檢測(cè)中。與單純的納米顆粒相比，具有三維結(jié)構(gòu)的納米酶由于其具有更高的比表面積進(jìn)而會(huì)增加與底物之間的接觸面積，從而對(duì)催化活性有一定的提高。本課題組制備了具有獨(dú)特三維結(jié)構(gòu)的ZIF-67/rGO納米酶，并制作了基于該納米酶的生物傳感平臺(tái)（圖5），實(shí)現(xiàn)了對(duì)H2O2的靈敏檢測(cè)（檢測(cè)限低至3.81 μmol/L），同時(shí)也通過對(duì)牛奶樣品中H2O2的檢測(cè)，證明了其作為比色生物傳感器具有很大的適用性，為一些實(shí)際應(yīng)用檢測(cè)提供了很大的幫助［51］?？寡趸瘎┰谑澄锵到y(tǒng)中的綜合活性是生物或食物環(huán)境等分析中必不可少的參數(shù)之一，選擇具有較強(qiáng)抗氧化能力的食物可以在一定程度上減少致病的風(fēng)險(xiǎn)，延長(zhǎng)壽命［52］。Liang等［53］從墨魚汁中提取天然黑色素納米顆粒作為載體并以Fe3+進(jìn)行功能化，得到具有較高穩(wěn)定性和活性的Fe-NMPs納米酶，用于生物環(huán)境中抗壞血酸（AA）的檢測(cè)，檢測(cè)范圍為5~250 μmol/L，最低檢出限達(dá)到12.61 μmol/L，測(cè)試結(jié)果與飲料和水果中結(jié)果相似，驗(yàn)證了該納米酶進(jìn)行實(shí)際抗氧化能力檢測(cè)的可行性［53］。谷胱甘肽（GSH）作為一種天然多肽存在于穩(wěn)定的細(xì)胞環(huán)境中，維持著正常生物體的免疫系統(tǒng)功能，血漿中GSH異常會(huì)導(dǎo)致衰老、心血管疾病等［54］，Li等［55］首先制備了WS2材料，將其應(yīng)用于GSH檢測(cè)，在100 pmol/L~10 nmol/L范圍內(nèi)均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，這也為食品以及細(xì)胞環(huán)境GSH的測(cè)定提供了有力的幫助和支持。

Fig. 5 Schematic of the colorimetric detection of H2O2 using daisy-like ZIF-67/rGO nanozyme biosensor platform［51］圖5 基于ZIF-67/rGO生物傳感平臺(tái)比色檢測(cè)H2O2示意圖［51］

2.2 生物標(biāo)志物檢測(cè)應(yīng)用

疾病的發(fā)生一般會(huì)引起體內(nèi)某種標(biāo)志物的特征性指標(biāo)發(fā)生變化，從而可以通過測(cè)定特定的生物標(biāo)志物以獲得生物體所處狀態(tài)。本文將對(duì)乙酰膽堿、膽固醇、葡萄糖等生物體內(nèi)重要標(biāo)志物的檢測(cè)及相關(guān)的檢測(cè)原理進(jìn)行總結(jié)，同時(shí)也為其他相關(guān)標(biāo)志物的檢測(cè)和應(yīng)用提供一定的思路和方向。

2.2.1 乙酰膽堿的檢測(cè)

乙酰膽堿（ACh）在生物體內(nèi)發(fā)揮著不可或缺的作用。作為重要的神經(jīng)遞質(zhì)，ACh在生物體內(nèi)的神經(jīng)信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要作用，其紊亂與一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如阿爾茨海默病、帕金森病［56］等，密切相關(guān)。準(zhǔn)確地測(cè)定生物體內(nèi)ACh含量對(duì)于臨床診斷相關(guān)疾病具有十分重要的意義。ACh的檢測(cè)原理是，首先AChE降解ACh后生成膽堿，在溶解氧的存在下，膽堿氧化生成甜菜堿和H2O2，H2O2在納米酶的催化下，可以將一些顯色底物進(jìn)行氧化，生成肉眼可見的有色物質(zhì)。

Ni等［57］采用Ag［I］離子-TMB通過比色法對(duì)AChE及其抑制劑進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)表明，該方法具有較高的靈敏度，檢測(cè)限可以達(dá)到4.3 nU/L。該系統(tǒng)也可以應(yīng)用于AChE抑制劑的檢測(cè)。該系統(tǒng)檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，靈敏度較高，具有較好的應(yīng)用前景。2019年，Lu課題組［1］設(shè)計(jì)了一種基于膽堿氧化酶/氧化鈷（CHO/CoOOH）的新型比色傳感器，用于AChE的靈敏檢測(cè)，并將其制備成試紙條，可以目視和定性地檢測(cè)AChE，同時(shí)使用智能手機(jī)和Image J軟件實(shí)現(xiàn)對(duì)AChE的定量檢測(cè)。該組也開發(fā)了一種新的基于蛋白質(zhì)-無(wú)機(jī)雜交納米花作為人工過氧化物酶的比色傳感器（圖6）該傳感器主要包括一個(gè)測(cè)試工具和一個(gè)智能手機(jī)閱讀器，可以較為準(zhǔn)確地測(cè)定人體血清中的ACh。Lu課題組利用該平臺(tái)制備了用于ACh快速定性監(jiān)測(cè)的便攜式瓊脂糖凝膠試劑盒，結(jié)合手機(jī)Image J程序，將檢測(cè)試劑的圖像信息轉(zhuǎn)化為色相參數(shù)，為檢測(cè)ACh提供了直接的定量工具［58］。Lu課題組方案的提出不僅為檢測(cè)溶液中的ACh提出了新的想法，也為檢測(cè)方法的實(shí)際應(yīng)用提供了更多的便利。通過將紙基和瓊脂糖等器件與智能手機(jī)有機(jī)結(jié)合，成功構(gòu)建了AChE監(jiān)測(cè)傳感器，為臨床應(yīng)用提供了新的設(shè)計(jì)方案。

Fig. 6 Determination of acetylcholine in serum and its absorption spectrum by protein-inorganic hybrid nanoflowers圖6 蛋白質(zhì)-無(wú)機(jī)雜交納米花檢測(cè)血清中乙酰膽堿及吸收光譜

2.2.2 膽固醇的檢測(cè)

膽固醇的測(cè)定對(duì)于多種臨床疾?。ㄈ纾旱偷鞍装Y、貧血、敗血癥、營(yíng)養(yǎng)不良、高血壓、冠心病、動(dòng)脈硬化以及心肌梗死等）的診斷以及預(yù)防具有重要意義［59］。建立一種簡(jiǎn)單方便、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的膽固醇準(zhǔn)確檢測(cè)方法十分重要。膽固醇［60］在膽固醇氧化酶存在的情況下，可以產(chǎn)生膽甾烯酮和H2O2，進(jìn)而H2O2將顯色底物氧化，從而達(dá)到比色法檢測(cè)的目的。

Hong等［61］通過耦合具有過氧化物酶活性的聚吡咯納米粒子（PPy NPs）和膽固醇氧化酶（ChOx），構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單、方便的利用比色法對(duì)膽固醇進(jìn)行檢測(cè)的方法，其線性范圍為10~100 μm，檢測(cè)限為3.5 μm。他們利用該體系設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)易的檢測(cè)試劑盒，實(shí)現(xiàn)了對(duì)人體血清中膽固醇可視化檢測(cè)，為臨床診斷以及健康管理提供了有力的幫助。目前，有越來(lái)越多的檢測(cè)方案采用有機(jī)分子對(duì)無(wú)機(jī)納米材料進(jìn)行一定的修飾，以獲得更好的催化活性，從而對(duì)生物分子進(jìn)行更靈敏的檢測(cè)。Liu課題組［62］用5,10,15,20-四（4-羧基苯基）卟啉功能化NiS2納米顆粒，然后將其錨定在石墨烯（Por-NiS2/GO）表面。卟啉分子和二維石墨烯的引入極大增強(qiáng)了Por-NiS2/GO的過氧化物酶活性。由此，他們構(gòu)建了基于Por-NiS2/GO納米酶的快速、靈敏且具有選擇性的比色生物傳感平臺(tái)（圖7），通過對(duì)血清樣本中膽固醇的檢測(cè)驗(yàn)證了其有效性。該組還采用簡(jiǎn)單有效的溶劑熱方法制備了5,10,15,20-四（4-羧基苯基）卟啉功能化NiCo2S4蛋黃殼納米球（Por-NiCo2S4），證明與純NiCo2S4納米顆粒相比，Por-NiCo2S4具有更加明顯的催化活性，并結(jié)合膽固醇氧化酶（Chox）建立基于Por-NiCo2S4的比色生物傳感平臺(tái)，該平臺(tái)可在0.1~9.0 mmol/L范圍內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限低至19.36 μmol/L。該納米酶也成功用于測(cè)定人體血清中的膽固醇水平［63］。將無(wú)機(jī)納米材料與有機(jī)分子進(jìn)行復(fù)合可以在一定程度上增強(qiáng)其過氧化酶活性，有機(jī)分子的引入也可以在一定程度上增強(qiáng)其水溶性，避免了部分納米酶水溶性不好的問題，為納米酶的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用于更多生物分子的檢測(cè)提供了思路和可能。

Fig. 7 Schematic illustration of the fabrication procedure of Por-NiS2/GO and the process of detecting cholesterol［62］圖7 Por-NiS2/GO納米酶的制備和檢測(cè)膽固醇過程的示意圖［62］

2.2.3 葡萄糖的檢測(cè)

葡萄糖在細(xì)胞新陳代謝中發(fā)揮重要作用，是生物體的重要能量來(lái)源，對(duì)于維持人體正常的生理功能具有重要意義。越來(lái)越多的研究者也致力于葡萄糖檢測(cè)研究。通常檢測(cè)葡萄糖的機(jī)理如下，由于葡萄糖氧化酶（GOx）存在時(shí)，可以將葡萄糖氧化為葡萄糖酸，同時(shí)產(chǎn)生H2O2，然后再對(duì)顯色底物TMB進(jìn)行氧化，得到不同葡萄糖濃度與吸光度之間的線性關(guān)系［64］。2018年，Vinita等［65］在二硫化鉬上修飾金納米粒子簡(jiǎn)單合成了AuNPs@MoS2-QD，構(gòu)成了一個(gè)比色法檢測(cè)平臺(tái)，該平臺(tái)在室溫下性能穩(wěn)定，可以對(duì)葡萄糖進(jìn)行靈敏和選擇性分析。Wang等［66］通過在還原氧化石墨烯（rGO）上修飾MoS2納米花和V2O5納米顆粒得到一種新的納米酶（3D V2O5-MoS2/rGO），并證明其具有過氧化物酶活性，可以對(duì)人體血樣和尿液中的葡萄糖可以靈敏檢測(cè)。三維納米酶的制備在一定程度上更好地提供了催化位點(diǎn)，與rGO的復(fù)合也更大程度上解決了MoS2的水溶性差的問題，進(jìn)一步提高了納米酶的催化活性。越來(lái)越多的納米酶采用綠色合成的方法，在保證無(wú)污染、催化活性高的同時(shí)也更好地增加了其生物相容性。2021年，Alle等［67］采用新型微波綠色原位合成陽(yáng)離子納米纖維（C.CNF）負(fù)載金納米粒子（AuNPs）的方法，合成了（AuNPs@C.CNF）納米酶薄膜，并建立基于此的比色生物傳感平臺(tái)，此平臺(tái)具有靈敏、快速、操作簡(jiǎn)單和可回收等優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)、生物檢測(cè)等相關(guān)領(lǐng)域具有十分廣闊的前景。

2.3 癌癥診斷應(yīng)用

21世紀(jì)，癌癥已嚴(yán)重地影響了人類健康，目前對(duì)于癌癥的診斷、篩查手段主要有CT和核磁共振檢查等，但是無(wú)論哪種檢測(cè)方法對(duì)于身體都是有一定的傷害。有報(bào)道指出，癌細(xì)胞內(nèi)H2O2的含量明顯高于人體正常細(xì)胞內(nèi)H2O2的含量［68］，可以通過對(duì)H2O2的含量檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)癌癥的診斷做到早期干預(yù)和治療。Zhang等［69］通過將多孔鉑納米粒子原位生長(zhǎng)在氧化石墨烯的表面獲得了具有較強(qiáng)過氧化物酶活性的納米酶，成功對(duì)乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）中的H2O2進(jìn)行比色檢測(cè)。2021年，Lian等［70］通過調(diào)節(jié)聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）作為不同的模板劑，設(shè)計(jì)了一種雙金屬硫化物NiCo2S4（PVP）和NiCo2S4（CTAB）納米材料，并證明NiCo2S4（PVP）NP表現(xiàn)出優(yōu)異的過氧化物酶活性和高特異性。NiCo2S4（PVP）NP具有優(yōu)異的催化活性的主要可能歸因于其具有較高的Ni/Co比，而較高的特異性則歸因于TMB的陽(yáng)離子與NiCo2S4（PVP）NP陰離子之間的強(qiáng)靜電驅(qū)動(dòng)協(xié)同作用，在較強(qiáng)的靜電驅(qū)動(dòng)作用下進(jìn)行檢測(cè)可以在一定程度上增強(qiáng)其特異性。雙金屬硫化物的構(gòu)建也使NiCo2S4（PVP）NP穩(wěn)定性在一定程度上有所增強(qiáng)。以NiCo2S4（PVP）NP基納米酶模擬物作為傳感平臺(tái)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)H2O2的高靈敏、高選擇檢測(cè)，在具有良好的生物相容性的同時(shí)生物毒性較低，可以檢測(cè)人乳腺癌（MDA-MB-231）細(xì)胞中產(chǎn)生的H2O2，這為建立高特異性納米酶提供了新的方向和思路。

2.4 病毒、重金屬檢測(cè)應(yīng)用

納米酶還可用于對(duì)病毒、重金屬離子等的檢測(cè)。Khoris等［71］通過采用自組裝的方法制備了蛋白質(zhì)-無(wú)機(jī)銅納米花作為納米酶，并通過自組裝和納米共沉淀制備了TMB-NP包覆PLGA納米囊泡作為信號(hào)放大源，該方法用于高選擇和高靈敏度地檢測(cè)流感病毒（IV）/A，在緩沖液和血清中的檢出限分別低至32.37 pg/L和54.97 pg/L，該方法還可檢測(cè)到臨床分離的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）IV/A/H3N2和刺突蛋白，檢出限分別為17 pfu/ml和143 fg/L，實(shí)現(xiàn)了較高靈敏度的檢測(cè)。Khoris等的方法為各種呼吸道感染病毒的檢測(cè)提供了一個(gè)可靠、易于適應(yīng)且高靈敏的檢測(cè)平臺(tái)。Buyuksunetci等［72］合成了具有磁性的γFe2O3納米酶，并通過比色法檢測(cè)了SARS-CoV-2，同時(shí)也將其應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)，得到的結(jié)果與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)法一致，同時(shí)該方法也可以很好地應(yīng)用于新冠病毒α型的變異檢測(cè)，該檢測(cè)系統(tǒng)為新型冠狀病毒感染（COVID-19）疑似病例的診斷和篩查提供了強(qiáng)有力的支持和保障。如今，公眾越來(lái)越注重健康和環(huán)保，所以快速、高靈敏度和高選擇性地對(duì)水中有毒物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)也具有重要意義。Zhang等［73］通過化學(xué)鍵合成了rGO/PEI/Au納米酶，當(dāng)溶液中存在微量Cr6+離子時(shí)，在納米酶的催化下，可以觸發(fā)TMB與H2O2的反應(yīng)，從而產(chǎn)生視覺上的變化，實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)，檢測(cè)限低至2.14 nmol/L；Borthakur等［74］采用溶劑熱的方法合成了CuS/prGO和NiS/p-rGO納米酶，當(dāng)H2O2存在時(shí)，納米酶可以催化其氧化TMB，而Hg（II）存在時(shí)可以抑制納米酶的氧化，阻斷催化活性位點(diǎn)，降低催化效率，從而達(dá)到可視化檢測(cè)的目的，合成的CuS/prGO和NiS/p-rGO納米酶對(duì)Hg（II）的靈敏度可達(dá)13.05 nmol/L和48.73 nmol/L。

3 總結(jié)與展望

本文主要對(duì)常見幾種標(biāo)志物——乙酰膽堿、膽固醇和葡萄糖的檢測(cè)進(jìn)展和檢測(cè)原理以及癌癥的早期篩查和診斷進(jìn)行了相關(guān)綜述和介紹，同時(shí)也對(duì)其他方面如病毒和重金屬離子的相關(guān)檢測(cè)進(jìn)行了介紹和分析，這將為生物體內(nèi)其他標(biāo)志物的檢測(cè)以及醫(yī)學(xué)上檢測(cè)和早期診斷提供了有力支持和保障。

目前基于納米酶在生物傳感領(lǐng)域研究與應(yīng)用的綜述很多，但是都僅給出了基于納米酶在傳感領(lǐng)域的相關(guān)檢測(cè)應(yīng)用和一些納米酶的進(jìn)展，并未全面給出基于納米酶的比色生物傳感器的相關(guān)檢測(cè)機(jī)理，本文綜述了納米酶的相關(guān)典型分類以及對(duì)生物物質(zhì)的檢測(cè)原理和相關(guān)機(jī)理，同時(shí)也對(duì)目前基于納米酶的比色生物傳感器總結(jié)出以下問題并進(jìn)行展望。

3.1 現(xiàn)存問題

作為天然酶替代物的納米酶與底物的特異性關(guān)系尚未很好地解決；目前存在的納米酶的反應(yīng)類型對(duì)于所有酶反應(yīng)來(lái)說(shuō)還不夠全面；納米酶的生物毒性以及生物相容性還有待進(jìn)一步探索。

3.2 展望

可以通過引入一些配體（如適配體或分子聚合物等），采用底物結(jié)合特異性較高的材料進(jìn)行復(fù)合，擴(kuò)大可適用的催化條件等以提高納米酶與底物的特異性關(guān)系。目前納米酶的反應(yīng)類型主要有氧化還原、水解等，未來(lái)需要對(duì)于不同納米酶種類的反應(yīng)進(jìn)行分類研究，進(jìn)一步增加納米酶的類酶種類，以適應(yīng)更多的酶反應(yīng)。由于納米酶在未來(lái)是面向生物檢測(cè)，所以在提高納米酶的酶活性的同時(shí)也要考慮其生物相容性、生物毒性，以及是否會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，也可以對(duì)納米酶進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋砻嫘揎?，?zhēng)取研制出綠色、環(huán)保的納米酶以更好地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)。