孫雅嫻 田雨昕

腸道菌群與人類互惠共生,輔助宿主維持正常生理功能,其構(gòu)成和數(shù)量一定程度上可以反映宿主的健康狀態(tài)。目前研究［1］顯示,腸道菌群參與肥胖、感染、糖尿病等的發(fā)生發(fā)展。糖尿病對(duì)人體的危害主要表現(xiàn)在糖尿病的并發(fā)癥,在糖尿病患者中,有25%～40%的患者將發(fā)展為DKD,這類患者心血管疾病的發(fā)病率和死亡率也大大增加［2］。DKD 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前認(rèn)為是多因素綜合作用的結(jié)果,糖尿病患者一旦進(jìn)展為DKD,病情無法逆轉(zhuǎn)。腸道菌群作為糖尿病重要的環(huán)境影響因素,對(duì)其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展也起到了重要作用,對(duì)無并發(fā)癥T2DM 與早期DKD 患者腸道菌群的特異性深入研究,有可能找到糖尿病進(jìn)展為DKD 的診斷依據(jù)與治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院內(nèi)分泌科2021 年9 月～2022 年3 月就診的23 例無并發(fā)癥T2DM患者作為T2DM 組,29 例早期DKD 患者作為DKD 組,20 例健康體檢者作為對(duì)照組。T2DM 組男11 例,女12 例；平均年齡(55.87±6.46)歲。DKD 組男14 例,女15 例；平均年齡(56.17±5.51)歲。對(duì)照組男10 例,女10 例；平均年齡(53.10±5.19)歲。三組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

1.2 診斷及排除標(biāo)準(zhǔn) ①符合1999 年WHO 2 型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)；②尿微量白蛋白/Cr 30～299 mg/g 持續(xù)時(shí)間>3 個(gè)月。排除糖尿病急癥,其他類型腎臟疾病,合并肝膽、血液系統(tǒng)、其他內(nèi)分泌疾病；近2 周內(nèi)未服用微生態(tài)制劑,無腹瀉。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料收集及血脂、腎功能、血常規(guī)指標(biāo)檢測(cè) 記錄三組研究對(duì)象的糖尿病病程、BMI、血壓(收縮壓、舒張壓)。HITACHI 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)三組研究對(duì)象的FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C、UA、Cr。血細(xì)胞全自動(dòng)分析儀XN1000 檢測(cè)血常規(guī),包括PLT、lymph-cell、NLR。

1.3.2 糞便菌群多樣性檢測(cè) 留取三組研究對(duì)象2 g 糞便置于無菌容器送檢,住院患者標(biāo)本均取自入院后首次收集檢測(cè)。用E.Z.N.A.? Stool DNA kit 試劑盒(Omega,美國(guó))提取糞便菌群DNA。以16S rRNA 基因V3 區(qū)特異性序列為靶標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增,引物序列為下游引物 5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’,上游引物5’-CGC CCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG CCTACGGGAGGCAGCAG-3’,其中CGCCCGGGGCGCG CCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG 為GC 夾。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸30 s,共30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min,4℃15 min。使用Thermocycler PCR 儀,試劑為DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) (Thermo,美 國(guó))。UVI 全 自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)PCR 擴(kuò)增的結(jié)果,并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行DGGE。選取明顯有差異的條帶切膠測(cè)序(寶生物公司TaKaRa,大連,中國(guó)),所得序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基于局部比對(duì)算法的搜索工具(Blast)對(duì)比分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 ()表示,采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組臨床資料比較 T2DM 組和DKD 組收縮壓、BMI 均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DKD組收縮壓高于T2DM 組,糖尿病病程長(zhǎng)于T2DM 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；三組舒張壓比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 三組臨床資料比較()

表1 三組臨床資料比較()

注：與對(duì)照組比較,aP<0.05；與T2DM 組比較,bP<0.05

2.2 三組血脂指標(biāo)、腎功能指標(biāo)及血常規(guī)指標(biāo)比較T2DM 組FPG 和TG 高于對(duì)照組,HDL-C 低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DKD 組NLR、UA 高于T2DM組和對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 三組血脂指標(biāo)、腎功能指標(biāo)及血常規(guī)指標(biāo)比較()

表2 三組血脂指標(biāo)、腎功能指標(biāo)及血常規(guī)指標(biāo)比較()

注：與對(duì)照組比較,aP<0.05；與DKD 組比較,bP<0.05

2.3 三組腸道菌群PCR-DGGE 指紋圖譜分析 三組研究對(duì)象圖譜間有5 條較明顯的差異條帶,即箭頭所指的“1～5”,對(duì)照組較明顯的為“1、5”,T2DM 組較明顯的為“2”,DKD 組較明顯的為“4”,三組研究對(duì)象均有“3”。三組研究對(duì)象圖譜間條帶的數(shù)目、位置、亮度均不相同,代表了三組腸道菌群指紋圖譜的多樣性存在差異。見圖1。

圖1 三組研究對(duì)象腸道菌群PCR-DGGE 指紋圖譜分析

2.4 三組腸道菌群差異細(xì)菌切膠測(cè)序結(jié)果分析 三組均含有雙歧桿菌屬；對(duì)照組與T2DM 組差異較明顯的兩個(gè)條帶為普雷沃氏菌屬和乳桿菌屬；T2DM 組與對(duì)照組和DKD 組差異較明顯的細(xì)菌為真桿菌屬；DKD組與T2DM 組和對(duì)照組差異較明顯的細(xì)菌為普氏梭桿菌屬。見表3。

表3 三組腸道菌群差異細(xì)菌切膠測(cè)序結(jié)果分析

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中,T2DM 組細(xì)菌種屬和豐度明顯少于對(duì)照組,優(yōu)勢(shì)菌群的組成也發(fā)生了變化,腸道內(nèi)普雷沃氏菌屬(擬桿菌門)、乳桿菌屬和雙歧桿菌屬減少,T2DM組真桿菌屬占優(yōu)勢(shì),DKD 組普氏梭桿菌屬占優(yōu)勢(shì)。糖尿病患者持續(xù)高血糖狀態(tài)增加了腸道內(nèi)氧化應(yīng)激的水平,對(duì)腸道菌群的定植造成壓力,長(zhǎng)期服用藥物破壞腸道菌群的平衡狀態(tài)。腸道細(xì)菌總數(shù)減少,其釋放的細(xì)胞外三磷酸腺苷(eATP)也減少,造成脂肪酸、葡萄糖等物質(zhì)在細(xì)胞外堆積,促進(jìn)糖尿病的發(fā)生發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)中,糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展與收縮壓、糖尿病病程、NLR、UA 有關(guān)系,三組研究對(duì)象腸道菌群的結(jié)構(gòu)和數(shù)量也存在差異,糖尿病患者腸道菌群的特異性有可能參與了DKD 的發(fā)生發(fā)展。糖尿病微血管病變引起的血流動(dòng)力學(xué)改變被認(rèn)為是DKD 發(fā)生的關(guān)鍵因素,甚至是啟動(dòng)因素。腸道菌群發(fā)酵膳食纖維生成的短鏈脂肪酸(SCFAs)目前確定有4 個(gè)G 蛋白偶聯(lián)受體,其中G 蛋白偶聯(lián)受體41(GPR41)和嗅覺受體78(Olfr78)位于腎臟,通過調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)參與調(diào)節(jié)血壓［3］。SCFAs 中的乙酸、丙酸主要與這兩種受體結(jié)合,大多由擬桿菌門發(fā)酵產(chǎn)生,可使實(shí)驗(yàn)小鼠的血壓水平快速、大幅度、劑量依賴性地降低［4］。另外,腸道菌群代謝食物中富含膽堿的物質(zhì)生成氧化三甲胺(TMAO),其水平與動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。TMAO 也是尿毒癥毒素之一,與其他腸道菌群發(fā)酵蛋白質(zhì)、碳水化合物等生成的有毒代謝產(chǎn)物一起,促進(jìn)腎小球硬化和間質(zhì)纖維化,加速腎功能惡化［5］。本試驗(yàn)中DKD 組UA 顯著升高,高尿酸血癥可誘發(fā)氧化應(yīng)激,引起腎間質(zhì)炎癥,同時(shí)腸道內(nèi)尿素蓄積,轉(zhuǎn)化為氨及氫氧化銨使腸道pH 值增高,糖尿病患者異常的脂質(zhì)代謝,使得腸道緊密連接蛋白表達(dá)減少,菌群失調(diào)又使得腸道通透性增加,細(xì)菌產(chǎn)生的炎性物質(zhì)持續(xù)滲透到血液循環(huán),導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥,加速DKD 的進(jìn)展。DKD患者由于控制膳食纖維攝入、長(zhǎng)期使用藥物、葡萄糖代謝受損、慢性低水平炎癥狀態(tài)等原因使得腸道微生態(tài)失調(diào),腸道屏障功能破壞,腸源性脂多糖入血,尿毒癥毒素積累,激活免疫系統(tǒng)和炎癥通路,病程越長(zhǎng),代謝紊亂及腸道微生態(tài)失調(diào)持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng),加速病程發(fā)展。

T2DM 發(fā)病機(jī)制的兩個(gè)要素為胰島素抵抗和分泌不足,胰島素抵抗和肥胖、脂代謝異常及慢性低水平炎癥反應(yīng)等因素相關(guān)。食物中不能被宿主腸道消化吸收的大分子碳水化合物纖維等被腸道中細(xì)菌尤其是擬桿菌門、厚壁菌門等厭氧菌分解為SCFAs,主要包括乙酸、丙酸、丁酸等,并具有生物學(xué)效應(yīng)［6］。研究發(fā)現(xiàn),DKD 患者腸道菌群較健康人群存在約190 種細(xì)菌相對(duì)豐度的差異,以產(chǎn)SCFAs 細(xì)菌相對(duì)豐度減少為主要表現(xiàn),且腸道內(nèi)產(chǎn)丁酸酶減少,而含有形成丁酸關(guān)鍵酶的普雷沃菌,其相對(duì)豐度也減少［7,8］。SCFAs 可抑制炎癥因子的生成；激活GPR41、G 蛋白偶聯(lián)受體43(GPR43),促進(jìn)結(jié)腸L 細(xì)胞釋放肽YY(PYY)和胰高血糖素樣肽(GLP-1),進(jìn)而改善胰島功能,降低餐后血糖、血壓、改善血脂代謝異常,降低T2DM 患者體脂量［9］。目前研究證實(shí),腸道細(xì)菌和全身慢性炎癥反應(yīng)緊密相關(guān),其中真桿菌屬可以引起內(nèi)源性感染；乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)量的減少會(huì)使更多的內(nèi)毒素脂多糖釋放入血,引發(fā)代謝性內(nèi)毒素血癥,造成炎癥和代謝紊亂,而其數(shù)量的增加則可以使糖耐量和葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌水平得以改善［10］。隨著DKD 進(jìn)展,尿毒癥毒素在患者體內(nèi)逐漸積累,其中的蛋白結(jié)合毒素在腎病患者腸道中主要由梭桿菌科、腸桿菌科合成,這種可與蛋白結(jié)合的小分子毒素的增加促進(jìn)了血管內(nèi)皮功能障礙,直接或間接地對(duì)腎臟以及心血管系統(tǒng)造成了損害［11,12］。本實(shí)驗(yàn)中,T2DM 組的FPG、BMI 及TG 均高于對(duì)照組,HDL-C 低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NLR 作為炎癥指標(biāo),DKD 組NLR 高于T2DM 組和對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與上述研究相符。

綜上所述,糖尿病與腸道菌群失調(diào)的關(guān)系得到較多關(guān)注,腸-腎軸理論的提出進(jìn)一步指出了腸道與腎臟間存在緊密聯(lián)系,菌群失調(diào)與腎臟損傷互為因果。本實(shí)驗(yàn)是橫斷面研究,選取樣本量有限,且DGGE 技術(shù)具有局限性,無法將腸道微生態(tài)失調(diào)與DKD 間建立明確的因果關(guān)系,但在疾病發(fā)展早期,針對(duì)不同的菌群變化特征分階段干預(yù),進(jìn)而恢復(fù)腸道微生態(tài)穩(wěn)態(tài),是未來可以考慮的研究及治療方向。