于 艷, 于程程, 韓亞琨

（吉林醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院口腔科，吉林 吉林 132013）

牙周炎是牙周致病菌感染所引發(fā)的牙周支持組織進行性破壞性疾?。?］。除牙齦組織炎癥外，牙周炎患者還表現出典型的牙槽骨吸收和牙周袋形成。牙周炎晚期患者還會出現宿主牙齒松動和脫落［2］。除影響口腔功能外，牙周炎也被證實與多種系統(tǒng)性疾病存在交互作用［3］。類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關節(jié)區(qū)骨組織破壞和炎癥性滑膜為主要臨床癥狀的關節(jié)炎癥［4］。RA 可累及手、足、肩、膝甚至顳下頜等關節(jié)部位，除引發(fā)關節(jié)畸形和功能障礙外，還可伴發(fā)心、腎和肺等多器官功能異常［5］。研究［6］發(fā)現：牙周炎和RA 之間存在相關性。相比于普通患者，RA患者的牙周炎發(fā)病率更高且進展更為迅速，牙周炎的治療也可在一定程度上促進RA 的緩解，但牙周炎和RA 在病理機制上的內在聯系尚未完全闡明［7］。研究［8］發(fā)現：B 淋巴細胞介導的骨免疫在牙周炎和RA 的骨破壞進程中均發(fā)揮了重要作用。作為B 淋巴細胞的重要功能性亞群，漿細胞既可分泌抗體參與體液免疫，也可表達多種細胞因子調節(jié)免疫反應［9］。漿細胞是牙周炎患者局部核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）等多種骨免疫因子的主要來源［10］。RANKL 可與位于前破骨細胞表面的核因子κB 受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）結合，并進一步誘導破骨細胞的分化和成熟。該機制在牙槽骨炎癥性破壞中發(fā)揮了重要作用［11］。國外研究［12］也證實了漿細胞在RA 病程中有同樣的效應。采用B 淋巴細胞拮抗療法可有效抑制關節(jié)區(qū)的炎癥反應并抑制骨組織的破壞［13］。因此，漿細胞的增殖活化和RANKL表達可能是牙周炎與RA 間的潛在交互機制。本研究采用臨床評價、免疫分析和細胞實驗等多種方法分析不同類型研究對象牙周臨床指標、牙齦漿細胞表型特點及RANKL 表達情況，評價牙齦組織中增殖 誘 導 配 體 （a proliferation-inducing ligand，APRIL）及B 淋巴細胞刺激因子（B lymphocyte stimulator，BLyS）等B 淋巴細胞生長分化效應因子表達水平，為探討牙周炎與RA 的致病機制及交互作用提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇2019 年1 月—2019 年12 月于吉林醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院口腔科就診的研究對象60 例。納入標準：① 年齡18～60 歲；② 無系統(tǒng)性疾病、口腔基本健康且余留牙不少于20 顆；③ 近期無重大手術和近半年未接受過牙周治療；④ 3 個月內無抗生素、非甾體藥物和免疫調節(jié)劑服藥史；⑤非妊娠期或哺乳期女性；⑥無其他不能配合本項研究的因素。將60 例研究對象按入組標準分為健康組、牙周炎組和牙周炎+RA 組，每組20 例。健康組：符合納入標準，且牙周組織健康；牙周炎組：符合納入標準，且明確診斷為慢性牙周炎（依據1999 年美國牙周病分類研討會標準［14］）；牙周炎+RA 組：符合納入標準，且明確診斷為慢性牙周炎，明確診斷為RA（依據1987 年美國風濕病學會標準［15］）。

1.2 主要試劑和儀器RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國賽默飛公司），PBS 緩沖液（北京索萊寶公司），流式細胞術抗體CD38、CD138 和RANKL（美國BD公司），青-鏈霉素雙抗（北京索萊寶公司），實時熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒（美國普洛麥格公司），抗酒石酸酸性磷酸酶 （tartrate-resistant acid hosphatase，TRAP）染色試劑盒（美國西格瑪公司），淋巴細胞分離液（武漢云克隆公司）。RTqPCR 儀（美國ABI 公司），恒溫CO2培養(yǎng)箱（美國Labconco 公司），流式細胞儀（美國BD 公司），酶標儀（德國珀金埃爾默公司）。

1.3 牙周指標評價牙周指標包括各組研究對象余留牙的牙齦指數（gingiva index，GI）、牙周袋探診深度（probing depth，PD）、探診出血指數（bleeding on probing，BOP）和臨床附著喪失量（clinical attachment loss，CAL）。所有評價均由同一醫(yī)師采用雙盲模式完成。記錄上述指標并進行對比分析。

1.4 RT-qPCR 法檢測各組研究對象牙齦組織中APRIL 和BLyS mRNA 表達水平健康組研究對象取拔除智齒時或口內手術時切除的健康牙齦，牙周炎組和牙周炎+RA 組患者取病變不保留患牙的牙齦組織。制備單細胞懸液，裂解細胞并提取總RNA，采用逆轉錄法制備cDNA，采用RT-qPCR法檢測各組研究對象牙齦組織中APRIL 和BLyS mRNA 表達水平。引物序列：APRIL F 5′-GGGGGGCAGTTCTGGGGGCT-3′，R 5′-CCAGGCTCCCAGGACATCAGG-3′；BLyS F 5′-TGCCACCACCGCGCCTCTGT-3′，R 5′-CGCGGACAACCCTGGAGCCC-3′。反應條件：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s；95 ℃、15 s；60 ℃、1 min；95 ℃、15 s；60 ℃、15 s；共40 個循環(huán)。采用2－ΔΔCt法計算各組研究對象牙齦組織中目的基因表達水平。

1.5 流式細胞術檢測各組研究對象牙齦組織中CD38+和CD138+細胞百分率按“1.3”步驟方法獲取各組研究對象牙齦組織，制備單細胞懸液。采用密度梯度離心分離牙齦組織中的淋巴細胞，采用CD19 磁珠分選法提取總淋巴細胞中的B 淋巴細胞。采用流式細胞術檢測各組研究對象牙齦組織中CD38+和CD138+細胞百分率。

1.6 流式細胞術和酶聯免疫吸附測定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）法檢測各組研究對象牙齦漿細胞中RANKL+細胞百分率和細胞培養(yǎng)上清液中RANKL 水平取上述分選的牙齦漿細胞置于RPMI 1640 培養(yǎng)基中，并按20 μg·L－1加入佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h。離心法分離培養(yǎng)基上清液和細胞。采用流式細胞術檢測各組細胞中RANKL+細胞百分率，采用ELISA 法檢測各組細胞培養(yǎng)基上清液中RANKL 水平。

1.7 TRAP 染色觀察各組研究對象破骨樣細胞生長情況取同源外周血單核細胞作為前破骨細胞，置于“1.6”步驟中分離的培養(yǎng)基上清液中培養(yǎng)。于培養(yǎng)基內加入 25 μg·L－1巨噬細胞集落刺激因子，將正常誘導破骨樣細胞作為anti-RANKL 對照組。所有細胞于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h 后，采用TRAP 染色觀察培養(yǎng)基內破骨樣細胞生成情況，記錄并分析各組研究對象破骨樣細胞數。

1.8 RT-qPCR 法檢測各組研究對象牙齦漿細胞中RANKL 、RANK 和腫瘤壞死因子受體相關分子6（tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6）mRNA表達水平按“1.6”和“1.7”步驟中方法收集各組研究對象牙齦漿細胞，RT-qPCR法檢測各組研究對象牙齦漿細胞中RANKL、RANK 和TRAF6 mRNA 表達水平。反應條件同“1.4”步驟。引物序列：RANKL F 5′-CAGCACTCACTGCTTTTATAGAATCC-3′，R 5′-AGCTGAAGATAGTCTGTAGGTACGC-3′；RANK F 5′-AGATCGCTCCTCCATGTACCA-3′，R 5′-GCCTTGCCTGTATCACAAACTTT-3′；TRAF6，F 5′-ATGCGGCCATAGGTTCTGC-3′，R 5′-TCCTCAAGATGTCTCAGTTCCAT-3′。采用2－ΔΔCt法計算各組研究對象牙齦漿細胞中目的基因表達水平。

1.9 統(tǒng)計學分析采用GraphPad Prism 8 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組研究對象GI、PD、BOP和CAL，牙齦組織中APRIL 和BLyS mRNA 表達水平，CD38+細胞、CD138+細胞和RANKL+細胞百分率，破骨樣細胞數，牙齦漿細胞中RANKL、RANK 和TRAF6 mRNA 表達水平均符合正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組研究對象臨床牙周指標與健康組比較，牙周炎組和牙周炎+RA 組患者GI、PD、BOP 和CAL 均升高（P＜0.05）。與牙周炎組比較，牙周炎+RA 組患者GI 和BOP 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），PD 和CAL 升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組研究對象GI、PD、BOP 和CALTab.1 GI, PD, BOP,and CAL of subjects in various groups（n=20，±s）

表1 各組研究對象GI、PD、BOP 和CALTab.1 GI, PD, BOP,and CAL of subjects in various groups（n=20，±s）

*P＜0.05 compared with health group；△P＜0.05 compared with periodontitis group.

Group Health Periodontitis Periodontitis+RA CAL(l/mm)1.20±0.44 4.20±1.48*4.80±1.64*△GI 0.40±0.55 2.40±0.89*2.60±0.55*PD(l/mm)2.00±1.00 5.40±1.82*6.40±2.41*△BOP 2.00±1.58 13.80±3.11*12.00±3.81*

2.2 各組研究對象牙齦組織中APRIL 和BLyS mRNA 表達水平與健康組比較，牙周炎組和牙周炎+RA 組患者牙齦組織中APRIL 和BLyS mRNA 表達水平均升高（P＜0.05）。與牙周炎組比較，牙周炎+RA 組患者APRIL mRNA 表達水平升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組研究對象牙齦組織中APRIL 和BLyS mRNA 表達水平Tab.2 Expression levels of APRIL and BLyS mRNA in gingiva tissue of subjects in various groups （n=20，±s）

表2 各組研究對象牙齦組織中APRIL 和BLyS mRNA 表達水平Tab.2 Expression levels of APRIL and BLyS mRNA in gingiva tissue of subjects in various groups （n=20，±s）

*P＜0.05 compared with health group；△P＜0.05 compared with periodontitis group.

BLyS mRNA 1.00±0.00 10.20±1.48*10.70±2.09*Group Health Periodontitis Periodontitis+RA APRIL mRNA 1.00±0.00 5.94±1.52*7.95±1.01*△

2.3 各組研究對象牙齦組織中CD38+ 和CD138+細胞百分率與健康組比較，牙周炎組和牙周炎+RA 組患者牙齦組織中CD38+ 和CD138+細胞百分率升高（P＜0.05）。與牙周炎組比較，牙周炎+RA 組患者牙齦組織中CD38+細胞百分率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），CD138+細胞百分率升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組研究對象牙齦組織中CD38+和CD138+細胞百分率Tab.3 Percentages of CD38+ and CD138+ cells in gingiva tissue of subjects in various groups（n=20，±s，η/%）

表3 各組研究對象牙齦組織中CD38+和CD138+細胞百分率Tab.3 Percentages of CD38+ and CD138+ cells in gingiva tissue of subjects in various groups（n=20，±s，η/%）

*P＜0.05 compared with health group；△P＜0.05 compared with periodontitis group.

Percentage of CD138+ cells 15.70±6.97 33.90±7.51*38.30±5.35*△Group Health Periodontitis Periodontitis+RA Percentage of CD38+ cells 21.80±5.32 53.20±10.10*54.90±7.86*

2.4 各組研究對象牙齦漿細胞中RANKL+細胞百分率和RANKL水平 與健康組比較，牙周炎組和牙周炎+RA 組患者牙齦漿細胞中RANKL+細胞百分率升高（P＜0.05）；與牙周炎組比較，牙周炎+RA 組患者牙齦漿細胞中RANKL+細胞百分率升高（P＜0.05）。與健康組比較，牙周炎組和牙周炎+RA 組患者牙齦漿細胞中RANKL 水平升高（P＜0.05）；與牙周炎組比較，牙周炎+RA組患者牙齦漿細胞中RANKL 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組研究對象牙齦漿細胞中RANKL+細胞百分率和RANKL 水平Tab.4 Percentages of RANKL+cells and RANKL levels in plasma cells of gingiva of subjects in various groups（n=20，±s）

表4 各組研究對象牙齦漿細胞中RANKL+細胞百分率和RANKL 水平Tab.4 Percentages of RANKL+cells and RANKL levels in plasma cells of gingiva of subjects in various groups（n=20，±s）

*P＜0.05 compared with health group；△P＜0.05 compared with periodontitis group.

RANKL level[ρB/(ng·L－1)]27.10±8.01 48.10±14.70*50.90±15.20*Group Health Periodontitis Periodontitis+RA Percentage of RANKL+cells(η/%)8.66±2.33 35.90±5.39*49.10±6.08*△

2.5 各組研究對象TRAP+破骨樣細胞數破骨誘導實驗中，各組培養(yǎng)基均可誘導TRAP+破骨樣細胞生成。正常誘導破骨樣細胞中，與健康組比較，牙周炎組和牙周炎+RA 組培養(yǎng)基誘導生成的正常誘導TRAP+破骨樣細胞數增加（P＜0.05）；與牙周炎組比較，牙周炎+RA 組培養(yǎng)基誘導生成的正常誘導TRAP+破骨樣細胞數增加（P＜0.05）。與正常誘導破骨樣細胞比較，各組anti-RANKL 誘導的TRAP+破骨樣細胞數均減少（P＜0.05）。見表5。

表5 不同培養(yǎng)基誘導的各組破骨樣細胞數Tab.5 Numbers of osteoclasto-like cells in various groups after induced with different kinds of medium （n=20，±s）

表5 不同培養(yǎng)基誘導的各組破骨樣細胞數Tab.5 Numbers of osteoclasto-like cells in various groups after induced with different kinds of medium （n=20，±s）

*P＜0.05 compared with health group；△P＜0.05 compared with periodontitis group；#P＜0.05 compared with normal induction.

Group Number of osteoclasto-like cells Normal induction 1.6±1.1 4.8±2.8*7.6±3.1*△Anti-RANKL induction 0.6±0.2#0.6±0.4#0.8±0.5#Health Periodontitis Periodontitis+RA

2.6 各組研究對象牙齦漿細胞中RANKL、RANK和TRAF6 mRNA 表達水平與健康組比較，牙周炎組和牙周炎+RA 組患者牙齦漿細胞中RANKL、RANK 和TRAF6 mRNA 表達水平均升高（P＜0.05）；與牙周炎組比較，牙周炎+RA 組患者牙齦漿細胞中RANKL、RANK 和TRAF6 mRNA 表達水平均升高（P＜0.05）。見表6。

表6 各組研究對象牙齦漿細胞中RANKL、RANK 和TRAF6 mRNA 表達水平Tab.6 Expression levels of RANKL,RANK,and TRAF6 mRNA in plasma cells in gingiva of subjects in various groups（n=20，±s）

表6 各組研究對象牙齦漿細胞中RANKL、RANK 和TRAF6 mRNA 表達水平Tab.6 Expression levels of RANKL,RANK,and TRAF6 mRNA in plasma cells in gingiva of subjects in various groups（n=20，±s）

*P＜0.05 compared with health group；△ P＜0.05 compared with periodontitis group.

Group Health Periodontitis Periodontitis+RA RANKL mRNA 1.00±1.00 2.96±0.96*RANK mRNA 1.00±1.00 2.74±0.87*TRAF6 mRNA 1.00±1.00 2.07±0.45*4.41±0.99*△4.89±1.88*△3.18±1.29*△

3 討 論

牙周炎和RA 累及部位不同，但二者在發(fā)病機制和骨破壞形式上存在較多共同點。研究［16］表明：牙周炎與RA 間可能存在著交互作用，相較于單純牙周炎患者，RA 患者不僅罹患牙周炎的概率更高，其牙齦組織炎癥和牙槽骨吸收等臨床指標進展也更為迅速。提示RA 對牙周炎存在潛在的促進作用。本研究結果表明：RA 增加牙周炎患者的CAL和PD，提示RA 進一步加劇了牙周炎導致的牙槽骨吸收。

B 淋巴細胞在牙周炎和RA 的病理進程中發(fā)揮了重要的作用。研究［17］表明：B 淋巴細胞浸潤與牙槽骨及關節(jié)骨的侵蝕性破壞呈顯著正相關關系。作為B 淋巴細胞最主要的功能性亞群，漿細胞不僅可表達特異抗體參與體液免疫，也同時分泌多種細胞因子參與多項炎癥反應的調節(jié)。本研究結果顯示：牙周炎組患者CD38+和CD138+細胞百分率均明顯高于健康組研究對象。與牙周炎組比較，牙周炎+RA 組患者牙齦漿細胞中CD138+細胞百分率升高，提示RA 可進一步促進牙周組織內的漿細胞成熟。RA 患者局部自免疫反應導致Th 細胞大量活化，Th 細胞可經循環(huán)系統(tǒng)流至牙周組織，誘導牙齦漿細胞的分化和成熟［18］。同時，在RA 病灶區(qū)活化的漿細胞也可入血，并在趨化因子的作用下進入牙周組織參與炎癥反應。這種雙重效應導致了牙周炎伴RA 患者牙周局部成熟漿細胞較單純牙周炎患者數量更多且效能更強。除抗體分泌外，B 淋巴細胞也是牙周炎病灶內RANKL 的主要來源。在RA 病灶內，B 淋巴細胞也被證實可提供大量的RANKL 并主要誘導破骨細胞的分化［19］。本研究結果顯示：與健康組比較，牙周炎組和牙周炎+RA 組患者牙齦漿細胞中RANKL mRNA 表達水平升高；與牙周炎組比較，牙周炎+RA 組患者牙齦漿細胞中RANKL mRNA 表達水平更高，這可能與漿細胞的成熟度密切相關。CD138+與RANKL 呈正相關關系，升高成骨細胞CD138+表達水平，其RANKL 水平也隨之上升，反之亦然［20］。這種分子間的交互作用可能是CD138+在成熟漿細胞中RANKL 表達上調的機制之一。作為破骨細胞分化中最重要的調控信號，RANKL/RANK 通路參與了牙槽骨的破壞調節(jié)［21］。該效應在牙周炎和牙周炎伴RA 患者中均有體現［22］。在本研究中，牙周炎和牙周炎+RA 組患者牙齦漿細胞均通過表達RANKL 促進了破骨樣細胞的分化，這與先前的研究結果一致［23］。與牙周炎組比較，牙周炎+RA 組患者牙齦漿細胞經RANKL/RANK 通路調控，破骨樣細胞分化的能力更強，可能是牙周炎伴RA 患者臨床上牙槽骨吸收更嚴重的內在因素之一。

除細胞作用外，局部組織中APRIL 和BLyS mRNA 表達水平升高也是RA 伴牙周炎患者牙齦漿細胞表型變化的誘導因素。本研究結果顯示：CD138+細胞百分率升高，且牙齦組織中APRIL和BLyS mRNA 表達水平升高。APRIL 是B 淋巴細胞分化成熟過程中的重要因子［24］。牙周致病菌可通過Toll 樣受體信號刺激牙齦上皮促使其分泌APRIL［25］。本研究結果顯示：APRIL 多出現于上皮下方的炎癥區(qū)域，其分布與漿細胞廣泛重疊。該區(qū)域也是BLyS 的主要分布區(qū)，提示APRIL 和BLyS 可在牙周炎病程中富集于炎癥區(qū)域，誘導漿細胞的分化與成熟。此外，APRIL 和BLyS mRNA表達水平與RANKL+細胞百分率呈正相關關系。研究［26］顯示：牙齦組織漿細胞和RANKL+細胞百分率降低，牙槽骨吸收也有所緩解。本研究結果顯示：RA 使牙周炎患者牙齦組織中APRIL mRNA表達水平升高。APRIL 是活動期RA 的特異性標記物之一。在RA 患者的血清中，APRIL 水平較高，APRIL+單核細胞水平也升高［27］。當RA 患者罹患牙周炎時，血清中的APRIL 遷移至牙齦組織，進一步誘導牙齦漿細胞的發(fā)育成熟，并分泌RANKL等骨免疫因子，介導骨破壞。

綜上所述，牙周炎伴RA 患者牙齦組織漿細胞的成熟度和表達RANKL 的能力更強，可能是加劇牙周炎伴RA 患者牙槽骨吸收的因素之一。上述效應與牙周炎伴RA 患者牙齦組織中促B 淋巴細胞生長因子APRIL 和BLyS 表達水平升高有關。