張玲娣, 趙 亮, 由 涌, 許 倩, 楊振軍

（1.承德醫(yī)學院人體解剖教研室，河北 承德 067000；2.承德醫(yī)學院藥理學教研室，河北 承德 067000；3.承德醫(yī)學院免疫學教研室，河北 承德 067000；4.承德醫(yī)學院基礎醫(yī)學研究所，河北 承德 067000）

神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，其能夠進行自我更新，具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞潛能的原始未分化細胞的能力［1-2］。NSCs 不僅可以通過分化為神經(jīng)元進行神經(jīng)替代，還具有增加內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子釋放、促進血管生成和突觸重建及抑制免疫炎癥等作用［3-7］。因此，NSCs 已經(jīng)成為神經(jīng)科學領域研究的熱點。

研究［8-11］發(fā)現(xiàn)：哺乳動物胚胎時期在大腦皮質(zhì)、嗅球、紋狀體和海馬區(qū)等不同腦區(qū)均存在NSCs。成年哺乳動物腦組織中NSCs 存在于側(cè)腦室的腦室下區(qū)及海馬區(qū)的齒狀回顆粒下層［12-13］。本研究對既往方法［14-16］進行改良，體外分離培養(yǎng)新生SD 大鼠海馬組織中NSCs，鑒定NSCs 純度并觀察培養(yǎng)過程中NSCs 形態(tài)表現(xiàn)和生長規(guī)律變化，為原代海馬組織中NSCs 提取及培養(yǎng)提供參考，并為相關實驗提供可靠細胞來源。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器新生24 h 內(nèi)SD大鼠由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK （京）2019-0008。DMEM/F12 基礎培養(yǎng)基、B-27、L-谷氨酰胺（L-glutamine）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）購自美國Thermo Fisher 公司，青-鏈霉素混合液和細胞增殖與活性檢測試劑盒購自上海索寶生物科技有限公司，Nestin多克隆一抗、AF-488 標記的羊抗兔二抗、流式抗體標記液和抗體封閉液購自北京博奧森生物技術有限公司，EdU-555 細胞增殖檢測試劑盒和DAPI 染色液購自上海碧云天生物技術有限公司。眼科手術器械經(jīng)高壓滅菌烘干后使用；超凈臺（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司），CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本普和希公司），倒置生物顯微鏡、流式細胞儀和激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus 公司），臺式高速冷凍型微量離心機（北京大龍興創(chuàng)實驗儀器股份公司）。

1.2 新生大鼠海馬組織分離和處理取新生24 h內(nèi)SD 新生大鼠，異氟烷氣霧麻醉，75%乙醇浸泡消毒5 min，斷頸取頭部，移入超凈臺。剝離皮膚和顱骨，暴露皮質(zhì)下海馬組織（圖1）。取新生大鼠海馬組織置入預冷PBS 緩沖液中洗凈血液，加入Accutase 1.5～2.0 mL 置于培養(yǎng)箱中，37 ℃、5%CO2混勻消化10 min，輕柔吹打至無肉眼可見組織團塊，1 000 r·5 min－1高速離心，加入培養(yǎng)基重懸細胞，按照（1～10）×105mL－1的密度接種于T25 培養(yǎng)瓶中［16］，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。

1.3 原代海馬組織中NSCs 培養(yǎng)、傳代和形態(tài)表現(xiàn)觀察取海馬組織中NSCs，對培養(yǎng)第2 天獲得的原代細胞進行純化，采用半量換液的方法去除培養(yǎng)基上層漂浮的死細胞和細胞碎片，細胞吹散過200 目細胞篩（孔徑75 μm）進一步去除腦膜組織和血管，純化后細胞按照（1～10）×105mL－1的密度接種于T25 培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱懸浮培養(yǎng)。自培養(yǎng)第2 天開始，每日觀察細胞生長狀態(tài)并采集圖像，每2 天半量更換上層培養(yǎng)基。

原代取材的海馬組織中NSCs 通常2～3 d 傳代1 次，傳代時主要采用機械吹打法結(jié)合酶消化法進行。海馬組織中NSCs 以神經(jīng)球的形式懸浮生長，隨著培養(yǎng)時間延長，神經(jīng)球體積逐漸增大，當觀察到神經(jīng)球的中心部分折光性變差時，即可進行傳代。第1 和2 代神經(jīng)球結(jié)構松散，離心后直接用200 μL 槍頭輕柔吹打，即可將神經(jīng)球吹散成單細胞懸液狀態(tài)；至第3 代以后細胞之間黏附緊密，神經(jīng)球的結(jié)構致密，需離心后加入細胞消化液消化，再用200 μL槍頭輕柔吹散成單細胞懸液，1 000 r·5 min－1高速離心去除細胞消化液，加入培養(yǎng)基重懸細胞，按照（1～10）×105mL－1的密度接種于T25 培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱懸浮培養(yǎng)。

1.4 流式細胞術檢測原代海馬組織中NSCs純度

細胞培養(yǎng)至第8 天時倒置顯微鏡下觀察可見，視野內(nèi)雜質(zhì)和死細胞數(shù)明顯減少。以取材當天海馬組織提取細胞，即原代海馬組織NSCs 第0 天作為對照組，對培養(yǎng)第8 天NSCs 進行純度鑒定，繪制流式單參數(shù)直方圖。分別取培養(yǎng)第0 天和培養(yǎng)第8 天NSCs，吹散神經(jīng)球制成單細胞懸液，4%多聚甲醛固定，0.3%Triton 透膜，3%BSA 封閉，1∶100 Nestin 一抗孵育，AF-488 標記二抗，以每管8×105mL－1的密度轉(zhuǎn)移至流式管中，檢測NSCs 純度，實驗重復3 次。

1.5 免疫熒光法檢測NSCs 中Nestin 和EdU 蛋白表達分別取培養(yǎng)第2 和8 天的細胞，置于層黏連蛋白處理過的24 孔細胞培養(yǎng)板中，加入1∶500 的含EdU 的培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)48 h，采用EdU 標記細胞并使細胞貼壁。4% 多聚甲醛固定，0.3% Triton 透膜，3%BSA 封閉。1∶400 Nestin 一抗4 ℃孵育過夜，AF-488 標記二抗，100 μL DAPI 標記細胞核。激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.6 細胞計數(shù)法檢測NSCs 增殖活性取培養(yǎng)第2 天過濾后細胞制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1.5×105mL－1，接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，每孔200 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)第2、5、8、11、14 和17 天采用細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)，每次取5 個復孔，共6 次。依據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果繪制細胞生長曲線。

1.7 CCK-8 法檢測NSCs 增殖活性取培養(yǎng)第2 天過濾后細胞制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1.5×105mL－1，接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，每孔200 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)第2、5、8、11、14 和17 天檢測，共計6 次。加入20 μL CCK-8 溶液，每次測量5 個復孔，培養(yǎng)箱孵育6 h，采用酶標儀于波長450 nm 處檢測各孔吸光度（A）值，繪制細胞增殖活性曲線。

1.8 統(tǒng)計學分析采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各時間點細胞計數(shù)值和A 值均符合正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 培養(yǎng)不同時間海馬組織中NSCs 形態(tài)表現(xiàn)

培養(yǎng)第0 天，海馬組織中NSCs 以單細胞形式懸浮于培養(yǎng)基中。培養(yǎng)第2 天，海馬組織中NSCs開始聚集為大小不等和形態(tài)不規(guī)則的細胞團塊，懸浮生長。此后以細胞團塊為中心開始增殖，形成懸浮生長的神經(jīng)細胞球，隨時間的延長神經(jīng)球體積逐漸增大。培養(yǎng)第8 天，可見神經(jīng)球大小不一，呈圓形或橢圓形桑葚狀，邊界清晰，折光度高，無明顯突起，神經(jīng)球中心部位細胞密集，折光性差，顏色暗黑。見圖2。

圖2 培養(yǎng)不同時間海馬組織中NSCs 形態(tài)表現(xiàn)Fig.2 Morphology of NSCs in hippocampus tissue after cultured for different time

2.2 海馬組織中NSCs 的純度鑒定原代培養(yǎng)第0 天，海馬組織中NSCs 純度為5.78%。原代培養(yǎng)第8 天，海馬組織中NSCs 純度可達76.50%～85.40%，可滿足實驗需要。見圖3。

圖3 流式細胞術檢測不同培養(yǎng)時間海馬組織中NSCs 純度Fig.3 Purities of NSCs in hippocampus tissue after cultured for different time detected by flow cytometry

激光共聚焦顯微鏡下可見，NSCS 中特異性標記蛋白Nestin 在細胞質(zhì)中呈陽性表達（綠色），細胞增殖標記物EdU 在細胞核中呈陽性表達（紅色），DAPI 標記細胞核為藍色。培養(yǎng)第2 天海馬組織中NSCs 聚集為大小不等和形態(tài)不規(guī)則的細胞團塊，培養(yǎng)第8 天時海馬組織中NSCs 聚集為個體較大的神經(jīng)球。視野內(nèi)可見神經(jīng)球為Nestin 與EdU共染細胞構成，提示本研究提取的細胞為具有分裂和增殖能力的NSCs，神經(jīng)球由具有增殖能力的NSCs 聚集而成。見圖4。

圖4 免疫熒光法檢測培養(yǎng)不同時間海馬組織中Nestin 和EdU 表達情況Fig.4 Expressions of Nestin and EdU in hippocampus tissue after cultured for different time detected by immunofluorescence

2.3 原代海馬組織中NSCs 增殖活性細胞增殖標記物EdU 在細胞核呈陽性表達（紅色），與培養(yǎng)第2 天比較，培養(yǎng)第8 天時海馬組織中NSCs 中EdU 表達明顯增加，NSCs 增殖活性明顯增強。見圖4。結(jié)合細胞計數(shù)法繪制的細胞生長曲線和CCK-8 法繪制的細胞增殖活性曲線分析，培養(yǎng)5～11 d，NSCs 處于對數(shù)生長期，增殖速度快，細胞增殖活性較高，從培養(yǎng)第14 天開始，NSCs 增殖進入平臺期，增殖速度減緩。見圖5。

圖5 各組大鼠海馬組織中NSCs 生長曲線(A)和細胞增殖活性曲線(B)Fig.5 Growth curve(A) and proliferation activity curve(B) of NSCs in hippocampus tissue of rats in various groups

3 討 論

NSCs 具有增殖和分化能力，可以分化為神經(jīng)元，參與神經(jīng)修復，且其免疫原性極低，是理想的細胞治療材料［17］。與永生化細胞系比較，原代培養(yǎng)NSCs 直接取自活體組織，離體時間短且體外培養(yǎng)代次少，能更好地反映細胞在體內(nèi)的生長狀態(tài)。因此，采用原代培養(yǎng)NSCs 可以更好地建立細胞疾病模型，高效率穩(wěn)定地獲得NSCs，并進行體外培養(yǎng)和擴增。

研究［18］采用孕14.5 d 胎鼠大腦半球作為取材部位提取NSCs，取材過程繁瑣且時間較長，細胞死亡率較高。本研究以新生大鼠海馬組織作為取材對象，取材部位更接近成年大鼠NSCs 存在部位，細胞相似度高；肉眼直視下即可完整分離海馬組織，取材難度低，減少了污染風險；取材速度快，可以減少缺血所導致的腦細胞損傷。與大腦半球比較，海馬組織結(jié)構完整易于分離，腦膜和血管組織相對較少，取材過程中無需剝離腦膜組織，培養(yǎng)第2 天經(jīng)細胞篩過濾即可完全去除腦膜和血管組織，減少了由于機械分離和操作時間過長導致的細胞損傷［19］。

原代取材的細胞中有腦膜組織、血管組織、神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞和死亡細胞混入，因此取材后需進一步純化，以獲得高純度高一致性的NSCs。本研究采用3 步法進行細胞純化。取材后采用細胞篩過濾去除腦膜和血管組織。神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞貼壁生長，死亡細胞及細胞崩解產(chǎn)物漂浮于培養(yǎng)基上層，NSCs 以神經(jīng)球形態(tài)懸浮生長。根據(jù)上述特性，在培養(yǎng)過程中通過丟棄貼壁細胞以去除神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞；通過半量換液去除上層培養(yǎng)基中漂浮的死亡細胞及細胞崩解產(chǎn)物；根據(jù)NSCs 聚集成的神經(jīng)球體積偏大且低速離心即可使神經(jīng)球沉積的特點，在傳代過程中通過低速離心換液，進一步去除漂浮于培養(yǎng)基中的雜質(zhì)，從而達到NSCs 純化。本研究結(jié)果顯示：NSCs 純度可達76.50%～85.40%，能夠滿足實驗需要。

Nestin 蛋白是NSCs 最具代表性的標志物［20］，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期階段的神經(jīng)上皮干細胞中表達，隨著神經(jīng)細胞的遷移，Nestin 蛋白表達水平降低，當神經(jīng)細胞完成分化時，Nestin 蛋白停止表達，因此被廣泛地應用于鑒定NSCs。EdU 是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖過程中代替胸腺嘧啶摻入正在復制的DNA 分子中，可以快速和準確地反映細胞增殖能力［21］。本研究采用Nestin和EdU 對NSCs 進行免疫共標記染色，結(jié)果顯示：海馬組織提取的細胞為具有增殖能力的NSCs。且隨著培養(yǎng)時間的延長，NSCs 分裂和增殖增多，NSCs 形成的神經(jīng)球體積逐漸增大，Nestin 與EdU共染陽性細胞數(shù)逐漸增多，神經(jīng)球外周光滑，無明顯突起，表明在一定的體外培養(yǎng)時間內(nèi)，NSCs 能很好地保持干性潛能。

來源于新生SD 大鼠海馬組織的NSCs 在體外培養(yǎng)過程中不能長期保持高度增殖能力和增殖活性，隨培養(yǎng)時間的延長和培養(yǎng)代次的增加，細胞活性和增殖能力明顯降低。本研究結(jié)果顯示：培養(yǎng)0～3 d，NSCs 增殖活性較低，生長較緩慢，神經(jīng)球形成速度較慢；培養(yǎng)5～11 d 時NSCs 處于對數(shù)生長期，細胞狀態(tài)最好，可以保持較高的細胞增殖活性和增殖能力，神經(jīng)球形成速度較快；培養(yǎng)第14 天開始，細胞生長進入平臺期，細胞增殖活性和增殖能力開始降低。因此，相關實驗盡量選用培養(yǎng)5～11 d 的NSCs。

綜上所述，本研究探討了NSCs 原代培養(yǎng)的提取和純化方法，對NSCs 進行純度鑒定，觀察培養(yǎng)過程中NSCs 增殖活性變化，為相關研究提供參考。