苗 卉, 苗聰秀, 李 娜, 韓 晶

（長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院生殖遺傳科 長治醫(yī)學(xué)院生殖與遺傳研究所 長治醫(yī)學(xué)院生殖與遺傳重點實驗室 山西省衛(wèi)健委生殖工程重點實驗室，山西 長治046000）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMT）是指子宮腔外存在子宮內(nèi)膜組織（包括腺體和間質(zhì)）的活躍生長［1］。EMT 在育齡女性中的患病率約為10%，但在慢病盆腔痛患者中，其患病率高達(dá)70%。異位子宮內(nèi)膜（ectopic endometrium，EC）的周期性出血導(dǎo)致受累區(qū)域內(nèi)的炎性滲透，并與周圍組織或器官產(chǎn)生粘連，并引發(fā)產(chǎn)生進(jìn)行性加重的繼發(fā)性痛經(jīng)、慢病盆腔痛和不孕癥等一系列臨床癥狀［2］。與惡性腫瘤相似，EMT 可廣泛侵襲性生長［1］。目前，腹腔鏡是診斷EMT 的金標(biāo)準(zhǔn)［3］。但由于腹腔鏡的侵入性，且EMT 缺乏敏感性和特異性的生物學(xué)標(biāo)志物，使EMT 患者從癥狀出現(xiàn)到明確診斷的平均時間長達(dá)6～7 年［4］。延遲診斷不僅促進(jìn)EMT 的進(jìn)展，而且影響患者的治療，且EMT具有高復(fù)發(fā)率和低治愈率等臨床特點［5］。因此，需要進(jìn)一步深入研究EMT 的發(fā)病機(jī)制和病理機(jī)制，以探索有效的臨床治療方法。

近年來，長鏈非編碼RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）已被證實在EMT 等的多種疾病中發(fā)揮重要作用［6］，多種lncRNAs 參與了EMT 的發(fā)生發(fā)展［7］。在EMT 患者EC 組織中表達(dá)減少的lncRNA LINC01541 可通過調(diào)控miR-506-5p 下調(diào)Wnt/β-catenin 通路的活化水平，抑制EC 組織中基質(zhì)細(xì)胞（endometrial stromal cells，ESCs）的增殖、遷移和侵襲［8］。EMT 患者異常升高lncRNA MALAT1 可通過抑制miR-206 的表達(dá)上調(diào)EC 組織中ESCs 的增殖能力，減少細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮促進(jìn)疾病進(jìn)展的作用［9］。但lncRNA HAND2-AS1在EMT 中的作用尚不清楚。研究［10-11］顯示：在EMT 患者EC 組織中過度表達(dá)的miR-21 是參與EMT 發(fā)病細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要調(diào)節(jié)因子，且子宮內(nèi)膜癌中miR-21 的過表達(dá)也與腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力有關(guān)聯(lián)。本課題組前期通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)lncRNA HAND2-AS1 與miR-21 間存在潛在結(jié)合位點，提示HAND2-AS1 可能通過調(diào)節(jié)miR-21 參與EMT 的發(fā)生發(fā)展。本研究探討HAND2-AS1 和miR-21 基因在EMT 中的異常表達(dá)及其作用，旨在進(jìn)一步闡明EMT 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2020 年5 月—2021 年7 月在本院婦科接受手術(shù)治療的EMT 患者30 例作為EMT 組，另選取同時期在本院生殖科就診的輸卵管阻塞育齡女性30 例作為對照組。EMT 的診斷經(jīng)臨床癥狀、腹腔鏡和組織病理學(xué)證實。納入標(biāo)準(zhǔn)：①處于月經(jīng)周期增生期晚期的EMT 患者（即月經(jīng)周期的第11～13 天）；②術(shù)前3 個月內(nèi)未接受激素治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)嚴(yán)重肝、心、肺、腎、內(nèi)分泌或免疫等系統(tǒng)疾病者；②孕婦或哺乳期女性；③并發(fā)自身免疫性疾病或任何系統(tǒng)的惡性腫瘤者；④并發(fā)其他除EMT 以外的婦科疾病者。本研究經(jīng)本院倫理委員會審批，并取得所有研究對象的書面知情同意書。收集2 組研究對象的年齡、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）和卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、催乳素（prolactin，PRL）及雌二醇（estradiol，E2）水平。術(shù)中收集對照組研究對象的新鮮子宮內(nèi)膜組織和EMT 患者的EC 組織，迅速置于液氮中，并于30 min 內(nèi)運(yùn)回實驗室進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2 細(xì)胞、主要試劑和儀器293T 細(xì)胞購自美國ATCC 細(xì)胞庫。DMEM/F12 培養(yǎng)基和1%青-鏈霉素混合液（美國Hyclone 公司），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和Ⅳ型膠原酶（美國Gibco 公司），pcDNA 空質(zhì)粒和HAND2-AS1 過表達(dá)、miR-21 mimic 和陰性對照（mimic negative control，mimic-NC）質(zhì)粒及含有HAND2-AS1 的3′非翻譯區(qū)的靶位序列的野生型（HAND2-AS1-WT）和定點突變（HAND2-AS1-MUT）質(zhì)粒（北京義翹神州科技股份有限公司），雙熒光素酶報告載體（上海歐陸生物科技有限公司），TRIzol 試劑和Lipofetamin?2000 轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen 公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix（日本Toyobo 公司），實時熒光定量PCR （realtime fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒RealStar Green（北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司），雙熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)（美國Promega 公司），CCK-8 試劑（美國Sigma 公司），Transwell 小室（美國Corning Costar 公司），Matrigel 基質(zhì)膠（美國BD 公司），RT-qPCR 引物［生工生物工程（上海）股份有限公司）］。NanoDrop 2000 分光光度計（美國Thermo 公司），CFX96 TouchTMRT-qPCR 儀（美國BioRad 公司），NYW-96M 微板儀（德國BMG LABTECH 公司）。

1.3 細(xì)胞分離、培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組按照參考文獻(xiàn)［12］方法從2 組研究對象（n=10）子宮內(nèi)膜組織中分離ESCs。首先，采用PBS 緩沖液充分洗滌組織以去除血污，無菌眼科剪將組織剪成約1 mm×1 mm×1 mm 小塊，采用含0.1% Ⅳ型膠原酶和0.25% 胰酶的無血清DMEM/F12 培養(yǎng)基于37 ℃水浴鍋中震蕩消化2 h，300 g 離心5 min，取上清液，依次經(jīng)100 μm 和38.5 μm 的濾網(wǎng)過濾，取過濾液，再次300 g 離心5 min，取底層細(xì)胞沉淀，采用含10%FBS 和1%青-鏈霉素的DMEM/F12 培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d 更換1 次培養(yǎng)基，光鏡下觀察到ESCs 呈長梭形纖維狀細(xì)胞形態(tài)，取傳至3 代以后的ESCs 進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實驗。將對照組ESCs 按每孔1×105個細(xì)胞的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長融合至80%時，按轉(zhuǎn)染試劑Lipofetamin?2000 使用說明書方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并將細(xì)胞分為pcDNA 組（轉(zhuǎn)染pcDNA 空質(zhì)粒）、HAND2-AS1 組（轉(zhuǎn)染HAND2-AS1 過表達(dá)質(zhì)粒）、mimic NC 組（轉(zhuǎn)染mimic NC）、miR-21 mimic 組 （轉(zhuǎn)染miR-21 mimic）、pcDNA+mimic NC 組（聯(lián)合轉(zhuǎn)染pcDNA空質(zhì)粒和mimic NC）、HAND2-AS1+mimic NC 組（聯(lián)合轉(zhuǎn)染HAND2-AS1 過表達(dá)質(zhì)粒和mimic NC）、pcDNA+miR-21 mimic 組（聯(lián)合轉(zhuǎn)染pcDNA 空質(zhì)粒和 miR-21 mimic）和 HAND2-AS1+miR-21 mimic 組（聯(lián)合轉(zhuǎn)染HAND2-AS1 過表達(dá)質(zhì)粒和miR-21 mimic），另設(shè)未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對照組。收集轉(zhuǎn)染48 h 后的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4 RT-qPCR 法檢測2 組研究對象子宮內(nèi)膜組織和ESCs 中HAND2-AS1 mRNA 和miR-21 表達(dá)水平采用TRIzol 法提取子宮內(nèi)膜組織或ESCs 中總RNA。采用分光光度計測定提取的RNA 水平，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix 說明書操作逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以獲得的基因為模板，采用2×RealStar Green 混合試劑盒進(jìn)行RT-qPCR 實驗。RT-qPCR 引物序列：HAND2-AS1 上游，5′-GGAGTCACAGGCAGTCGTAGA-3′，HAND2-AS1 下游，5′-GAAGGCACAGATCATTCATGG-3′；miR-21 上游，5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG-3′，miR-21下游，5′-CAATTCAGTTGAGGATTATGA-3′；U6 上游，5′-TCTGCCACCCGAGTGTAACCA-3′，U6 下游，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算HAND2-AS1 mRNA和miR-21 表達(dá)水平。

1.5 熒光素酶基因報告實驗檢測HAND2-AS1 和miR-21 的靶向關(guān)系采用生物信息學(xué)軟件（Starbase：http：//starbase.sysu.）預(yù)測miR-21 與HAND2-AS1 之間的潛在結(jié)合位點。將合成的HAND2-AS1-WT 和HAND2-AS1-MUT 克隆至熒光素酶報告載體中。取生長狀態(tài)良好的293T 細(xì)胞，以每孔1×104個細(xì)胞的密度接種至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并將HAND2-AS1-WT、HAND2-AS1-MUT和miR-21 mimic 或mimic-NC 在Lipofetamin?2000作用下進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h 后，收集裂解后的細(xì)胞，在雙熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)中采用熒光素酶分析試劑盒檢測樣品的熒光素酶活性。熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.6 CCK-8 法檢測各組ESCs 增殖活性取各組ESCs，以每孔6×103個細(xì)胞的密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)6 個復(fù)孔。于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 和72 h 后，向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育2 h 后，采用微板儀測定每孔于波長450 nm 處的吸光度（A）值，以A 值代表細(xì)胞增殖活性。

1.7 Transwell 小室實驗檢測各組ESCs 的遷移和侵襲能力取各組ESCs，常規(guī)消化后，1 000 g 離心15 min，重懸于無血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基中，稀釋至2×105mL－1。分別取約200 μL 細(xì)胞懸浮液接種至Transwell 上室，侵襲實驗需在上室預(yù)先包被Matrigel 基質(zhì)膠。將700 μL 含10%FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基加入下室。置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出上室，棄細(xì)胞懸浮液，無菌PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞，使用棉簽輕輕地清除未穿出細(xì)胞。室溫下采用4%多聚甲醛溶液固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5 個視野計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，并以遷移實驗和侵襲實驗中穿膜細(xì)胞數(shù)（即遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)）代表各組ESCs 的遷移和侵襲能力。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。2 組研究對象年齡，BMI、血清中FSH、LH、PRL 和E2 水平及2 組研究對象子宮內(nèi)膜組織和各組ESCs 中HAND2-AS1 mRNA 及miR-21 表達(dá)水平，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)及熒光素酶活性均符合正態(tài)分布，以xˉ±s表示，2 組間樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson’s 相關(guān)系數(shù)分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2 組研究對象一般資料2 組研究對象年齡、BMI 和血清中FSH、LH 及PRL 水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與對照組比較，EMT 組患者血清中E2 水平升高（P＜0.05）。見表1。

表1 2 組研究對象一般資料Tab.1 General informations of subjects in two groups(n=30，±s）

表1 2 組研究對象一般資料Tab.1 General informations of subjects in two groups(n=30，±s）

Group Control EMT P Age(year)31.09±0.80 31.39±1.04 0.82 BMI(kg·m－2)23.70±0.70 22.67±0.86 0.39 FSH[λB/(IU·L－1)]5.98±0.31 7.74±0.85 0.13 LH[λB/(IU·L－1)]5.45±0.77 5.29±0.69 0.89 PRL[ρB/(μg·L－1)]16.55±3.61 21.66±3.39 0.33 E2[ρB/(ng·L－1)]35.21±3.53 51.59±5.08 0.03

2.2 2 組研究對象子宮內(nèi)膜組織和ESCs 中HAND2-AS1 mRNA 及miR-21 表達(dá)水平及其相關(guān)性RT-qPCR 檢測結(jié)果顯示：與對照組（1.00±0.00 和1.00±0.00）比較，EMT 組患者EC 組織中HAND2-AS1 mRNA 表達(dá)水平（0.42±0.11）降低（P＜0.05），miR-21 表達(dá)水平（4.58±0.35）升高（P＜0.05）。與對照組（1.00±0.00 和1.00±0.00）比較，EMT 組ESCs 中HAND2-AS1 mRNA 表達(dá)水平（0.36±0.09）降低（P＜0.05），miR-21 表達(dá)水平（6.69±0.81）明顯升高（P＜0.01）。Pearson 相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果顯示：在對照組中，HAND2-AS1 與miR-21 表達(dá)水平無明顯相關(guān)性（r=0.34，P＞0.05），在EMT 組中，HAND2-AS1 與miR-21 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=－0.57，P＜0.05）。

2.3 各組ESCs 中HAND2-AS1 mRNA 和miR-21表達(dá)水平與空白對照組比較，pcDNA 組ESCs 中HAND2-AS1 mRNA 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），HAND2-AS1 組ESCs 中HAND2-AS1 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與空白對照組比較，mimic NC 組ESCs 中miR-21 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），miR-21 mimic 組ESCs 中miR-21 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與空白對照組比較，HAND2-AS1+mimic NC 組ESCs 中 miR-21 表達(dá)水平降低 （P＜0.05），pcDNA+miR-21 mimic 組ESCs 中miR-21 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），pcDNA+mimic NC 組和HAND2-AS1+miR-21 mimic 組ESCs 中miR-21 表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與pcDNA+ miR-21 mimic 組比較，HAND2-AS1+miR-21 mimic 組ESCs 中miR-21 表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 RT-qPCR 法檢測各組ESCs 中HAND2-AS1 mRNA 和miR-21 表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of HAND2-AS1 mRNA and miR-21 in ESCs in various groups detected by RT-qPCR method

2.4 各組細(xì)胞中HAND2-AS1 與miR-21 的靶向關(guān)系采用生物信息學(xué)軟件（Starbase：http：//starbase.sysu.edu.cn/）預(yù)測 HAND2-AS1 和miR-21 之間的潛在關(guān)系，HAND2-AS1 與miR-21間存在靶向結(jié)合位點。雙熒光素酶基因報告實驗結(jié)果表明：與mimic NC 組比較，miR-21 mimic 組HAND2-AS1-WT 的相對熒光素酶活性明顯降低（P＜0.01），HAND2-AS1-MUT 的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 HAND2-AS1 miR-21 的靶向關(guān)系Fig.2 Targeting relationship between HAND2-AS1 and miR-21

2.5 各組ESCs 增殖活性與空白對照組比較，HAND2-AS1+mimic NC 組ESCs 增殖活性降低（P＜0.05），pcDNA+miR-21 mimic 組ESCs 增殖活性升高（P＜0.05），pcDNA+mimic NC 組和HAND2-AS1+miR-21 mimic 組ESCs 增殖活性差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與pcDNA+miR-21 mimic 組比較，HAND2-AS1+miR-21 mimic 組ESCs 增殖活性降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 CCK-8 法檢測各組ESCs 增殖活性Fig.3 Proliferation activities of ESCs in various groups detected by CCK-8 method

2.6 各組ESCs 的遷移和侵襲數(shù)與空白對照組比較，HAND2-AS1+mimic NC 組ESCs 的遷移和侵襲數(shù)均明顯降低（P＜0.01），pcDNA+miR-21 mimic 組ESCs 的遷移和侵襲數(shù)均升高（P＜0.05），pcDNA+mimic NC 組和 HAND2-AS1+miR-21 mimic 組ESCs 的遷移和侵襲數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與pcDNA+ miR-21 mimic 組比較，HAND2-AS1+miR-21 mimic 組ESCs 的遷移和侵襲數(shù)均降低（P＜0.05）。見圖4～7。

圖4 Transwell 小室實驗檢測各組ESCs 的遷移情況（結(jié)晶紫，×200）Fig.4 Migration of ESCs in various groups detected by Transwell chamber assay(Crystal violet, ×200)

圖5 Transwell 小室實驗檢測各組ESCs 的侵襲情況（結(jié)晶紫，×200）Fig.5 Invasion of ESCs in various groups detected by Transwell chamber assay(Crystal violet, ×200)

圖6 各組ESCs 的遷移數(shù)Fig.6 Number of migration ESCs in various groups

圖7 各組ESCs 的侵襲數(shù)Fig.7 Number of invasion ESCs in various groups

3 討 論

盡管EMT 被歸類為良性疾病，但其也表現(xiàn)出惡性腫瘤的常見特征，如無限生長、周圍組織侵襲和破壞，以及局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和易復(fù)發(fā)性等［13-14］。此外，EC 組織中ESCs 的遷移和侵襲特征與惡性腫瘤細(xì)胞幾乎相同［15］。然而，ESCs 增殖、遷移和侵襲特性的分子機(jī)制尚未完全闡明。目前臨床尚無針對EMT 的早期診斷工具或根治性治療方法。而造成這一現(xiàn)象的原因是EMT 發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性和癥狀的多樣性［16］。因此，確定EMT 的新治療靶點和生物學(xué)標(biāo)志物具有重要意義。

lncRNAs 和miRNAs 參與多種生物學(xué)過程，如細(xì)胞增殖、分化、染色體重塑、表觀遺傳調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄修飾和轉(zhuǎn)錄后修飾等［17］。此外，miR-21 已被確定為多種腫瘤的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［18］。既往研究［10］證實miR-21 在EMT 中呈異常高表達(dá)現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示：miR-21 在EMT 組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，HAND2-AS1 和miR-21 具有靶向性關(guān)系。

研究［16］顯示：lncRNAs 可能在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制miRNA 的表達(dá)，從而參與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等多種生物學(xué)行為。本研究結(jié)果顯示：HAND2-AS1 為miR-21 的上游靶點，在EMT 患者EC 組織和ESCs 中HAND2-AS1 表達(dá)明顯下調(diào)，且在EMT 患者EC 組織中HAND2-AS1 與miR-21的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。體外實驗進(jìn)一步證實：HAND2-AS1 通過調(diào)節(jié)miR-21 抑制ESCs 的增殖、遷移和侵襲。HAND2-AS1 作為一種腫瘤抑制因子，已被證實在子宮內(nèi)膜樣癌、宮頸癌和骨肉瘤等多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，且能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為［19-21］。如在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)下調(diào)的HAND2-AS1 與患者的腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，且過表達(dá)HAND2-AS1 可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲［19］。在宮頸癌中，HAND2-AS1 表達(dá)下調(diào)同樣與患者的不良預(yù)后有關(guān)，HAND2-AS1 可通過與miR-21 競爭性結(jié)合以上調(diào)組織金屬蛋白酶抑制因子3 表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［20］。本研究結(jié)果表明：HAND2-AS1能通過調(diào)控miR-21 的表達(dá)抑制ESCs 的增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述，在EMT 患者EC 組織和ESCs 中表達(dá)下調(diào)的HAND2-AS1 可通過調(diào)控miR-21 抑制ESCs 的增殖、遷移和侵襲，從而參與EMT 的發(fā)生發(fā)展。提示HAND2-AS1/miR-21 軸可能是EMT診斷和治療的一個潛在有效的生物標(biāo)志物。