楊賀然, 李興江, 胡嘉航, 李彥偉

（1.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 牡丹江 157000；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院解剖教研室，黑龍江 牡丹江 157000；3.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院影像科，黑龍江 牡丹江 157000）

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）是由脂肪組織中分離出的一種具有多種分化潛能的成體干細(xì)胞［1］。誘導(dǎo)ADSCs 向神經(jīng)元分化對(duì)修復(fù)周圍神經(jīng)損傷有重要意義［2］。研究［3］顯示：生長(zhǎng)素釋放肽等小分子在神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化過(guò)程中起重要作用。Ghrelin 是在胃中產(chǎn)生的促生長(zhǎng)激素釋放多肽，具有較強(qiáng)的促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌和釋放作用，可穿越血腦屏障，通過(guò)激活下丘腦促生長(zhǎng)激素分泌啟動(dòng)食欲信號(hào)的傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)［4］。研究［5］顯示：Ghrelin 可促進(jìn)腦室下區(qū)增殖和增加腦嗅球中酪氨酸羥化酶表達(dá)以增加多巴胺神經(jīng)元數(shù)量，還可促進(jìn)腦神經(jīng)干細(xì)胞增殖和增加腦神經(jīng)干細(xì)胞中神經(jīng)球直徑及酪氨酸羥化酶表達(dá)，促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元分化。提示Ghrelin 可在下丘腦以外的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)元過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，高度分化的ADSCs 可在體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)下向脂肪細(xì)胞及神經(jīng)元分化［6］。研究［7］顯示：10－9mol·L－1Ghrelin 作用于ADSCs，可促進(jìn)ADSCs 向脂肪細(xì)胞分化，提示Ghrelin 有促進(jìn)ADSCs 分化作用，但Ghrelin 促進(jìn)ADSCs 向神經(jīng)元分化尚未見(jiàn)報(bào)道。

絲裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是生物體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶，參與介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂和分化等多種生理過(guò)程。MAPK 可激活其亞族-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié) 激 酶 （extracellular signal-regulated kinase，ERK）來(lái)調(diào)控細(xì)胞生存和增殖并介導(dǎo)胞外信號(hào)向胞內(nèi)傳導(dǎo)等［8］。研究［9］顯示：MAPK 及ERK 是啟動(dòng)胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)元、脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞定向分化及成熟的關(guān)鍵調(diào)控因子［9］。研究［10］證實(shí)：Ghrelin 可通過(guò)調(diào)控MAPK 和ERK 通路誘導(dǎo)骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化，提示Ghrelin 有促進(jìn)干細(xì)胞定向分化的作用，這可能與調(diào)控MAPK/ERK 促進(jìn)增殖及分化通路有關(guān)。本研究從MAPK/ERK 通路方面，探討Ghrelin 影響ADSCs 向神經(jīng)元分化的可能機(jī)制，為Ghrelin 在干細(xì)胞組織修復(fù)領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人ADSCs 購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司。MTT 試劑盒（上海歌凡生物科技有限公司），Ghrelin（南京肽業(yè)生物科技有限公司），MAPK 抑制劑U0126（北京百奧萊博科技有限公司），Ghrelin 受體阻斷劑D-賴氨酰3 生長(zhǎng)激素釋放肽6（D-Lys3-growth hormone releasing peptide-6，D-Lys3-GHRP-6）（北京孚博生物科技有限公司），MAPK、磷酸化MAPK（phosphorylated MAPK，p-MAPK）、ERK、磷 酸 化 ERK（phosphorylated ERK，p-ERK）、神經(jīng)元特異性核蛋白（neuronal-specific nuclear protein，NeuN），微管蛋白（tubulin，Tuj-1）、神經(jīng)絲蛋白（neurofilament protein，NF）、生長(zhǎng)激素促分泌受體（growth hormone secretagogue receptor，GHSR）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）抗體（美國(guó)Abcam 公司），NF-200（上海齊康生物科技有限公司），胎肝激酶1（fetal liver kinase 1，F(xiàn)lk1）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司。倒置顯微鏡和熒光顯微鏡均購(gòu)自廣州市明美光電技術(shù)有限公司，電轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)于南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組和處理ADSCs 于37 ℃水浴復(fù)蘇后，置于含10%胎牛血清的DMEM （高糖）培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)開(kāi)始傳代。取第3 代ADSCs 細(xì)胞，以2×106mL－1的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并設(shè)置為空白組、神經(jīng)分化誘導(dǎo)劑組、Ghrelin 組（給予600 μg·L－1Ghrelin）、U0126 組（給予40 ng·L－1U0126）、Ghrelin+U0126 組（給予600 μ g·L－1Ghrelin+40 ng·L－1U0126）和D-Lys3-GHRP-6 （給予10－10g·L－1D-Lys3-GHRP-6）組，每組6 個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M正常培養(yǎng)；神經(jīng)分化誘導(dǎo)劑組參照文獻(xiàn)［11］采用含終濃度為40 μg·L－1堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的DF12 神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)12 d；Ghrelin組和U0126 組參照文獻(xiàn)［10］分別在神經(jīng)分化誘導(dǎo)劑組基礎(chǔ)上向培養(yǎng)基中加入終濃度為600 μg·L－1Ghrelin 和40 ng·L－1U0126 干預(yù)培養(yǎng)；Ghrelin+U0126 組在神經(jīng)分化誘導(dǎo)劑組基礎(chǔ)上向培養(yǎng)基中加入Ghrelin，并加入U(xiǎn)0126 干預(yù)培養(yǎng)；D-Lys3-GHRP-6組在神經(jīng)分化誘導(dǎo)劑組基礎(chǔ)上參照文獻(xiàn)［12］操作向培養(yǎng)基中加入終濃度為10－10g·L－1D-Lys3-GHRP-6培養(yǎng)，各組干預(yù)培養(yǎng)12 d 后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 倒置顯微鏡觀察各組ADSCs 病理形態(tài)表現(xiàn)取處理后的各組ADSCs，采用4%多聚甲醛固定，于倒置顯微鏡下觀察各組ADSCs病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.4 免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞中NF-200 和Tuj-1陽(yáng)性表達(dá)率取處理后的各組細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液清洗，采用4%多聚甲醛固定后，分別加入Tuj-1 和NF-200 一抗（1∶200）孵育過(guò)夜，次日滴加lexa-Flour488 標(biāo)記的羊抗兔IgG 室溫孵育3 h 后，滴加抗熒光淬滅封片液，然后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照，Image-Pro Plus 6.0 軟件檢測(cè)各視野下NF-200 和Tuj-1 陽(yáng)性表達(dá)率。陽(yáng)性表達(dá)率=Flour488 染色細(xì)胞數(shù)/4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI）染色細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中MAPK/ERK 通路蛋白和細(xì)胞分化標(biāo)志蛋白表達(dá)水平取處理后的各組細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，加入細(xì)胞裂解液勻漿后，取勻漿液提取蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，取50 μg 蛋白，加入2 倍體積的電泳加樣緩沖液，采用電轉(zhuǎn)膜儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，5%脫脂奶粉封閉及洗膜后，分別滴加1∶2 000 一抗（MAPK、p-MAPK、ERK、p-ERK、NSE、NeuN、Tuj-1、NF、GHSR、Flk1和CD29）抗體及1∶1 500 β-actin內(nèi)參抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜3次后，滴加羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶二抗（1∶2 000）室溫孵育120 min，洗膜后，滴加化學(xué)發(fā)光液顯色，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞中NF-200 和Tuj-1 陽(yáng)性表達(dá)率，NSE、NeuN、Tuj-1、NF、GHSR、Flk1 和CD29蛋白表達(dá)水平及p-MAPK/MAPK 和p-ERK/ERK 比值均符合正態(tài)分布，以xˉ±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，樣本均數(shù)組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組ADSCs 病理形態(tài)表現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)第10 天，空白組ADSCs 呈長(zhǎng)梭形和螺旋狀融合；神經(jīng)分化誘導(dǎo)劑組細(xì)胞胞體收縮，長(zhǎng)梭形胞體向類圓形轉(zhuǎn)變，突起長(zhǎng)度延長(zhǎng)及類似神經(jīng)元樣細(xì)胞數(shù)增多。Ghrelin 組細(xì)胞胞體突起進(jìn)一步增多，類圓形細(xì)胞數(shù)目進(jìn)一步增多。U0126 組和D-Lys3-GHRP-6 組僅有少量細(xì)胞胞體收縮及類圓形轉(zhuǎn)變。與Ghrelin 組比較，Ghrelin+U0126 組細(xì)胞胞體收縮及類圓形轉(zhuǎn)變減少。見(jiàn)圖1。

圖1 各組ADSCs 病理形態(tài)表現(xiàn)（Bar=50 μm）Fig.1 Pathomorphology of ADSCs in various groups (Bar=50 μm)

2.2 各組ADSCs 中NF-200 和Tuj-1 陽(yáng)性表達(dá)率綠色表示NF-200 和Tuj-1 陽(yáng)性表達(dá)。與空白組比較，神經(jīng)分化誘導(dǎo)劑組細(xì)胞中NF-200 和Tuj-1陽(yáng)性表達(dá)率升高（P＜0.05）。與神經(jīng)分化誘導(dǎo)劑組比較，Ghrelin 組細(xì)胞中NF-200 和Tuj-1陽(yáng)性表達(dá)率升高（P＜0.05），U0126 組和D-Lys3-GHRP-6 組細(xì)胞中NF-200 及Tuj-1 陽(yáng)性表達(dá)率降低（P＜0.05）。與Ghrelin 組比較，U0126 組、D-Lys3-GHRP-6 組和Ghrelin+U0126 組細(xì)胞中NF-200 和Tuj-1 陽(yáng)性表達(dá)率降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖2 和表1。

表1 各組ADSCs 中NF-200 和Tuj-1 陽(yáng)性表達(dá)率Tab.1 Positive expression rates of NF-200 and Tuj-1 in ADSCs in various groups (n=6，±s，η/%)

表1 各組ADSCs 中NF-200 和Tuj-1 陽(yáng)性表達(dá)率Tab.1 Positive expression rates of NF-200 and Tuj-1 in ADSCs in various groups (n=6，±s，η/%)

*P＜0.05 vs blank group；△P＜0.05 vs neural differentiation inducer group；#P＜0.05 vs Ghrelin group.

Group Blank Neural differentiation inducer Ghrelin U0126 D-Lys3-GHRP-6 Ghrelin+U0126 NF-200 0.61±0.06 4.43±0.26*Tuj-1 0.41±0.04 3.92±0.28*9.73±0.42△1.71±0.10△#1.92±0.16△#4.06±0.88#8.46±0.40△2.06±0.14△#2.07±0.16△#4.69±0.32#

圖2 各組ADSCs 中NF-200 和Tuj-1 表達(dá)（免疫熒光，Bar=50 μm）Fig.2 Expressions of NF-200 and Tuj-1 in ADSCs in various groups（Immunofluorescence,Bar=50 μm）

2.3 各組ADSCs 中NSE、NeuN、Tuj-1 和NF 蛋白表達(dá)水平與空白組比較，神經(jīng)分化誘導(dǎo)劑組細(xì)胞中NSE、NeuN、Tuj-1 和NF 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與神經(jīng)分化誘導(dǎo)劑組比較，Ghrelin 組細(xì)胞中NSE、NeuN、Tuj-1 和NF 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），U0126 組和D-Lys3-GHRP-6 組細(xì)胞中NSE、NeuN、Tuj-1 及NF 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與Ghrelin 組比較，U0126 組、D-Lys3-GHRP-6 組和Ghrelin+U0126 組細(xì)胞中NSE、NeuN、Tuj-1 及NF 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖3 和表2。

表2 各組ADSCs 中NSE、NeuN、Tuj-1 和NF 蛋白表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of NSE, NeuN, Tuj-1, and NF proteins in ADSCs in various groups （n=6，±s）

表2 各組ADSCs 中NSE、NeuN、Tuj-1 和NF 蛋白表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of NSE, NeuN, Tuj-1, and NF proteins in ADSCs in various groups （n=6，±s）

*P＜0.05 vs blank group；△P＜0.05 vs neural differentiation inducer group；#P＜0.05 vs Ghrelin group.

Group Blank Neural differentiation inducer Ghrelin U0126 D-Lys3-GHRP-6 Ghrelin+U0126 NF 1.17±0.09 1.83±0.18*2.55±0.20△1.30±0.13△#1.31±0.14△#1.81±0.18#NSE 1.11±0.08 1.42±0.14*2.33±0.22△1.30±0.10△#1.29±0.12△#1.66±0.14#NeuN 1.07±0.08 1.77±0.17*2.44±0.21△1.24±0.14△#1.22±0.14△#1.79±0.15#Tuj-1 1.07±0.09 1.56±0.15*2.68±0.20△1.29±0.10△#1.26±0.11△#1.57±0.15#

圖3 各組ADSCs 中NSE、NeuN、Tuj-1 和NF 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of NSE,NeuN, Tuj-1, and NF proteins in ADSCs in various groups

2.4 各組ADSCs 中GHSR、Flk1 和CD29 蛋白表達(dá)水平與空白組比較，神經(jīng)分化誘導(dǎo)劑組細(xì)胞中GHSR 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），F(xiàn)lk1 和CD29 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與神經(jīng)分化誘導(dǎo)劑組比較，Ghrelin 組細(xì)胞中GHSR 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），F(xiàn)lk1 和CD29 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），U0126 組和D-Lys3-GHRP-6 組細(xì)胞中GHSR 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），F(xiàn)lk1 和CD29 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與Ghrelin 組比較，U0126 組、D-Lys3-GHRP-6 組和Ghrelin+U0126 組細(xì)胞中GHSR 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），F(xiàn)lk1 和CD29 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖4 和表3。

表3 各組ADSCs 細(xì)胞中GHSR、Flk1 和CD29 蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of GHSR, Flk1，and CD29 proteins in ADSCs in various groups（n=6，±s）

表3 各組ADSCs 細(xì)胞中GHSR、Flk1 和CD29 蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of GHSR, Flk1，and CD29 proteins in ADSCs in various groups（n=6，±s）

*P＜0.05 vs blank group；△P＜0.05 vs neural differentiation inducer group；#P＜0.05 vs Ghrelin group.

Group Blank Neural differentiation inducer Ghrelin U0126 D-Lys3-GHRP-6 Ghrelin+U0126 CD29 1.18±0.07 0.50±0.04*0.12±0.01△0.99±0.09△#0.91±0.08△#0.49±0.04#GHSR 1.00±0.09 1.74±0.17*2.56±0.20△1.29±0.11△#1.28±0.13△#1.76±0.17#Flk1 1.04±0.08 0.55±0.14*0.17±0.01△0.97±0.09△#0.92±0.09△#0.51±0.05#

圖4 各組ADSCs中GHSR、Flk1和CD29蛋白表達(dá)電泳圖Fig.4 Electrophoregram of expressions of GHSR,Flk1,and CD29 proteins in ADSCs in various groups

2.5 各組ADSCs 中MAPK/ERK 通路蛋白表達(dá)水平與空白組比較，神經(jīng)分化誘導(dǎo)劑組細(xì)胞中p-MAPK/MAPK 和p-ERK/ERK 比值升高（P＜0.05）。與神經(jīng)分化誘導(dǎo)劑組比較，Ghrelin 組細(xì)胞中p-MAPK/MAPK 和p-ERK/ERK 比值升高（P＜0.05），U0126 組及 D-Lys3-GHRP-6 組細(xì)胞中p-MAPK/MAPK 和p-ERK/ERK 比值降低（P＜0.05）。與Ghrelin 組比較，U0126 組、D-Lys3-GHRP-6 組和Ghrelin+U0126 組細(xì)胞中p-MAPK/MAPK 和p-ERK/ERK 比值降低 （P＜0.05）。見(jiàn)圖5 和表4。

表4 各組ADSCs 中p-MAPK/MAPK 和p-ERK/ERK 比值Tab.4 Ratios of p-MAPK/MAPK and p-ERK/ERK in ADSCs in various groups（n=6，±s）

表4 各組ADSCs 中p-MAPK/MAPK 和p-ERK/ERK 比值Tab.4 Ratios of p-MAPK/MAPK and p-ERK/ERK in ADSCs in various groups（n=6，±s）

*P＜0.05 vs blank group；△P＜0.05 vs neural differentiation inducer group；#P＜0.05 vs Ghrelin group.

Group p-ERK/ERK p-MAPK/MAPK 1.00±0.09 1.84±0.18*2.66±0.22△1.21±0.10△#1.26±0.12△#1.80±0.18#1.04±0.08 1.65±0.16*2.47±0.25△1.37±0.13△#1.32±0.13△#1.69±0.15#Blank Neural differentiation inducer Ghrelin U0126 D-Lys3-GHRP-6 Ghrelin+U0126

圖5 各組ADSCs中MAPK、p-MAPK、ERK 和p-ERK蛋白表達(dá)電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expressions of MAPK,p-MAPK, ERK and p-ERK proteins in ADSCs in various groups

3 討 論

ADSCs 和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均存在干細(xì)胞分化潛能，具有多向分化能力且增殖速度快，在組織工程研究中具有重要作用。在周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，ADSCs 有促神經(jīng)修復(fù)及再生潛能，可進(jìn)行跨胚層分化，分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞，加速神經(jīng)發(fā)育［13］。ADSCs 誘導(dǎo)神經(jīng)元分化具有操作簡(jiǎn)單和無(wú)不良反應(yīng)等特點(diǎn)，被認(rèn)為在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面有較大的潛力，尋找促進(jìn)ADSCs 向神經(jīng)元分化的有效藥物，對(duì)于提高干細(xì)胞移植和神經(jīng)修復(fù)有重要意義。

Ghrelin 是GHSR 的內(nèi)源性配體，在神經(jīng)干細(xì)胞分化和神經(jīng)修復(fù)方面發(fā)揮重要作用［14］。研究［15］顯示：GHSR 可在體內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞膜上表達(dá)，GHSR 途徑活化可誘導(dǎo)胚胎脊髓神經(jīng)元前體細(xì)胞生長(zhǎng)，提示作為GHSR 內(nèi)源性配體的Ghrelin 也可能發(fā)揮促神經(jīng)調(diào)控作用。HAN 等［16］采用Ghrelin 外源性干預(yù)，可使GHSR 基因敲除小鼠嗅球部分多巴胺能神經(jīng)元數(shù)增加，且Ghrelin 基因敲除小鼠腦室室管膜下區(qū)和海馬齒狀回神經(jīng)祖細(xì)胞的再生及增殖明顯減少，外源性給予Ghrelin 可明顯增加神經(jīng)細(xì)胞數(shù)，提示Ghrelin 可作為神經(jīng)再生調(diào)節(jié)因子，影響神經(jīng)元分化。研究［17］顯示：Ghrelin 可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨和成脂分化，ADSCs 較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更易獲得，但Ghrelin 促進(jìn)ADSCs向神經(jīng)元分化的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。NF-200 和Tuj-1是與細(xì)胞骨架有關(guān)的蛋白，分別在成熟或未成熟神經(jīng)元中表達(dá)。此外，NSE 和NeuN 也在成熟神經(jīng)元中表達(dá)，這些蛋白均可作為神經(jīng)元分化標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示：神經(jīng)分化誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)ADSCs 向神經(jīng)元分化過(guò)程中，加入Ghrelin 后，ADSCs 向神經(jīng)元分化增強(qiáng)，提示Ghrelin 可作為神經(jīng)分化誘導(dǎo)劑的輔助藥物而促進(jìn)ADSCs 向神經(jīng)元分化。

MAPK/ERK 通路是參與細(xì)胞分化的重要通路之一。研究［18］證實(shí)：MAPK 是將胞外信號(hào)傳入胞內(nèi)并啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)增殖和分化及轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)節(jié)因子，胞外信號(hào)在激活酪氨酸激酶后，MAPK 可迅速感應(yīng)胞外刺激信號(hào)，并迅速磷酸化同時(shí)刺激下游胞內(nèi)調(diào)節(jié)因子ERK 活化。ERK 活化不僅可磷酸化胞內(nèi)底物使微管相關(guān)蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP2）和突觸蛋白（synapticprotein，tau）等蛋白表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)突觸再生，還可與糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）形成交叉串?dāng)_作用而促進(jìn)Wnt 活化，發(fā)揮促分化作用［19］。WANG 等［20］發(fā)現(xiàn)MAPK/ERK 通路的活化可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。本研究結(jié)果顯示：神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)ADSCs 向神經(jīng)元分化過(guò)程中，MAPK/ERK 通路被激活，采用ERK 阻斷劑U0126 阻斷MAPK/ERK 通路活化后，ADSCs向神經(jīng)元分化明顯緩滯，提示MAPK/ERK通路活化參與ADSCs向神經(jīng)元分化的調(diào)節(jié)。研究［10］顯示：Ghrelin 的配體GHSR 可通過(guò)促進(jìn)MAPK/ERK通路活化，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。本研究結(jié)果顯示：采用Ghrelin 受體阻斷劑D-Lys3-GHRP-6 阻斷GHSR 表達(dá)后，ADSCs 中MAPK/ERK 通路被抑制，ADSCs 向神經(jīng)元分化作用明顯減弱，提示Ghrelin 可促進(jìn)MAPK/ERK 活化和ADSCs 向神經(jīng)元分化。MAPK 抑制劑U0126 可明顯減弱Ghrelin 的促M(fèi)APK/ERK 活化及促ADSCs向神經(jīng)元分化作用，提示Ghrelin促進(jìn)ADSCs向神經(jīng)元分化的作用可能與激活MAPK/ERK通路有關(guān)。

綜上所述，Ghrelin 可通過(guò)激活MAPK/ERK 通路，促進(jìn)ADSCs 向神經(jīng)元分化。這可能為Ghrelin在干細(xì)胞組織修復(fù)工程領(lǐng)域的研究提供參考。