黃德盛, 趙亞楠, 陳 云, 孫藝瑤, 覃偉林, 劉謀杰, 謝菊華

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110034；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 沈陽 110034）

心肌細(xì)胞肥大是心肌細(xì)胞對(duì)傷害性刺激的代償性反應(yīng)。在成年人心臟中，心肌細(xì)胞再生能力有限，每年的周轉(zhuǎn)率不足1%，因此在心臟容量超負(fù)荷等刺激下，心肌細(xì)胞無法通過細(xì)胞增殖適應(yīng)壓力性應(yīng)激，而是通過形態(tài)學(xué)增大來維持心臟泵血功能［1］。目前臨床上尚缺乏特效藥物治療心肌細(xì)胞肥大。二甲雙胍是臨床糖尿病治療的一線用藥，研究［2-3］顯示：二甲雙胍在降低血糖水平的同時(shí)還具有改善心肌細(xì)胞肥大、抑制動(dòng)脈粥樣硬化及降低心肌梗死后心衰發(fā)生率或死亡風(fēng)險(xiǎn)等心血管保護(hù)作用，但其具體機(jī)制尚未完全闡明。

心臟是人體能量高需求器官，心肌細(xì)胞中的線粒體約占整個(gè)細(xì)胞的1/3［4］。且線粒體并非孤立的，而是相互聯(lián)通、處于分裂和融合平衡中，即線粒體動(dòng)力學(xué)平衡［5-7］。與線粒體分裂有關(guān)的蛋白主要為動(dòng)力相關(guān)蛋白1 （dynamin-related protein 1，Drp1），與線粒體融合有關(guān)的標(biāo)志性蛋白主要有神經(jīng)萎縮蛋白1 （optic atrophy 1，OPA1）、線粒體融合蛋白（mitofusin，MFN）1 和MFN2，分別介導(dǎo)線粒體內(nèi)膜和外膜的融合，以連接線粒體和穩(wěn)定膜電位，發(fā)揮細(xì)胞功能［8-9］。研究［10］發(fā)現(xiàn)：上調(diào)糖尿病心肌病大鼠心肌組織中OPA1 蛋白的表達(dá)可增加線粒體融合、恢復(fù)線粒體功能并改善心臟功能，提示加強(qiáng)線粒體融合可以作為治療心肌疾病的潛在治療策略。

臨床流行病學(xué)調(diào)查［11］顯示：未接受二甲雙胍治療的2 型糖尿病患者白細(xì)胞中總活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平和線粒體中ROS 水平均明顯升高，線粒體膜電位降低，MFN1、MFN2 和OPA1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平降低。同時(shí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［12］發(fā)現(xiàn)：二甲雙胍能夠通過調(diào)控線粒體動(dòng)力學(xué)平衡和改善大鼠心肌缺血再灌注損傷的線粒體功能發(fā)揮心臟保護(hù)作用。為深入了解二甲雙胍的心臟保護(hù)作用及其可能的分子機(jī)制，本研究通過異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）作用于H9C2 心肌細(xì)胞以建立心肌細(xì)胞肥大模型，探討二甲雙胍對(duì)ISO 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞中線粒體形態(tài)及主要融合蛋白OPA1 和MFN2 的影響，為二甲雙胍對(duì)心血管疾病的多重保護(hù)作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器H9C2 心肌細(xì)胞 （中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供）。低糖DMEM 和特級(jí)胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）均購自美國Hyclone 公司，ISO 購自美國Sigma 公司。CO2培養(yǎng)孵箱購自美國Thermo Fisher 公司，正置熒光顯微鏡和組織切片機(jī)購自德國Leica 公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀購自美國Bio-Rad 公司。

1.2 心肌細(xì)胞肥大模型制備、細(xì)胞分組和處理無菌操作下培養(yǎng)H9C2 細(xì)胞。待細(xì)胞已鋪滿培養(yǎng)皿底，可傳代培養(yǎng)或凍存。細(xì)胞生長密度為約50%～70%時(shí)，棄去原培養(yǎng)液，饑餓處理24 h 后，對(duì)照組細(xì)胞不給予特殊處理，部分細(xì)胞給予50 μmol·L－1ISO 干預(yù)細(xì)胞24 h 作為ISO 組，建立心肌細(xì)胞肥大模型。Western blotting 法檢測(cè)2 組H9C2 細(xì)胞中腦納肽（brain natriuretic peptide，BNP）蛋白表達(dá)水平以驗(yàn)證細(xì)胞模型，BNP 蛋白表達(dá)水平升高即為造模成功［13］。ISO 處理同時(shí)給予2 mmol·L－1二甲雙胍作用0.5 h、1.0 h、4.0 h、8.0 h 和24.0 h，分別收集細(xì)胞或直接保存以進(jìn)行后續(xù)相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為對(duì)照組、ISO 組、ISO+二甲雙胍組和二甲雙胍組。

1.3 CCK-8 法檢測(cè)各組細(xì)胞活力細(xì)胞接種4～6 h 后在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入1/10 體積的CCK-8 溶液，充分混勻后于37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)30 min。酶標(biāo)儀于波長450 nm 處檢測(cè)各孔吸光度（A）值，操作時(shí)注意避免氣泡產(chǎn)生，每組3～5 個(gè)復(fù)孔，取平均值計(jì)算各組細(xì)胞活力。細(xì)胞活力= ［實(shí)驗(yàn)組A 值－空白組A 值）］/［對(duì)照組A 值－空白組A 值］×100%。

1.4 結(jié)晶紫染色觀察各組心肌細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)和橫截面積于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種細(xì)胞，各組細(xì)胞給藥結(jié)束后采用4%多聚甲醛固定1 h。隨后滴加1%結(jié)晶紫，室溫靜置2 h，顯微鏡下拍照并記錄，觀察各組心肌細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)。每孔隨機(jī)選取5 個(gè)視野，每個(gè)視野隨機(jī)選取10 個(gè)H9C2 細(xì)胞，采用Image J 軟件分析各組心肌細(xì)胞橫截面積，并取平均值。

1.5 RT-qPCR 法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞中心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）mRNA 表達(dá)水平

PCR 引物均由北京鼎國采用Primer 5.0 設(shè)計(jì)并合成。提取各組細(xì)胞總RNA，采用核酸分析儀檢測(cè)波長260 nm 和280 nm 處的A 值以檢測(cè)RNA 純度。反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并根據(jù)RT-qPCR 試劑盒說明書配制反應(yīng)體系。ANP 引物序列：上游引物，5′-CCTGGACTGGGGAAGTCAAC-3′；下游引物，5′-GTCAATCCTACCCCCGAAGC-3′；GAPDH上游引物，5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物，5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。采用 2－ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA 表達(dá)水平。

1.6 線粒體熒光探針觀察各組心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)表現(xiàn)細(xì)胞給予藥物處理后，根據(jù)說明書配制 1 mmol·L－1Mito-Tracker Green 儲(chǔ)存液。取37 ℃預(yù)熱的1∶5 000 比例Mito-Tracker Green 儲(chǔ)存液加入至細(xì)胞培養(yǎng)液，共孵育30 min。去除染色工作液后加入新鮮培養(yǎng)液并采用熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞線粒體形態(tài)表現(xiàn)。鏡下線粒體呈明亮的強(qiáng)綠色熒光。

1.7 Western blotting 法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞中OPA1 和MFN2 蛋白表達(dá)水平將提取的H9C2 細(xì)胞或凍存的心肌組織置入蛋白裂解液內(nèi)提取蛋白。采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。依次配制SDS-聚丙烯酰胺分離膠和濃縮膠，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉，隨后一抗4 ℃孵育過夜，二抗孵育1.0～1.5 h，ECL 發(fā)光顯色，并采用Image J 軟件分析各蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組H9C2 細(xì)胞橫截面積和細(xì)胞活力，H9C2 細(xì)胞中ANP mRNA 表達(dá)水平及BNP、OPA1 和MFN2 蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細(xì)胞肥大模型鑒定50 μmol·L－1ISO 作用于H9C2 細(xì)胞24 h 后，與對(duì)照組［（1.00±0.11）和（1.00±0.04）］比較，ISO 組細(xì)胞橫截面積［（1.71±0.10）］增加（P＜0.05），細(xì)胞中BNP 蛋白表達(dá)水平（1.96±0.22）升高（P＜0.05），提示50 μmol·L－1ISO 作用于H9C2 細(xì)胞24 h 可以成功建立心肌細(xì)胞肥大模型。見圖1 和2。

圖1 ISO 處理后2 組H9C2 心肌細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)（結(jié)晶紫，×400）Fig.1 Morphology of H9C2 cardiomyocytes in two groups after treated with ISO(Crystal violet,×400)

圖2 2 組H9C2 細(xì)胞中BNP 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of BNP protein in H9C2 cells in two groups

2.2 各組心肌細(xì)胞活力CCK-8 法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞活力結(jié)果顯示：二甲雙胍作用8 h 時(shí)，細(xì)胞活力恢復(fù)效果最佳，故選取2 mmol·L－1二甲雙胍，作用時(shí)間為8 h。見圖3。

圖3 各組H9C2 心肌細(xì)胞活力Fig.3 Viabilities of H9C2 cardiomyocytes in various groups

2.3 各組心肌細(xì)胞中ANP mRNA 表達(dá)水平和線粒體形態(tài)表現(xiàn)RT-qPCR 法檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，ISO 組細(xì)胞中ANP mRNA 表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與ISO 組比較，二甲雙胍+ISO 組和二甲雙胍組細(xì)胞中ANP mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見圖4。線粒體熒光探針檢測(cè)結(jié)果顯示：對(duì)照組細(xì)胞中線粒體呈綠色熒光，多為短棒狀，少數(shù)線粒體絲線狀相連；與對(duì)照組比較，ISO 組H9C2 細(xì)胞中點(diǎn)狀線粒體明顯增加，ISO+二甲雙胍組和二甲雙胍組細(xì)胞中點(diǎn)狀線粒體明顯減少。見圖5。

圖4 各組H9C2 心肌細(xì)胞ANP mRNA 表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of ANP mRNA in H9C2 cardiomyocytes

圖5 各組H9C2 心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)表現(xiàn)（Bar=5 μm）Fig.5 Morphology of mitochondrium in H9C2 cardiomyocytes in various groups （Bar=5 μm）

2.4 各組心肌細(xì)胞中OPA1 和MFN2 蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，ISO 組細(xì)胞中線粒體融合標(biāo)志性蛋白OPA1 和MFN2 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與ISO 組比較，ISO+二甲雙胍組和二甲雙胍組細(xì)胞中OPA1 和MFN2 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見圖6。

圖6 各組細(xì)胞中OPA1 和MFN2 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B，C）Fig.6 Electrophoregram(A) and histograms(B,C) of expressions of OPA1 and MFN2 proteins in cells in various groups

3 討 論

心肌細(xì)胞肥大一般可分為生理性和病理性心肌細(xì)胞肥大。生理性心肌細(xì)胞肥大一般發(fā)生在運(yùn)動(dòng)員和孕婦人群，其主要特征是一旦刺激緩解，心肌細(xì)胞肥大是可逆的［14］。而病理性心肌細(xì)胞肥大則是心肌細(xì)胞不可逆的病理性重塑，如高血壓和慢性瓣膜疾病所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞肥大，易增加患者不良心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重者可誘發(fā)心力衰竭［15］。因此，有效改善或減輕病理性心肌細(xì)胞肥大對(duì)高血壓和慢性瓣膜疾病等疾病的治療有重要意義，同時(shí)構(gòu)建簡(jiǎn)單易操作且成功的心肌細(xì)胞肥大體內(nèi)外模型對(duì)常見心血管疾病的基礎(chǔ)研究和臨床防治較為重要。本研究結(jié)果顯示：H9C2 細(xì)胞橫截面積明顯增加是心肌細(xì)胞肥大最常見指標(biāo)之一，BNP 蛋白表達(dá)水平升高提示ISO 作用H9C2 細(xì)胞24 h 可以成功模擬心肌細(xì)胞肥大，為后續(xù)心肌細(xì)胞肥大的發(fā)病機(jī)制及藥物干預(yù)研究提供了基礎(chǔ)。

線粒體是心肌細(xì)胞能量產(chǎn)生的重要場(chǎng)所，在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮了重要作用。線粒體功能障礙與高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化等常見心血管疾病有密切關(guān)聯(lián)［16-18］。本課題組前期研究［19］發(fā)現(xiàn)：自發(fā)性高血壓心肌細(xì)胞肥大大鼠線粒體膜電位降低，過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α 表達(dá)下調(diào)，表明心肌細(xì)胞肥大與線粒體功能失調(diào)有關(guān)，維持線粒體功能和穩(wěn)態(tài)對(duì)改善心肌細(xì)胞肥大具有重要意義。但心肌細(xì)胞中線粒體相互聯(lián)通，保持高度動(dòng)態(tài)的線粒體動(dòng)力學(xué)平衡［20-22］。通過融合分裂，線粒體可以在細(xì)胞內(nèi)根據(jù)需求重新分布，滿足細(xì)胞的各種能量及生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)需求，保障細(xì)胞新陳代謝和生物體正常運(yùn)轉(zhuǎn)。

線粒體動(dòng)力學(xué)平衡是維持心臟功能所必需的，該平衡被打破會(huì)導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)改變及功能障礙，誘發(fā)各種心肌疾病［23-25］。研究［26-28］顯示：線粒體動(dòng)力學(xué)平衡失調(diào)在心力衰竭和缺血再灌注損傷等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。研究［29］發(fā)現(xiàn)：抑制線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白的活性能夠減少心肌梗死小鼠線粒體過度分裂而減輕梗死區(qū)域心肌纖維化，改善心臟功能。LIU 等［30］發(fā)現(xiàn)：上調(diào)糖尿病心肌病大鼠心肌組織中OPA1 蛋白的表達(dá)能增加線粒體融合，恢復(fù)線粒體功能，改善心臟功能。本研究結(jié)果顯示：ISO 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞中點(diǎn)狀線粒體明顯增加，同時(shí)線粒體融合相關(guān)蛋白OPA1 和MFN2 蛋白表達(dá)水平降低。提示ISO 誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞肥大與心肌細(xì)胞線粒體融合減少有關(guān)。線粒體融合減少可能是ISO 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的可能分子機(jī)制。

二甲雙胍是臨床糖尿病治療的一線用藥，近些年已被證實(shí)具有良好的心血管保護(hù)作用［31］。本研究結(jié)果顯示：二甲雙胍干預(yù)后，ISO 誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中ANP mRNA 表達(dá)水平降低。給予二甲雙胍后，ISO 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞中點(diǎn)狀線粒體減少，線粒體融合相關(guān)蛋白OPA1 和MFN2 蛋白表達(dá)水平升高。提示二甲雙胍可能通過調(diào)控OPA1 和MFN2 蛋白表達(dá)，維持線粒體動(dòng)力學(xué)平衡，從而減輕ISO 誘導(dǎo)的H9C2 心肌細(xì)胞肥大。

綜上所述，二甲雙胍對(duì)ISO 誘導(dǎo)的H9C2 心肌細(xì)胞肥大有改善作用，且其改善作用可能與上調(diào)OPA1 和MFN2 蛋白表達(dá)及促進(jìn)心肌細(xì)胞線粒體融合有關(guān)。