楊 舟, 林書典, 詹宇威, 肖 璐, 符克英, 黃小蝶

（海南省人民醫(yī)院 海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，海南 ?？?570000）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以關(guān)節(jié)滑膜炎為主要特征的系統(tǒng)性疾病。作為滑膜的主要組成細(xì)胞，成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblastlike synoviocytes，F(xiàn)LSs）在RA 患者滑膜組織中具有腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)，呈增殖、遷移和侵襲能力異常，可誘發(fā)致炎因子和蛋白酶的分泌，導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨和骨的破壞及滑膜炎癥［1-2］。Rho 相關(guān)螺旋卷曲蛋白激酶（Rho associated coiled-coil containing protein kinases，ROCK）作為小型Rho 三磷酸鳥(niǎo)苷（guanosine triphosphate，GTP）酶的主要下游效應(yīng)蛋白，是細(xì)胞黏附、遷移、收縮和增殖等過(guò)程的多功能調(diào)節(jié)劑，參與癌癥、糖尿病和RA 等各種疾病的發(fā)生發(fā)展［3］。ROCK2 作為ROCK 蛋白家族成員之一，已被證實(shí)在RA 中高表達(dá)，并促進(jìn)RA-FLSs的增殖、遷移和侵襲［4］。近年來(lái)，微小RNA（microRNA，miRNA）常作為各種疾病的治療靶點(diǎn)。miR-93-5p 是炎癥抑制因子，可抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)［5］。過(guò)表達(dá)miR-93-5p 可通過(guò)靶向下調(diào)ROCK2 表達(dá)進(jìn)而抑制糖尿病腎病細(xì)胞增殖和纖維化并加速細(xì)胞凋亡［6］。目前有關(guān)miR-93-5p 與RA 關(guān)系的研究尚未完全闡明，因此本研究探討miR-93-5p 對(duì)RA-FLSs 增殖、遷移和侵襲的影響，并初步闡明其作用機(jī)制，旨在為臨床RA 的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇2020 年1 月—2021 年6 月在海南省人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科接受治療的RA 患者（RA 組）37 例和接受關(guān)節(jié)置換手術(shù)的關(guān)節(jié)創(chuàng)傷患者（對(duì)照組）30 例作為研究對(duì)象，收集新鮮滑膜組織樣本。所有RA 患者均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（american college of rheumatology，ACR）1987 年RA 診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］，所有關(guān)節(jié)創(chuàng)傷患者無(wú)關(guān)節(jié)炎病史、未用過(guò)激素和慢作用藥物等。所有患者均簽訂知情同意書，并獲得海南省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞、主要試劑和儀器293T 細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。DMEM 完全培養(yǎng)基、Ⅰ型膠原酶、Matrigel 基質(zhì)膠和結(jié)晶紫購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司，TaqMan miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan miRNA 定量PCR 試劑盒、Golden MLV 反轉(zhuǎn)錄酶和RAPA3G Probe qPCR MasterMix購(gòu)自哈爾濱新?；驒z測(cè)有限公司，miR-93-5p mimics 及其陰性對(duì)照mimics NC 和ROCK2 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體（OE-ROCK）及其空載質(zhì)粒載體（OENC）購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司，抗體CD14-PE、CD55-PE、CD68-FITC 及同型陰性對(duì)照抗體購(gòu)自美國(guó)BD 公司，Vimentin 抗體（免疫熒光）、ROCK2 抗體、Ki-67 抗體、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallopeptiase，MMP）-2抗體、MMP-9 抗體和GAPDH 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，BeyoClickTMEdU-488 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，CCK-8試劑盒和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，Transwell小室（孔徑8.0 μm）購(gòu)自美國(guó)Corning 公司。流式細(xì)胞儀（型號(hào)：AttuneTMNxT）、CO2培養(yǎng)箱（型號(hào)：HeracellTMVios 250i）和多功能酶標(biāo)儀（型號(hào)：Varioskan LUX）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀（型號(hào)：CFX96-Connect 96）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司，激光共聚焦顯微鏡（型號(hào)：DMIL LED）購(gòu)自日本Nikon 公司。

1.3 RA-FLSs 的分離、培養(yǎng)和鑒定將RA 組患者滑膜組織于無(wú)菌條件下剪碎，并加入1 % Ⅰ型膠原酶消化2 h，吸取組織塊轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h。取出培養(yǎng)瓶加入DMEM 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每隔2 d 換液1 次，發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞爬出后，去除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)80 %以上，采用0.25 %胰蛋白酶消化細(xì)胞，并按1∶3 比例進(jìn)行傳代。采用免疫熒光法和流式細(xì)胞術(shù)鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞為RA-FLSs。免疫熒光法：將第3 代RA-FLSs培養(yǎng)于細(xì)胞爬片上，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80 %時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS 緩沖液洗滌2 次，加入4 %多聚甲醛室溫固定30 min，PBS 緩沖液洗滌2 次，加入0.5 %Triton X-100 室溫通透20 min，PBS 緩沖液洗滌2 次，加入5 %BSA 溶液于37 ℃封閉1 h，棄去封閉液，加入一抗Vimentin 抗體，4 ℃條件下孵育過(guò)夜，PBS 緩沖液洗滌2 次，加入熒光二抗，于37 ℃孵育1 h，PBS 緩沖液洗滌2 次，加入500 μL含DAPI 抗熒光淬滅封片液，激光共聚焦顯微鏡拍照并記錄。流式細(xì)胞術(shù)：將第3 代RA-FLSs 消化調(diào)整密度為1×106mL－1的細(xì)胞懸液，取100 μL 細(xì)胞懸液加入至各個(gè)檢測(cè)管中，分別加入熒光標(biāo)記的CD14-PE、CD55-PE 和CD68-FITC 抗體及同型陰性對(duì)照抗體，避光孵育30 min，1 500 r·min－1離心5 min，棄上清，將細(xì)胞沉淀加入PBS 緩沖液重懸后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RA-FLSs 表面抗原表達(dá)情況。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組將第3 代RA-FLSs 以每孔2×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，細(xì)胞密度生長(zhǎng)至80 %時(shí)，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將RA-FLSs 分為空白組、mimics NC 組（轉(zhuǎn)染miR-93-5p mimics NC）、mimics 組（轉(zhuǎn)染miR-93-5p mimics）、OENC 組（轉(zhuǎn)染ROCK2 過(guò)表達(dá)空載質(zhì)粒）、OEROCK2 組（轉(zhuǎn)染ROCK2 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒）、mimics+OE-NC 組（共轉(zhuǎn)染miR-93-5p mimics 和ROCK2 過(guò)表達(dá)空載質(zhì)粒）和mimics+OE-ROCK2 組（共轉(zhuǎn)染miR-93-5p mimics 和ROCK2 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒）。

1.5 RT-qPCR 法檢測(cè)2 組患者滑膜組織和各組RA-FLSs 中miR-93-5p 及ROCK2 mRNA 表達(dá)水平將2 組患者滑膜組織和各組RA-FLSs 裂解，提取總RNA，各取2 μg 滑膜組織和細(xì)胞中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，配置RT-qPCR 反應(yīng)體系，進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)，引物序列：miR-93-5p F 5′-GAGTGTCAAAGTGCTGTTCGTG-3′，miR-93-5p R 5′-GCAG GGTCCGAGGTATTC-3′；U6 F 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6 R 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；ROCK2 F 5′-GAACGTCAGGATGCAGATGG-3′，ROCK2 R 5′-GCCAAAGAGTCCCGTTCATC-3′；β-actin F 5′-CCCTGGAGAAGAGCTACGAG-3′，β-actin R 5′-GGAAGGAAGGCTGGAAGAGT-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 熱啟動(dòng)5 min；95 ℃變性5 s；55 ℃退火10 s，72 ℃延伸 30 s，循環(huán)40 次。以U6 作為miR-93-5p 的內(nèi)參，β-actin 作為ROCK2 mRNA 的內(nèi)參，采用2－△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA 表達(dá)水平。

1.6 CCK-8 法檢測(cè)各組RA-FLSs 增殖活性取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RA-FLSs 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并將其調(diào)整至密度為5×104mL－1的細(xì)胞懸液。于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL RA-FLSs 懸液，置于培養(yǎng)箱中過(guò)夜。分別培養(yǎng)24 和48 h，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，加入CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后置入酶標(biāo)儀，于波長(zhǎng)450 nm 處檢測(cè)各孔吸光度（A）值，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（每孔100 μL 培養(yǎng)基），每組設(shè)定4 個(gè)復(fù)孔。以A 值代表各組細(xì)胞增殖活性。

1.7 EdU 染色檢測(cè)各組RA-FLSs 中EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率將各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RA-FLSs 接種至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，待細(xì)胞貼壁后，每孔加入100 μL EdU 培養(yǎng)基（50 μmol·L－1）孵育2 h，PBS 緩沖液清洗2 次，加入4 %多聚甲醛固定液室溫孵育30 min，含0.5 %Triton X-100 的PBS 處理10 min，PBS 緩沖液清洗后，加入Apollo 染色反應(yīng)液，室溫避光脫色搖床孵育30 min，再以Hoechst33342 反應(yīng)液復(fù)染進(jìn)行DNA 染色。染色完成立即置于顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況，并隨機(jī)選取5 個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算各組RA-FLSs 中EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率。EdU陽(yáng)性細(xì)胞率=EdU 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.8 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組RA-FLSs 遷移和侵襲數(shù)遷移實(shí)驗(yàn)：將RA-FLSs 制成密度為5×105mL－1的細(xì)胞懸液，取100 μL 加入Transwell 上室，下室加入600 μL 含10 %血清的培養(yǎng)基，于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出小室，用棉簽拭去上室細(xì)胞，加入70% 甲醛固定1 h，0.1 %結(jié)晶紫溶液染色30 min，取出小室內(nèi)聚碳酸酯膜，移至載玻片上，用中性樹(shù)膠封片，于顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，并隨機(jī)選取5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)并取其平均值。侵襲實(shí)驗(yàn)：將Matrigel膠置于4 ℃冰箱過(guò)夜，已融化的Matrigel 膠采用無(wú)血清的培養(yǎng)基稀釋至300 mL·L－1，取100 μL 均勻涂抹在聚碳酸酯膜上表面，室溫放置3 h 成膠狀，后續(xù)操作同遷移實(shí)驗(yàn)，于顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，并取其平均值作為侵襲細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.9 Western blotting 法檢測(cè)各組RA-FLSs 中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)水平收集各組細(xì)胞，加入RIPA 裂解液裂解后，13 000 r·min－1離心10 min，收集上清，置于酶標(biāo)儀中測(cè)定蛋白濃度。將檢測(cè)蛋白樣品置于沸水浴中10 min，使蛋白充分變性，取30 μg 總蛋白上樣行10% SDS-PAGE 電泳，采用濕式電轉(zhuǎn)PVDF膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，標(biāo)記Marker，并進(jìn)行麗春紅染色后剪膜，TBST 溶液洗膜2 次，將膜完全浸沒(méi)5 %脫脂奶粉封閉液內(nèi)室溫輕搖1 h，將封閉后的膜放入雜交袋中，分別加入一抗ROCK2 抗體（1∶1 000）、Ki-67 抗體（1∶1 000）、PCNA 抗體（1∶1 000）、MMP-2抗體（1∶1 000）、MMP-9抗體（1∶1 000）和GAPDH 抗體（1∶1 000），室溫孵育10 min，4 ℃過(guò)夜。次日，室溫孵育30 min，TBST 溶液洗膜5 次，加入二抗（1∶10 000）室溫輕搖40 min，TBST 溶液洗膜5 次，滴加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液（enhanced chemiluminescence，ECL）至膜上反應(yīng)2 min，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.10 miR-93-5p 與ROCK2 的靶向關(guān)系驗(yàn)證和細(xì)胞中雙熒光素酶活性檢測(cè)采用TargetScan 7.2 在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-93-5p 和ROCK2 的靶向結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)合成ROCK2-3′-UTR 野生型（ROCK2-WT）和ROCK2-3′-UTR 突變型（ROCK2-MUT）片段序列，并分別構(gòu)建至熒光素酶報(bào)告載體中，得到ROCK2-WT 和ROCK2-MUT熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。采用Lipofectamine 2000 試劑分別將miR-93-5p mimic 和mimic NC 與ROCK2-WT 或ROCK2-MUT 質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期293T 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h 后，將已充分裂解的細(xì)胞按照雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，并采用酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞中螢火蟲和海腎熒光素酶活性，計(jì)算熒光素酶活性。熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2 組患者滑膜組織和各組細(xì)胞中miR-93-5p 及ROCK2 mRNA 表達(dá)水平，各組細(xì)胞增殖活性、EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞中熒光素酶活性均符合正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RA-FLSs 鑒定免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示：Vimentin 蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：第3 代RA-FLSs 表面CD55 呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為（95.4%±4.9%），CD14 和CD68 呈陰性表達(dá)，陰性表達(dá)率為（4.1%±1.3%）和（3.3%±1.0%）。由此證實(shí)所分離的細(xì)胞是RAFLSs。見(jiàn)圖1。

圖1 免疫熒光法檢測(cè)RT-FLSs 中Vimentin 表達(dá)（×400）Fig.1 Expressions of Vimentin in RT-FLSs detected by immunofluorescence method（×400）

2.2 2 組患者滑膜組織中miR-93-5p 和ROCK2 mRNA 表達(dá)水平與對(duì)照組（1.00±0.02 和1.00±0.01）比較，RA 組患者滑膜組織中miR-93-5p 表達(dá)水平（0.26±0.05）明顯降低（P＜0.01），ROCK2 mRNA 表達(dá)水平（5.87±0.30）明顯升高（P＜0.01）。

2.3 各組 RA-FLSs 中 miR-93-5p 和 ROCK2 mRNA 及蛋白表達(dá)水平與空白組［（1.00±0.02）、（1.00±0.01）和 （1.00±0.05）］和mimics NC 組［（1.00±0.02）、（1.00±0.01）和（1.00±0.05）］比較，mimics 組細(xì)胞中miR-93-5p表達(dá)水平（8.06±0.05）明顯升高（P＜0.01），ROCK2 mRNA （0.19±0.05）和蛋白（0.11±0.03）表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2 miR-93-5p mimics 轉(zhuǎn)染后RA-FLSs 中ROCK2 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expression of ROCK2 protein in RA-FLSs after transfected with miR-93-5p mimics

2.4 各組RA-FLSs 細(xì)胞增殖活性和EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率培養(yǎng)24 和48 h 時(shí)，與mimics NC 組比較，mimics 組細(xì)胞增殖活性和EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率明顯降低（P＜0.01），OE-ROCK2 組細(xì)胞增殖活性和EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率明顯升高（P＜0.01），而OE-NC組上述指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。培養(yǎng)24 和48 h 時(shí)，與mimics 組比較，mimics+OEROCK2 組細(xì)胞增殖活性和EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率明顯升高（P＜0.01），而mimics+OE-NC 組細(xì)胞上述指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3～5。

圖3 CCK-8 法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性Fig.3 Proliferation activity rates of cells in various groups detected by CCK-8 method

圖4 EdU 染色檢測(cè)各組EdU 陽(yáng)性細(xì)胞（×400）Fig.4 EdU positive cells in various groups detected by EdU staining（×400）

圖5 各組EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率Fig.5 Rates of EdU positive cells in various groups

2.5 各組RA-FLSs 的遷移和侵襲數(shù)與mimics NC 組比較，mimics 組RA-FLSs 的遷移和侵襲數(shù)明顯減少（P＜0.01），OE-ROCK2 組RA-FLSs 的遷移和侵襲數(shù)明顯增加（P＜0.01），而OE-NC 組RA-FLSs 的遷移和侵襲數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與mimics 組比較，mimics+OE-ROCK2 組RA-FLSs 的遷移和侵襲數(shù)明顯增加（P＜0.01），而mimics+OE-NC 組RA-FLSs 的遷移和侵襲數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖6 和7。

圖6 Transwall 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組遷移細(xì)胞數(shù)Fig.6 Numbers of migration cells in various groups detected by Transwell champer assay

圖7 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)Fig.7 Numbers of invasion cells in various groups detected by Transwell champer assay

2.6 各組RA-FLSs 中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)水平與mimics NC 組比較，mimics 組細(xì)胞中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），OE-ROCK2 組細(xì)胞中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），OE-NC 組細(xì)胞中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與mimics 組比較，mimics+OE-ROCK2 組細(xì)胞中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），mimics+OE-NC 組細(xì)胞中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖8。

圖8 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.8 Electrophoregram (A) and histogram(B) of expressions of ROCK2,Ki-67,PCNA,MMP-2, and MMP-9 proteins in cells in various groups detected by Western blotting method

2.7 miR-93-5p 與ROCK2 的靶向關(guān)系驗(yàn)證

TargetScan7.2 在線網(wǎng)站分析結(jié)果顯示：miR-93-5p 與ROCK2 -3′-UTR 之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，提示miR-93-5p 可靶向調(diào)控ROCK2。雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-93-5p mimic 可明顯降低ROCK2-WT 組細(xì)胞中熒光素酶活性（P＜0.01），但ROCK2-MUT 組細(xì)胞中熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖9。

圖9 ROCK2-WT(A)和ROCK2-MUT(B)組細(xì)胞中熒光素酶活性Fig.9 Luciferase activies in cells in ROCK2-WT (A) and ROCK2-MUT (B) groups

3 討 論

FLSs 作為RA 的主要效應(yīng)細(xì)胞，可產(chǎn)生各種致病介質(zhì)，如趨化因子和MMP，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和骨壞死［8-9］。研究［10-12］發(fā)現(xiàn)：在RA-FLSs 中出現(xiàn)多種miRNA 表達(dá)異常，miRNA 在FLSs 和破骨細(xì)胞中表達(dá)失調(diào)，促進(jìn)MMP 分泌，引起炎癥和細(xì)胞外基質(zhì)降解，破壞關(guān)節(jié)。miR-124a 在RA 患者滑膜組織中呈低表達(dá)，通過(guò)靶向調(diào)控AKT2 基因抑制RAFLSs 的增殖、遷移和侵襲［13］。而miR-93-5p 作為一種細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制基因，常用于治療各種癌癥疾病，目前其在RA 疾病中的作用尚未完全闡明［14］。本研究結(jié)果顯示：RA-FLSs 中Vimentin 表達(dá)呈陽(yáng)性，細(xì)胞表面CD55 呈陽(yáng)性表達(dá)，而CD14 和CD68 呈陰性表達(dá)，提示所分離的細(xì)胞是RA-FLSs。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：過(guò)表達(dá)miR-93-5p 可抑制RA-FLSs 的增殖、遷移和侵襲，而抑制miR-93-5p 表達(dá)則促進(jìn)RA-FLSs 增殖、遷移和侵襲，提示miR-93-5p 可能參與RA 的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示：miR-93-5p 在RA 患者滑膜組織中低表達(dá)，ROCK2 在RA 患者滑膜組織中高表達(dá)。miR-93-5p mimics 轉(zhuǎn)染后，RA-FLSs 中miR-93-5p 高表達(dá)，而ROCK2 低表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)：miR-93-5p 靶向負(fù)調(diào)控ROCK2。ROCK2 是一種參與細(xì)胞黏附和收縮過(guò)程中細(xì)胞骨架重組的蛋白質(zhì)［15］。ROCK2 參與RA 疾病的發(fā)生，表現(xiàn)為上調(diào)ROCK2 促進(jìn)FLSs 增殖、遷移和侵襲［16-17］。本研究結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)miR-93-5p 能顯著降低RA-FLSs 增殖、遷移和侵襲能力，而過(guò)表達(dá)ROCK2 呈現(xiàn)相反效果。共轉(zhuǎn)染miR-93-5p mimics 和OE-ROCK2 后，ROCK2 可以明顯逆轉(zhuǎn)單一過(guò)表達(dá)miR-93-5p 對(duì)RA-FLSs 的增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用。提示過(guò)表達(dá)miR-93-5p 通過(guò)下調(diào)ROCK2 表達(dá)，從而降低RA-FLSs 的增殖、遷移和侵襲能力。

細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力受多種機(jī)制調(diào)控［18］。陳盛燁等［19］認(rèn)為：下調(diào)腎癌細(xì)胞中Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)，可抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Ki-67 和PCNA 是細(xì)胞增殖標(biāo)記蛋白，MMP-2 和MMP-9 是細(xì)胞遷移和侵襲標(biāo)記蛋白，調(diào)控多種癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力［20］。研究［21-22］顯示：在癌細(xì)胞中降低ROCK2 表達(dá)水平可引起Ki-67 和MMP-2 表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究進(jìn)一步分析miR-93-5p 靶向ROCK2 表達(dá)影響RA-FLSs 增殖、遷移和侵襲能力機(jī)制的結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)miR-93-5p 后RA-FLSs 中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)水平明顯降低，而過(guò)表達(dá)ROCK2后，RA-FLSs 中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2和MMP-9 蛋白表達(dá)水平明顯升高。提示ROCK2表達(dá)與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。同時(shí)，過(guò)表達(dá)ROCK2 可以明顯逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-93-5p 引起的ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)水平降低。提示過(guò)表達(dá)miR-93-5p 可能通過(guò)靶向下調(diào)ROCK2 表達(dá)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等標(biāo)記蛋白并影響RAFLSs 的增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述，RA 患者滑膜組織中miR-93-5p 呈低表達(dá)，ROCK2 呈高表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-93-5p 可抑制RA-FLSs 增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與靶向下調(diào)ROCK2 表達(dá)有關(guān)。