閆圣玉, 劉昌化, 許志杰, 丁雅婷, 謝亞鋒, 張 僑, 劉菀瑩

（1.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院肛腸科，湖南 衡陽 421000；2.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院胃腸外科，湖南 衡陽 421001）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種常見的惡性腫瘤，其無特異臨床表現(xiàn)且生存時間與確診時疾病分期密切相關(guān)。CRC 在我國消化道腫瘤中發(fā)病率位于第3 位，且呈逐年上升的趨勢。為了提高CRC 治療效果、減少副作用并降低發(fā)生繼發(fā)性腫瘤的風(fēng)險，仍需尋找更好的治療手段。因此針對CRC 發(fā)病特點的定點靶向治療對CRC 的治療和預(yù)后具有重要意義［1］。研究［2-3］發(fā)現(xiàn)：長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）參與CRC的發(fā)生發(fā)展，可介導(dǎo)CRC 細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。lncRNA 配對盒8 反義RNA 1 （lncRNA PAX8-AS1）在鼻咽癌和乳頭狀甲狀腺癌組織中低表達，其過表達可抑制腫瘤細胞生長［4-5］。但也有研究［6］表明：PAX8-AS1 在非小細胞肺癌中過表達，其沉默可降低非小細胞肺癌的細胞增殖活性和遷移能力。PAX8-AS1 在CRC 組織中高表達，因此CRC細胞惡性生物學(xué)行為可能與PAX8-AS1 高表達有關(guān)聯(lián)。微小RNA （microRNA，miRNA）作為一種長度為18～25 個核苷酸的單鏈非編碼RNA，也參與了惡性腫瘤的不同過程，如在CRC 組織和細胞中，miR-22-3p 明顯下調(diào)，miR-22-3p 能夠通過介導(dǎo)RAS 癌基因家族成員RAP2B/磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B （protein kinase B，Akt）通路明顯抑制CRC細胞增殖和侵襲［7］。然而PAX8-AS1 是否通過miR-22-3p 介導(dǎo)CRC 的生物學(xué)行為尚未完全闡明。本研究探討PAX8-AS1 和miR-22-3p 在CRC 細胞中表達及其對CRC 細胞增殖、凋亡和侵襲的影響，并闡明其作用機制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選擇2018 年7 月—2020 年12 月在南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院肛腸科行手術(shù)切除的94 例CRC 患者為研究對象，所有患者均經(jīng)證實患有CRC，收集CRC 患者癌組織及對應(yīng)癌旁組織（距癌灶邊緣＞5 cm 取材）標本。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control，UICC）制訂的TNM 分期第8 版標準［8］對CRC 患者進行臨床分期，其中Ⅰ～Ⅱ期35 例，Ⅲ～Ⅳ期59 例。

1.2 納入和排除標準納入標準：①初次診斷為CRC 者；②臨床資料完整；③依從性較好者；④生存時間超過6 個月。排除標準：①并發(fā)其他惡性腫瘤者；②患有自身免疫性疾病者；③精神疾病患者。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，且所有患者知情并簽署同意書。

1.3 細胞、主要試劑和儀器人CRC 細胞（SW480、SW620、HT-29 和LoVo）購自中國科學(xué)院細胞庫，人正常結(jié)腸上皮細胞NCM460 購自武漢普諾賽生命科技有限公司。DMEM 和RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司），胎牛血清（美國Gibco 公司），磷酸鹽（phosphate buffer solution，PBS）緩沖液、0.25%胰蛋白酶和DMSO（美國Sigma 公司），MTT 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），TRIzol 試劑（美國Ambion 公司），SYBR FAST qPCR Master Mix（美國KAPA Biosystems 公司），ECL 顯影液（美國Millipore 公司），兔抗人B 細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體、兔抗人Bcl-2 相關(guān) X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）抗體、兔抗人cleaved Caspase-3 抗體和兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（英國Abcam 公司），HRP 標記羊抗兔二抗（武漢愛博泰克生物科技有限公司），小分子si-PAX8-AS1 和miRNA-22-3p 抑制劑（miR-22-3p inhibitors）均由廣州銳博生物科技有限公司合成，雙熒光素酶報告基因檢測質(zhì)粒由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。倒置顯微鏡（型號：DMIL LED，德國Leica 公司），酶標儀（型號：AMR-100，杭州奧盛儀器有限公司），流式細胞儀（型號：Accuri C6，美國BD 公司），實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTqPCR）儀（型號：CFX-Connect 96，美國Bio-Rad公司），全自動化學(xué)發(fā)光分析儀（型號：Tanon-5200，上海天能科技有限公司）。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染和分組取凍存的人CRC 細胞（SW480、SW620、HT-29 和LoVo）和人正常結(jié)腸上皮細胞NCM460 復(fù)蘇后，NCM460 細胞采用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，CRC 細胞采用含10%胎牛血清的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)2～3 d傳代1 次。

取對數(shù)生長期SW480 細胞，以每孔1×104個細胞的密度接種于24 孔細胞培養(yǎng)板中。待細胞生長融合至80%時，采用LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑將si-PAX8-AS1 及其小分子序列陰性對照（siRNA-negative control，si-NC）分別或同時與miR-22-3p inhibitors 及其小分子抑制劑陰性對照（inhibitors negative control，inhibitors NC）轉(zhuǎn)染至細胞中，分為si-NC 組（轉(zhuǎn)染陰性序列）、si-PAX8-AS1 組 （轉(zhuǎn)染 PAX8-AS1 siRNA）、si-PAX8-AS1+inhibitors NC 組（共轉(zhuǎn)染PAX8-AS1 siRNA 和 inhibitors NC）和 si-PAX8-AS1+inhibitors 組（共轉(zhuǎn)染PAX8-AS1 siRNA 和miR-22-3p inhibitors），另取未經(jīng)任何轉(zhuǎn)染的SW480細胞作為對照組。轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細胞沉淀用于后續(xù)實驗。

1.5 RT-qPCR 法檢測CRC 患者癌組織、細胞和各組SW480 細胞中PAX8-AS1 mRNA 和miR-22-3p表達水平收集CRC 患者癌組織、癌旁組織及細胞，采用TRIzol 試劑提取癌組織和各組細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 為模板，采用RT-qPCR 儀進行PCR 擴增，反應(yīng)總體積20 μL （SYBR FAST qPCR Master Mix：10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA：1 μL，DNase/RNase-Free water：8 μL），反應(yīng)條件及過程：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性5 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，40 個循環(huán)，每個樣本設(shè)3 個復(fù)孔。采用2－ΔΔCt法計算目的基因mRNA 表達水平。引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of PCR

1.6 MTT 法檢測各組細胞增殖活性取轉(zhuǎn)染后的各組細胞，以 1×103mL－1的密度接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，分別于培養(yǎng) 24、48 和72 h 后，吸去原培養(yǎng)基，每孔加入20 μL MTT 充分混勻，室溫培養(yǎng)4 h，每孔加入 100 μL DMSO混勻，培養(yǎng)15 min，于酶標儀上檢測波長490 nm 處吸光度（A）值，以A（490）值代表細胞增殖活性。

1.7 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率取轉(zhuǎn)染后的各組細胞，以1.5×104mL－1的細胞密度接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h 后收集細胞，500 g 離心5 min，棄上清，加入1 mL 預(yù)冷PBS 緩沖液重懸，500 g 離心5 min，棄上清，加入500 μL 1×Binding Buffer 重懸細胞，避光條件下加入 5 μL Annexin Ⅴ-FITC 混勻，再加入10 μL PI 混勻，室溫避光孵育15 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.8 Transwell 小室實驗檢測各組細胞遷移和侵襲率取轉(zhuǎn)染后的各組細胞，無血清培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞濃度至1.0×105mL－1，取100 μL接種于Transwell 上室，下室加入含血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)液，棉簽擦去上層細胞，甲醛固定，加入結(jié)晶紫染色30 min，漂洗干燥，用棉簽小心擦去Transwell 小室中未遷移細胞，置于200 倍顯微鏡下觀察，計數(shù)每個視野中遷移細胞數(shù)。采用基質(zhì)膠包被Transwell 上室，其余操作同遷移實驗，計數(shù)侵襲細胞數(shù)，并計算各組細胞遷移和侵襲率。細胞遷移率＝遷移細胞數(shù)/接種細胞數(shù)×100%；細胞侵襲率＝侵襲細胞數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.9 Western blotting 法檢測各組細胞中Bcl-2、Bax 和cleaved Caspase-3 蛋白表達水平收集轉(zhuǎn)染后各組細胞，RIPA 裂解液提取細胞全蛋白。采用BCA 法測定蛋白濃度，取25 μg 蛋白配置上樣體系，沸水浴變性后采用SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，電泳分離后通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5 %脫脂奶粉于室溫條件下封閉2 h，分別加入一抗Bcl-2 （1∶2 000）、Bax （1∶2 000）、cleaved Caspase-3 （1∶1 000）和GAPDH （1∶5 000），于4 ℃孵育過夜。洗膜后，采用HRP 標記的羊抗兔二抗于室溫條件下孵育1 h；洗膜后，采用ECL 發(fā)光試劑盒A 液和B 液等比混勻，在凝膠成像系統(tǒng)中顯影。采用Image J Plus 7.0 分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.10 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CPAX8-AS1 與miR-22-3p 的靶向關(guān)系采用生物信息學(xué)網(wǎng)站Target San 預(yù)測PAX8-AS1 與miR-22-3p 的靶向關(guān)系。將PAX8-AS1 野生型（WT）和突變型（MUT）基因靶點熒光素酶表達載體分別與mimics NC 和miR-22-3p mimics 共轉(zhuǎn)染至SW480 細胞中，轉(zhuǎn)染48 h 后采用酶標儀檢測螢火蟲熒光素酶熒光強度（F）值和海腎熒光素酶熒光強度（R）值，計算各組細胞熒光素酶活性。熒光素酶活性=F 值/R 值。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。CRC 組織及癌旁組織中PAX8-AS1 mRNA 和 miR-22-3p 表達水平，各組細胞增殖活性、細胞凋亡率、細胞遷移率和細胞侵襲率，各組細胞中Bcl-2、Bax 和 cleaved Caspase-3 蛋白表達水平和熒光素酶活性均符合正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CRC 組織和細胞中PAX8-AS1 mRNA 和miR-22-3p 表達水平RT-qPCR 結(jié)果顯示：與癌旁組織比較，CRC 組織中PAX8-AS1 mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.01），miR-22-3p 表達水平明顯降低（P＜0.01）。與NCM460 細胞比較，SW480、SW620、HT-29 和LoVo 細胞中PAX8-AS1 mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01），miR-22-3p 表達水平明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），其中以SW480 細胞中表達水平差異最為明顯。見圖1 和2。

圖1 CRC 患者癌組織和癌旁組織中PAX8-AS1 mRNA 和miR-22-3p 表達水平Fig.1 Expression levels of PAX8-AS1H mRNA and miR-22-3p in cancer tissue and adjacent tissue of CRC patients

圖2 各種細胞中PAX8-AS1 mRNA 和miR-22-3p 表達水平Fig.2 Expression levels of PAX8-AS1 mRNA and miR-22-3p in different kinds of cells

2.2 各組SW480 細胞中PAX8-AS1 mRNA 和miR-22-3p 表達水平與對照組和si-NC 組比較，si-PAX8-AS1 組細胞中PAX8-AS1 mRNA 表達水平明顯降低（P＜0.01），miR-22-3p 表達水平明顯升高（P＜0.01）。與si-NC 組比較，si-PAX8-AS1+ inhibitors NC 組細胞中miR-22-3p 表達水平明顯升高（P＜0.01），si-PAX8-AS1+inhibitors 組細胞中miR-22-3p 表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 各組SW480 細胞中PAX8-AS1 mRNA 和miR-22-3p 表達水平Fig.3 Expression levels of PAX8-AS1 mRNA and miR-22-3p in SW480 cells in various groups

2.3 不同時間點各組SW480 細胞增殖活性

MTT 法檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，si-PAX8-AS1 組、si-PAX8-AS1+inhibitors NC 組和si-PAX8-AS1+inhibitors 組細胞在培養(yǎng)48 和72 h 時細胞增殖活性均明顯降低（P＜0.01）。與si-NC 組比較，si-PAX8-AS1 組和si-PAX8-AS1+ inhibitors NC 組細胞在培養(yǎng)48 和72 h 時細胞增殖活性均明顯降低（P＜0.01），si-PAX8-AS1+inhibitors 組細胞在培養(yǎng)24、48 和72 h 時細胞增殖活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 不同時間點各組SW480 細胞增殖活性Fig.4 Proliferation activities of SW480 cells at different time points in various groups

2.4 各組SW480 細胞凋亡率流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，si-PAX8-AS1 組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）。與si-NC 組比較，si-PAX8-AS1 組和si-PAX8-AS1+ inhibitors NC 組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）。見圖5。

圖5 各組SW480 細胞凋亡率Fig.5 Apoptotic rates of SW480 cells in various groups

2.5 各組細胞遷移率和侵襲率Transwell 實驗結(jié)果顯示：與對照組比較，si-PAX8-AS1 組細胞遷移率和侵襲率明顯降低（P＜0.01）。與si-NC 組比較，si-PAX8-AS1 組和si-PAX8-AS1+ inhibitors NC 組細胞遷移率和侵襲率明顯降低（P＜0.01），si-PAX8-AS1+inhibitors 組細胞遷移率和侵襲率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖6。

圖6 各組細胞侵襲和遷移率Fig.6 Migration and invasion rates of cells in various groups

2.6 各組SW480 細胞中Bcl-2、Bax 和cleaved Caspase-3 蛋白表達水平Western blotting 法檢測結(jié)果顯示：與對照組和si-NC 組比較，si-PAX8-AS1 組SW480 細胞中Bax 和cleaved Caspase-3 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達水平降低（P＜0.05）。見圖7。

圖7 各組SW480 細胞中Bcl-2、Bax 和cleaved Caspase-3 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.7 Electrophoregram (A) and histogram(B) of expressions of Bcl-2, Bax and cleaved Caspase-3 proteins in SW480 cells in various groups

2.7 PAX8-AS1 和miR22-3p 的靶向關(guān)系和各組細胞中熒光素酶活性生物信息學(xué)網(wǎng)站TargetScan 預(yù)測顯示：PAX8-AS1 與miR22-3p 存在靶向結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示：與共轉(zhuǎn)染mimics NC 的細胞比較，共轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimics的PAX8-AS1-WT 細胞中熒光素酶活性明顯降低（P＜0.01），而共轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimics PAX8-AS1- MUT 細胞中熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖8。

圖8 各組細胞中熒光素酶活性Fig.8 Lucriferase activities of cells in various groups

3 討 論

CRC 是全球最常見的癌癥之一，由于其在全球范圍內(nèi)的高發(fā)病率和高死亡率，CRC 已成為全球公共衛(wèi)生問題［9］。尋找CRC 特異性腫瘤標志物和治療靶點對于 CRC 早期檢測和預(yù)后預(yù)測的準確性具有重要意義。

由于高通量基因組測序工具的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)新的 lncRNAs 通常與癌癥有關(guān)，特別是與 CRC 有關(guān)。在生理條件下，lncRNA 調(diào)節(jié)基因表達、表觀遺傳印記或可變剪接，充當原癌基因或腫瘤抑制基因［10］。研究［11］表明：lncRNA 與人類疾病密切相關(guān)。作為癌基因或抑癌基因，lncRNA 表達失調(diào)與癌癥的進展密切相關(guān)，其可以調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、細胞轉(zhuǎn)移、凋亡、遷移和侵襲［12-16］。本研究結(jié)果顯示：PAX8-AS1 在 CRC 組織和細胞中高表達。si-PAX8-AS1 轉(zhuǎn)染的CRC 細胞增殖、遷移和侵襲能力受到抑制，凋亡增加。表明PAX8-AS1 在CRC 中作為癌基因影響腫瘤細胞的惡性生物學(xué)行為。

研究［17-18］表明：miR-22-3p 作為抑癌基因，在CRC 組織中明顯下調(diào)，并在體外抑制 CRC 細胞增殖、集落形成、細胞遷移和侵襲能力，在體內(nèi)抑制 CRC 異種移植腫瘤的生長。本研究結(jié)果顯示：miR-22-3p 在 CRC 組織和細胞中低表達，與PAX8-AS1 基因高表達呈負相關(guān)關(guān)系。通過抑制PAX8-AS1 基因的表達，抑制了CRC 細胞的增殖、遷移和侵襲能力，且促進了miR-22-3p 表達水平。提示PAX8-AS1 與miR-22-3p 可能存在靶向調(diào)控關(guān)系。

研究［19］表明：lncRNA 通過海綿化miRNAs參與內(nèi)源競爭RNA（competing endogenous RNAs，ceRNAs）。lncRNA HULC 過表達通過海綿化miR-372 促進肝癌的發(fā)展和癌細胞侵襲［20］。此外，lncRNA RP4 充當miR-7-5p 的ceRNA 以調(diào)控CRC進展［21］。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PAX8-AS1 可能靶向miR-22-3p。通過熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CPAX8-AS1 與miR-22-3p 之間的直接相互作用。抑制PAX8-AS1 表達能夠促進 miR-22-3p 表達上調(diào)，并進一步抑制CRC 細胞增殖、遷移和侵襲能力，誘導(dǎo)細胞凋亡。

綜上所述，PAX8-AS1 通過海綿化吸附 miR-22-3p 對CRC 細胞增殖、凋亡及侵襲產(chǎn)生影響，調(diào)控CRC 進展。本研究結(jié)果為PAX8-AS1 作為CRC的治療靶點提供了新的理論依據(jù)。