萬朝輝, 曾 良, 李 晶, 雷長城

（1.南華大學衡陽醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院急診科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學衡陽醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院急診科，湖南 衡陽 421900；3.南華大學衡陽醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南 衡陽 421001）

先天性心臟病 （congenital heart disease，CHD）是最常見的出生缺陷之一，在我國每年有十幾萬CHD 患兒出生，其嚴重威脅新生兒健康，給患兒家庭和社會帶來沉重負擔［1-3］。心臟發(fā)育是一個復雜的過程且容易受到干擾，涉及多種信號的精確調(diào)控［4-5］。Notch 信號在哺乳動物心臟發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，參與房室管、主動脈瓣、心室和心臟流出道的發(fā)育，Notch 信號突變與多種類型CHD 有關［6-8］。配對盒因子（paired box，PAX）家族是一個高度保守的轉錄基因家族，普遍存在于多種生物體中［9］。PAX3 作為其中一員，是人體重要的轉錄調(diào)節(jié)因子，對于組織和器官的發(fā)育和分化均具有重要的調(diào)節(jié)作用。PAX3 促進胚胎發(fā)育和神經(jīng)嵴（neural crest，NC）形成，胚胎時期NC 細胞活動與心臟的發(fā)育有密切關聯(lián)，NC 細胞是促進心臟流出道分隔發(fā)育完善的關鍵，提示PAX3 可能是維持心臟正常發(fā)育的重要轉錄因子［10-11］。然而，PAX3 是否通過Notch 信號調(diào)控心臟發(fā)育有待進一步研究。本研究選用P19 細胞，通過體外實驗探討PAX3 對P19 細胞向心肌樣細胞分化的影響，闡明其可能作用機制，為CHD 的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器P19 細胞購自美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。α-MEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Invitrogen 公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和嘌呤霉素和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）購自美國Sigma 公司，反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTqPCR）試劑盒購自日本TaKaRa 公司，Notch1 激動劑Jagged1 肽購自美國Anaspec 公司，PAX3 抗體和Notch1 抗體均購自英國Abcam 公司，Notch 胞內(nèi)結構域（Notch intracellular domain，NICD）抗體、Hes 家族bHLH 轉錄因子1 （Hes family bHLH traspription factor 1，Hes1）抗體和GAPDH 抗體均購自于美國Cell Signaling Technology 公司，標記辣根過氧化物酶二抗購自北京中杉金橋公司，心肌肌鈣蛋白（cardiac troponin，cTn）I 抗體購自深圳重鏈生物科技有限公司，TRIzol 試劑和IgG488 綠色免疫熒光二抗購自上海碧云天生物技術有限公司。超凈工作臺（Hfsafe-1500）購自蘇州凈化設備有限公司，倒置顯微鏡（BM2100）購自南京江南永新光學有限公司，凝膠成像儀（5200）購自上海天能公司，PCR 擴增儀（5331）購自德國艾本德公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和誘導分化P19 細胞加入含10%胎牛血清的α-MEM 完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取生長狀況良好的對數(shù)期細胞用于后續(xù)實驗。將P19 細胞向心肌樣細胞誘導分化，取P19 細胞以1×106mL－1密度接種于含10%胎牛血清的α-MEM 完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，加入1% DMSO 進行誘導，記作第0 天。第2 天進行半量換液，并于第4 天取30～40 個胚胎樣小體接種至含10% 胎牛血清的α-MEM 完全培養(yǎng)基（無DMSO）的6 孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，隨后每隔2 d進行全量換液，收集誘導第0 天和第10 天的細胞作為0 d 組和10 d 組。

1.3 慢病毒感染和分組取P19 細胞，以每孔2.5×105個細胞密度接種至6 孔細胞培養(yǎng)板中，將細胞分為對照組、sh-NC 組（陰性對照）和sh-PAX3 組（PAX3 干擾）。待細胞密度達到60%時，按照病毒感染比例50∶1 （病毒滴度為1.5×107mL－1）感染細胞5～6 h 后，換液繼續(xù)培養(yǎng)。48 h 后，加入終濃度為0.5 mg·L－1嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達細胞株。采用RT-qPCR 法和Western blotting 法檢測慢病毒感染后P19 細胞中PAX3 mRNA 和蛋白表達水平以檢測PAX3 基因沉默的P19 細胞構建情況。sh-PAX3 及其陰性對照sh-NC慢病毒載體構建、擴增和包裝及慢病毒濃縮、純化和滴度測定均由和元生物技術（上海）股份有限公司完成。在P19 細胞向心肌樣細胞誘導分化過程中每次換液為含1 mg·L－1Jagged1 的完全培養(yǎng)基，進行Jagged1 處理。觀察誘導過程中細胞形態(tài)表現(xiàn)。采用Notch 信號激動劑Jagged1 處理慢病毒感染后的P19 細胞，并用DMSO 誘導分化10 d，將細胞分為DMSO 組、DMSO+sh-NC組、DMSO+sh-PAX3 組、DMSO+Jagged1 組和DMSO+sh-PAX3+Jagged1 組。

1.4 RT-qPCR 法檢測各組細胞中GATA 結合蛋白4（GATA binding protein 4，GATA4）、心房利鈉尿多肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、cTnT、PAX3、Notch1、NICD 和Hes1 mRNA 表達水平采用TRIzol 試劑提取P19 細胞總RNA，分光光度計對RNA 進行定量，采用反轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA，依照RT-qPCR 試劑盒說明書操作，采用RT-qPCR 法檢測mRNA 表達水平。引物序列：GATA4 上游引物5′-ACGGAAGCCCAAGAACCTG-3′，GATA4 下游引物5′-GCTGCTGTGCCCATAGTGAG-3′；ANP 上游引物5′-GCTTCCAGGCCATATTGGAG-3′，ANP 下游引物5′-GGGGGCATGACCTCATCTT-3′；cTnT 上游引物5′-GAAGGAAAGGCAGAACCG-3′，cTnT下 游 引 物 5′-ACCCTCCAAAGTGCATCA-3′；PAX3 上游引物5′-CAGCCCACGTCTATTCCACA-3′，PAX3 下游引物5′-CACGAAGCTGTCGGTGTAGC-3′；Notch1 上游引物5′-TGAATGGCGGGAAGTGTGAAG-3′，Notch1 下 游 引 物5′-GGTTGGGGTCCTGGCATCG-3′；NICD 上游引物5′-ACCAATACAACCCTCTGCGG-3′，NICD 下游引物 5′-GGCCCTGGTAGCTCATCATC-3′；Hes1 上游引物5′-GCACAGAAAGTCATCAAAGCC-3′，Hes1 下游引物5′-TTGATCTGGGTCATGCAGTTG-3′；GAPDH 上游引物5′-ACTAGGCGCTCACTGTTCTC-3′，GAPDH下游引物5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTC-3′。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃、15 s、60 ℃、1 min，共40 個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計算目的基因表達水平。

1.5 Western blotting 法檢測各組細胞中PAX3、Notch1、NICD 和Hes1 蛋白表達水平RIPA 裂解緩沖液裂解各組細胞，提取總蛋白，并采用BCA法對蛋白進行定量。各組取30 μg 蛋白進行SDSPAGE 電泳分離并轉至PVDF 膜。5% 脫脂奶粉封閉2 h，加一抗PAX3（1∶200）、Notch1（1∶500）、NICD （1∶1 000）、Hes1 （1∶500）和GAPDH（1∶1 000），4 ℃輕搖過夜。加入二抗室溫孵育1 h，采用化學發(fā)光法檢測目的蛋白條帶。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.6 免疫熒光染色法檢測各組細胞中cTnI 陽性表達情況和心肌樣細胞分化率P19 細胞誘導分化第9 天，將細胞以每孔2.5×105mL－1的密度接種至放有蓋玻片的6 孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)基，PBS 緩沖液輕洗蓋玻片上的細胞，4% 多聚甲醛室溫固定15 min，加入0.4% Triton X-100透化20 min，采用5% 山羊血清封閉30 min；加cTnI 單克隆抗體（1∶50），4 ℃孵育過夜；加IgG488 熒光二抗（1∶500），室溫避光孵育30 min；加入DAPI 復染細胞核，滴加防猝滅劑封片。將封好的玻片置于熒光顯微鏡下觀察拍照，每組隨機選擇5 個視野，對cTnI 陽性細胞進行計數(shù)，計算各組心肌樣細胞分化率。心肌樣細胞分化率=cTnI 陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.7 統(tǒng)計學分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。0 d 組和10 d 組細胞中GATA4、ANP 和cTnT mRNA 表達水平及PAX3、Notch1、NICD 和Hes1 mRNA 和蛋白表達水平，各組細胞中PAX3 mRNA 和蛋白表達水平，GATA4、ANP和cTnT mRNA 表達水平，Notch1、NICD 和Hes1蛋白表達水平，心肌樣細胞分化率均符合正態(tài)分布且方差齊，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 P19 細胞向心肌樣細胞誘導分化后形態(tài)表現(xiàn)

P19 細胞在復蘇貼壁后，經(jīng)1% DMSO 誘導分化，第3 天可以觀察到胚胎樣小體，第7 天胚胎樣小體生長暈中細胞迅速生長，第10 天胚胎樣小體生長暈中細胞連成一片，并可以觀察到自發(fā)性節(jié)律收縮的心肌樣細胞簇。見圖1。

圖1 P19 細胞向心肌樣細胞誘導分化后形態(tài)表現(xiàn)（×200）Fig.1 Morphology of P19 cells after induction and differentiation into cardiomyocyte-like cells（×200）

2.2 慢病毒感染后P19 細胞中PAX3 mRNA 和蛋白表達水平RT-qPCR 和Western blotting 法檢測結果顯示：慢病毒感染后，與對照組和sh-NC 組比較，sh-PAX3 組P19 細胞中PAX3 mRNA 和蛋白表達水平均降低（P＜0.05），表明PAX3 基因沉默的P19 細胞構建成功。見圖2 和3。

圖2 慢病毒感染后P19 細胞中PAX3 mRNA 表達水平Fig.2 Expression levels of PAX3 mRNA in P19 cells after infected with lentivirus

圖3 慢病毒感染后P19 細胞中PAX3 蛋白表達電泳圖（A)和直條圖（B)Fig.3 Elelctrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of PAX3 protein in P19 cells after infected with lentivirus

2.3 各組細胞中GATA4、ANP、cTnT、PAX3、Notch1、NICD 和Hes1 mRNA 表達水平RTqPCR 法檢測結果顯示：DMSO 誘導P19 細胞向心肌樣細胞分化，與0 d 組比較，10 d 組細胞中GATA4、ANP 和cTnT mRNA 表達水平均升高（P＜0.05），表明成功誘導P19 細胞向心肌樣細胞分化。與0 d 組比較，10 d 組細胞中PAX3、Notch1、NICD 和Hes1 mRNA 表達水平均升高（P＜0.05）。見圖4。

圖4 誘導分化過程中細胞中目的基因mRNA 表達水平Fig.4 Expression levels of target gene mRNA in cells during process of induction and differentiation

慢病毒感染后，與DMSO 組和DMSO+sh-NC 組比較，DMSO+sh-PAX3 組細胞中GATA4、ANP 和cTnT mRNA 表達水平均降低（P＜0.05）。與DMSO 組和DMSO+sh-NC 組比較，DMSO+Jagged1 組細胞中GATA4、ANP 和cTnT mRNA表達水平均升高（P＜0.05）。與DMSO+sh-PAX3組比較，DMSO+sh-PAX3+Jagged1 組細胞中GATA4、ANP 和cTnT mRNA 表達水平均升高（P＜0.05）。見圖5。

圖5 慢病毒感染后各組細胞中GATA4、cTnT 和ANP mRNA 表達水平Fig.5 Expression levels of GATA4, cTnT, and ANP mRNA in cells in various groups after infected with lentivirus

2.4 各組細胞中PAX3、Notch1、NICD 和Hes1 蛋白表達水平Western blotting 法檢測結果顯示：DMSO 誘導P19 細胞向心肌樣細胞分化，與0 d 組比較，10 d 組細胞中PAX3、Notch1、NICD 和Hes1 蛋白表達水平均升高（P＜0.05）。見圖6。

圖6 Western blotting 法檢測2 組細胞中PAX3、Notch1、NICD 和Hes1 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.6 Electrophoregram (A) and histogram(B) of expressions of PAX3,Notch1,NICD,and Hes1 proteins in cells in two groups detected by Western blotting method

慢病毒感染后，與DMSO 組 和 DMSO+sh-NC 組比較，DMSO+sh-PAX3 組細胞中Notch1、NICD 和Hes1 蛋白表達水平均降低（P＜0.05），而DMSO+Jagged1 組細胞中Notch1、NICD 和Hes1 蛋白表達水平均升高（P＜0.05）。與DMSO+sh-PAX3 組比較，DMSO+sh-PAX3+Jagged1 組細胞中Notch1、NICD 和Hes1 蛋白表達水平均升高（P＜0.05）。見圖7。

圖7 慢病毒感染后各組細胞中Notch1、NICD 和Hes1 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.7 Electrophoregram (A) and histogram(B) of expressions of Notch1,NICD,and Hes1 proteins in cells in various groups after infected with lentivirus

2.5 各組細胞中cTnI 蛋白陽性表達和心肌樣細胞分化率免疫熒光法檢測結果顯示：慢病毒感染后，各組細胞中均有cTnI 蛋白陽性表達，與DMSO 組（65.02%±5.66%）和DMSO+sh-NC組（62.73%±3.15%）比較，DMSO+sh-PAX3組細胞中cTnI 蛋白陽性表達減少，心肌樣細胞分化率（14.18%±7.03%）降低（P＜0.05）。與DMSO 組和DMSO+sh-NC 組比較，DMSO+Jagged1 組細胞中cTnI 蛋白陽性表達增加，心肌樣細胞分化率 （88.38%±5.15%）升高 （P＜0.05）。與DMSO+sh-PAX3 組比較，DMSO+sh-PAX3+ Jagged1 組細胞中cTnI 蛋白陽性表達增加，心肌樣細胞分化率（41.88%±6.07%）升高（P＜0.05）。見圖8 和9。

圖8 慢病毒感染后各組心肌樣細胞中cTnI 蛋白表達（×200）Fig.8 Expressions of cTnI protein in cardiomyocytes in various groups after infected with lentivirus(×200)

圖9 慢病毒感染后各組心肌樣細胞分化率Fig.9 Differentiation rates of cardiomyocyte-like cells in various groups after infected with lentivirus

3 討 論

PAX 家族是一個高度保守的轉錄基因家族，普遍存在于多種生物體中，其中成員PAX3 是人體重要的轉錄調(diào)節(jié)因子，其基因位于人類2 號染色體長臂上，對于組織和器官的發(fā)育及分化均具有重要的調(diào)節(jié)作用［10］。NC 細胞是一種多能胚胎細胞群，在神經(jīng)板邊緣形成，隨后在整個胚胎中遷移，可分化為多種細胞類型，包括周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞、顱面軟骨細胞、平滑肌細胞和色素細胞等［12-13］。NC 可軸向分為顱NC 和軀干NC，其中只有前顱NC 可以分化成軟骨、骨骼、結締組織和平滑肌。心臟NC（cardiac NC，CNC）細胞是NC 的亞群之一，其遷移并有助于咽弓動脈的重塑和心臟流出道的分隔［12］。PAX3 可以促進NC 細胞遷移，并且其功能喪失會導致NC 細胞增殖、存活及分化的缺陷，使CNC 逐漸消失，進而導致主肺動脈間隔形成缺陷及主動脈和肺動脈的結構異常［10，14］。研究［15］顯示：PAX3 基因的甲基化水平與CHD 密切相關，提示PAX3 可能是維持心臟正常發(fā)育的重要轉錄因子。P19 細胞系可分化為內(nèi)胚層表型、中胚層表型和神經(jīng)元表型，在低濃度DMSO 處理下，聚集并被誘導分化為心肌樣細胞，被廣泛用作體外心肌樣細胞分化的心肌樣細胞模型［4］。本研究結果顯示：在分化過程中PAX3 基因mRNA 和蛋白表達水平均升高。通過DMSO 誘導分化sh-PAX3 慢病毒感染的P19 細胞，發(fā)現(xiàn)下調(diào)PAX3 基因表達可抑制P19 細胞向心肌樣細胞分化。

Notch 信號通路在哺乳動物心臟發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，其參與房室管、主動脈瓣、心室和流出道的發(fā)育，并且可以促進心肌再生，避免心肌缺血，誘導血管生成，抑制心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，具有心臟保護作用，而且異常的Notch 信號與多種類型的CHD 有關［6，16-17］。研究［18］顯示：在小鼠模型中，miR-34a 通過調(diào)節(jié)Notch 信號通路下調(diào)Notch1，從而增加CHD 的風險。本研究結果顯示：P19 細胞向心肌樣細胞誘導分化過程中Notch 信號通路關鍵基因Notch1、NICD 和Hes1 mRNA 表達水平均升高，而PAX3 基因 mRNA 表達水平降低后，P19 細胞向心肌樣細胞誘導分化被抑制，同時細胞中Notch1、NICD 和Hes1 等蛋白表達水平均降低。研究［19］報道：miR-25-3p 下調(diào)ADAM10 表達阻斷Notch 信號通路可以抑制P19 細胞向心肌樣細胞分化。研究［20］顯示：PAX3 在骨骼肌原性譜系中可激活Notch 信號通路。本研究結果顯示：Jagged1 處理細胞可以顯著逆轉由于下調(diào)PAX3 基因表達對P19 細胞向心肌樣細胞分化的抑制作用，同時上調(diào)Notch 信號通路相關蛋白Notch1、NICD 和Hes1 蛋白的表達。提示PAX3 基因沉默可能通過抑制Notch 信號通路影響P19 細胞向心肌樣細胞分化。

綜上所述，PAX3 基因在P19 細胞向心肌樣細胞分化過程中表達上調(diào)，該基因沉默可抑制P19 細胞向心肌樣細胞分化，其機制可能是通過降低PAX3 基因表達抑制Notch 信號通路活化實現(xiàn)的。