張斯琦, 孫美琪, 李澤顥, 劉丹丹, 胡 城, 方 芳, 王國慶

（1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院臨床生化檢驗(yàn)教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院免疫學(xué)技術(shù)教研室，吉林 吉林 132013）

腫瘤細(xì)胞中的能量代謝與正常細(xì)胞不同，其傾向于進(jìn)行活躍的葡萄糖攝取和有氧條件下的糖酵解，即Warburg 效應(yīng)。研究［1］顯示：糖酵解促進(jìn)了腫瘤進(jìn)展和不良預(yù)后。前列腺癌（prostate cancer，PCa）是全球男性發(fā)病率排名第二位的腫瘤，已經(jīng)成為影響全球男性健康的主要原因之一［2］。腫瘤細(xì)胞具有獨(dú)特的葡萄糖代謝特點(diǎn)，在PCa 細(xì)胞移植瘤模型中，藥物聯(lián)合靶向Warburg 效應(yīng)和自噬導(dǎo)致腫瘤消退［3］。CD147 是免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，在多種癌細(xì)胞中高表達(dá)［4］。PCa 發(fā)展與CD147 表達(dá)密切相關(guān)［5］。研究［6］表明：在胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞中，低表達(dá)CD147 可降低丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）蛋白表達(dá)水平進(jìn)而抑制糖酵解作用。在肝星狀細(xì)胞中，低表達(dá)的CD147 抑制糖酵解相關(guān)蛋白乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）活性和己糖激酶（hexokinase，HK）2 及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（glucose transporter 1，Glut1）的表達(dá)［7］。CD147 可通過多種方式調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的糖酵解作用。但CD147 對PCa 細(xì)胞糖酵解的作用及其機(jī)制尚未完全闡明。因此，本研究通過構(gòu)建低表達(dá)CD147 的PCa 細(xì)胞系LNCaP，分析糖酵解中的產(chǎn)物及催化糖酵解限速酶的活性，探討CD147 對PCa 細(xì)胞糖酵解的影響，為PCa 臨床診斷和治療提供新的分子標(biāo)志物及其靶點(diǎn)。

1 材料及方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器LNCaP/shCD147 細(xì)胞和陰性對照LNCaP/scramble 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存［8］。RPMI-1640、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、胰酶和青-鏈霉素雙抗購自美國Gibco 公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒購自美國Gene Copoeia 公司，PCR 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，β-actin、CD147、PKM2、HK2 和 肌 肉 磷 酸 果 糖 激 酶（phosphofructokinase of muscle，PFKM）抗體購自美國Signalway Antibody 公司，BCA 蛋白濃度檢測試劑盒購自沈陽萬類生物科技有限公司，丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）活性、HK 活性、6-磷酸果糖激酶1（6-phosphofructokinase 1，PFK1）活性檢測試劑盒和總RNA 提取試劑盒購自北京索萊寶公司，腺嘌呤核苷三磷酸 （adenosine triphosphate，ATP）試劑盒購自美國Biovision 公司，乳酸（lactic acid，LA）和丙酮酸（pyruvic acid，PA）試劑盒購自上海酶聯(lián)生物公司。凝膠成像儀購自美國Bio-Rad 公司，多功能熒光酶標(biāo)儀購自德國BMG 公司，掌上離心機(jī)購自美國Scilogex 公司，RT-qPCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組利用慢病毒感染系統(tǒng)建立沉默CD147 的LNCaP/shCD147 細(xì)胞作為LNCaP/shCD147 組，同時(shí)將LNCaP/scramble 細(xì)胞作為陰性對照組（LNCaP/scramble 組），采用含10%FBS和青-鏈霉素雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)基孵育細(xì)胞，并置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液。

1.3 RT-qPCR 法檢測2 組LNCaP 細(xì)胞中CD147 mRNA 表達(dá)水平收集LNCaP/scramble 組和LNCaP/shCD147 組各細(xì)胞樣本，采用TRIzol 法提取各樣本中總RNA，NaNoDroP 2000 儀器檢測總RNA 濃度和純度，取1 μg 總 RNA 采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA 為模板，β-actin 為內(nèi)參，進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)。引物序列：β -actin上游引物5′-CACTGTGCCCATCTACGAGG-3′，β-actin 下游引物5′-TAATGTCACGCACGATTTCC-3′；CD147 上游引物5′-CAGAGTGAAGGCTGTGAAGTCG-3′，CD147 下游引物5′-TGCGAGGAACTCACGAAGAA-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性 15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。采用2－ΔΔCt法計(jì)算目的基因表達(dá)水平。

1.4 2 組LNCaP 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LA 濃度檢測收集LNCaP/scramble 組和LNCaP/shCD147 組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，1 000 g 離心20 min 去除沉淀物，即刻檢測。提前取出LA 試劑盒，平衡至室溫，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。于波長450 nm 處測定各孔吸光度（A）值，以A 值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算各樣本濃度，樣本濃度單位為mmol·L－1。

1.5 2 組LNCaP 細(xì)胞中PA 濃度檢測收集LNCaP/scramble 組和LNCaP/shCD147 組細(xì)胞沉淀，PBS緩沖液重懸，超聲裂解后600 g離心10 min。采用PA 試劑盒檢測樣本中PA 濃度，具體方法嚴(yán)格按照試劑盒操作要求進(jìn)行。于波長450 nm 處測定各孔的A 值，以A 值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本濃度值，樣本濃度單位為mg·g－1。

1.6 2 組LNCaP 細(xì)胞中ATP 濃度檢測收集LNCaP/scramble 組和LNCaP/shCD147 組細(xì)胞，將細(xì)胞沉淀迅速勻漿于100 μL 的1×反應(yīng)緩沖液中，16 000 g 離心30 s 去除碎片，將樣本移入新EP管中備用。采用ATP 試劑盒對樣本中ATP 濃度進(jìn)行檢測，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行，并計(jì)算ATP 濃度。ATP 濃度（mmol·L－1）=Sa·Sv－1。Sa 為標(biāo)準(zhǔn)曲線上的ATP 濃度，單位為mmol；Sv 為孔中加入的樣本體積，單位為L。

1.7 2 組LNCaP 細(xì)胞中PK、PFK1 和HK 酶活性

收集LNCaP/scramble組和LNCaP/shCD147 組5×106個(gè)細(xì)胞，加入1 mL 蛋白提取液，冰浴條件下超聲波破碎，4 ℃條件下8 000 g 離心10 min，取上清，置于冰上待測。采用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本蛋白濃度。采用試劑盒檢測2 組LNCaP 細(xì)胞中酶活性，分別按照PK、PFK1 和HK 酶活性測定說明書進(jìn)行，分光光度計(jì)測定各組A 值，計(jì)算PK、PFK1 和HK 酶活性。PK 酶活性（U·mg－1）=2 613×ΔA/樣本蛋白濃度（g·L－1）；PFK1 酶活性（U·mg－1）=450×ΔA/樣本蛋白濃度（g·L－1）；HK 酶活性（U·mg－1）=1 113×ΔA/樣本蛋白濃度（g·L－1）；ΔA=初始A 值－定時(shí)測定A 值。

1.8 Western blotting 法檢測2 組LNCaP 細(xì)胞中CD147、HK2、PFKM 和PKM2 蛋白表達(dá)水平收集LNCaP/scramble 組和LNCaP/shCD147 組細(xì)胞樣本，無菌PBS 緩沖液清洗3 次，RIPA 細(xì)胞裂解液4 ℃裂解10 min，12 000 r·min－1離心10 min，取上清液，對蛋白濃度進(jìn)行定量，加入上樣緩沖液，100 ℃煮沸8 min。10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中每個(gè)泳道加入30 μg 總蛋白電泳分離，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，采用1×TBST 洗膜液洗膜3 次，每次10 min。分別加入β-actin、CD147、PKM2、PFKM 和HK2 抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜；1×TBST 洗膜液洗膜3 次，每次10 min，二抗?jié)舛葹?∶5 000，室溫孵育2 h，1×TBST 洗膜液洗膜3 次，每次10 min；ECL 化學(xué)發(fā)光液顯影，采用Image J 1.8.0 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平＝目的蛋白條帶灰度值/ β-actin 蛋白條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2 組LNCaP 細(xì)胞中CD147 mRNA 和蛋白表達(dá)水平，PA、LA 和ATP 濃度，PK、PFK1和HK 酶活性，HK2、PFKM 和PKM2 蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s 表示，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2 組LNCaP 細(xì)胞中CD147 mRNA 和蛋白表達(dá)水平與LNCaP/scramble 組比較，LNCaP/shCD147 組細(xì)胞中CD147 mRNA 表達(dá)水平明顯降低 （P＜0.01）。與 LNCaP/scramble 組比較，LNCaP/shCD147 組細(xì)胞中CD147 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。見圖1 和2。

圖1 2 組LNCaP 細(xì)胞中CD147 mRNA 表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of CD147 mRNA in LNCaP cells in two groups

圖2 2 組LNCaP 細(xì)胞中CD147 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.2 Electrophoregram (A) and histogram (B) of CD147protein in LNCaP cells in two groups

2.2 2 組LNCaP 細(xì)胞中LA、PA 和ATP 濃度與LNCaP/scramble 組比較，LNCaP/shCD147 組細(xì)胞中LA 濃度明顯降低（P＜0.01），PA 濃度和ATP濃度降低（P＜0.05）。見表1。

表1 2 組LNCaP 細(xì)胞中LA、PA 和ATP 濃度Tab.1 Concentrations of LA, PA, and ATP in LNCaP cells in two groups (n=3，±s）

表1 2 組LNCaP 細(xì)胞中LA、PA 和ATP 濃度Tab.1 Concentrations of LA, PA, and ATP in LNCaP cells in two groups (n=3，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with LNCaP/scramble group.

Group LA[cB/(mmol·L－1)]PA[wB/(mg·g－1)]ATP[cB/(mmol·L－1)]10.34±1.60 5.99±0.82*LNCaP/scramble LNCaP/shCD147 0.91±0.12 0.51±0.07**4.41±0.76 2.82±0.42*

2.3 2 組LNCaP 細(xì)胞中PK、PFK1 和HK 酶活性與LNCaP/scramble 組比較，LNCaP/shCD147 組細(xì)胞中PK 酶活性降低（P＜0.05），PFK1 和HK酶活性明顯降低（P＜0.01）。見表2。

表2 2 組LNCaP 細(xì)胞中PK、PFK1 和HK 酶活性Tab.2 Activities of PK, PFK1, and HK enzymes in LNCaP cells in two groups (n=3，±s）

表2 2 組LNCaP 細(xì)胞中PK、PFK1 和HK 酶活性Tab.2 Activities of PK, PFK1, and HK enzymes in LNCaP cells in two groups (n=3，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with LNCaP/scramble group.

Group LNCaP/scramble LNCaP/shCD147 HK 5.07±0.57 2.23±0.37**PK 4.68±0.52 2.19±0.23*PFK1 10.43±1.24 4.20±0.69**

2.4 2 組LNCaP 細(xì)胞中HK2、PKM2 和PFKM 蛋白表達(dá)水平與 LNCaP/scramble 組 比 較，LNCaP/shCD147 組細(xì)胞中HK2 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），PKM2 和PFKM 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 2 組LNCaP 細(xì)胞中HK2、PKM2 和PFKM 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.3 Electropherogram (A) and histogram (B) expressions of HK2, PKM2, and PFKM proteins in LNCaP cells in two groups

3 討 論

惡性腫瘤不僅存在基因異常，且通常發(fā)生代謝異常，尤其是能量代謝異常［9］。糖酵解是指在無氧或缺氧條件下，細(xì)胞內(nèi)葡萄糖被分解成為PA，不再進(jìn)行三羧酸循環(huán)，而在細(xì)胞質(zhì)中合成LA 的過程。研究［10］表明：糖酵解是為腫瘤細(xì)胞提供能量和維持其生長的重要機(jī)制。隨著生活水平的提高，人口老齡化加快，PCa 發(fā)病率也逐年增加。因此，發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)節(jié)PCa 細(xì)胞中糖酵解過程的分子，對PCa 的治療至關(guān)重要。

研究［11］顯示：低表達(dá)CD147 可以抑制肝癌細(xì)胞的糖酵解水平。本研究結(jié)果表明：通過RNAi 干擾技術(shù)敲低LNCaP 細(xì)胞中CD147 的表達(dá)可以抑制細(xì)胞中糖酵解代謝產(chǎn)物PA、LA 和ATP 濃度，與相關(guān)研究結(jié)論一致［12］。研究［13］發(fā)現(xiàn)：糖酵解水平受其代謝酶的表達(dá)水平、表型差異和活性等調(diào)控，尤其是糖酵解代謝中HK、PFK1 和PK 限速酶，三者在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的糖酵解代謝過程中起重要作用。糖酵解過程中的第1 個(gè)限速酶HK 可催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，包含HK1、HK2、HK3和HK4 共4 種亞型，其中HK2 在正常細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，是腫瘤細(xì)胞Warburg 效應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［14］。第2 個(gè)限速酶PFK1，催化6-磷酸果糖生成1，6-二磷酸果糖，包含PFKM、PFKP 及PFKL 3 種亞型。PFKM 的激活促進(jìn)了肝癌細(xì)胞Warburg 效應(yīng)和細(xì)胞增殖［15］。第3 個(gè)限速酶PK，將磷酸烯醇式PA 轉(zhuǎn)化為PA，具有L、R、M1 和M2 共4 種亞型。在肺癌細(xì)胞中，沉默PKM2 可以抑制肺癌細(xì)胞的葡萄糖攝取和LA 生成率及細(xì)胞增殖能力，表明PKM2 的穩(wěn)定表達(dá)是肺癌細(xì)胞產(chǎn)生Warburg 效應(yīng)和細(xì)胞增殖所必需的［16］。研究［6-7］顯示：CD147 在腫瘤細(xì)胞中可以調(diào)節(jié)糖酵解，但在不同的腫瘤細(xì)胞中調(diào)節(jié)糖酵解的方式不一致。在胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞中，低表達(dá)CD147 降低PKM2 蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而抑制糖酵解作用；在肝星狀細(xì)胞中，低表達(dá)CD147 抑制LDH 活性、HK2 和Glut1蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制糖酵解。本研究結(jié)果顯示：在LNCaP 細(xì)胞中，CD147 主要通過調(diào)節(jié)PK、PFK1和HK 3 種限速酶活性及HK2 蛋白表達(dá)水平，從而調(diào)節(jié)糖酵解作用。

低表達(dá)CD147 對3 種限速酶活性均有抑制作用，但僅調(diào)節(jié)HK2 蛋白的表達(dá)，這可能是由于限速酶的活性是通過限速酶亞型的表達(dá)來維持的，也可能是酶激活翻譯后修飾機(jī)制影響其酶活性［17-18］。綜上所述，本研究探討沉默CD147 對PCa 細(xì)胞糖酵解的作用，為進(jìn)一步豐富CD147 介導(dǎo)糖代謝重編程的機(jī)制網(wǎng)絡(luò)和尋找PCa 治療的潛在靶點(diǎn)提供依據(jù)，提示CD147 具有作為PCa 治療新靶點(diǎn)的潛能。