趙蔭濤, 楊瑩瑩, 張相欽, 鄭 璐, 徐亞威, 楊海波, 劉 源

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科, 河南 鄭州 450052）

心力衰竭是各種原發(fā)性和繼發(fā)性心血管疾病發(fā)展至一定階段的共同表現(xiàn)，不僅嚴(yán)重危害人類健康，并且給患者家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1-2］。隨著我國經(jīng)濟(jì)水平、環(huán)境和醫(yī)療衛(wèi)生健康方面的發(fā)展，人口預(yù)期壽命明顯延長，人口老年化也會伴隨著罹患惡性腫瘤患者數(shù)量顯著增加［3］。部分抗腫瘤藥物具有心臟毒性，導(dǎo)致腫瘤患者承受治療能力下降，嚴(yán)重影響抗腫瘤治療的效果。阿霉素（doxorubicin，DOX）作為一種廣譜高效的蒽醌類抗腫瘤藥物，臨床上廣泛應(yīng)用于多種抗腫瘤治療。但DOX 可引起劑量依賴性的心臟毒性，導(dǎo)致進(jìn)行性和不可逆性心臟損傷及充血性心力衰竭［4］。因此，DOX 的心臟毒性嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。目前普遍認(rèn)為DOX 誘導(dǎo)心臟損傷的機(jī)制是由多因素組成的，其中一個因素為氧化應(yīng)激反應(yīng)［5-6］。

卵泡抑素樣蛋白1（follistatin-like 1，F(xiàn)STL1）也稱為轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）誘導(dǎo)基因蛋白，是一種在心臟代謝疾病中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞外糖蛋白。研究［7-8］發(fā)現(xiàn)：FSTL1 可抑制小鼠心臟缺血性損傷和心肌細(xì)胞凋亡，并且具有降低射血分?jǐn)?shù)以保護(hù)心力衰竭患者心室的有益效應(yīng)。此外，血清中FSTL1 水平升高與腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）釋放密切相關(guān)，BNP 是心肌損傷的重要生物標(biāo)記物［9］。目前尚未證實FSTL1 對DOX 誘導(dǎo)的心臟損傷是否具有治療作用。本研究通過DOX 誘導(dǎo)建立小鼠心肌損傷動物模型和誘導(dǎo)心肌過表達(dá)FSTL1，探討FSTL1 對DOX 相關(guān)心臟毒性的抑制作用，并闡明其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器12 周雄性C57BL/6J 小鼠112 只，體質(zhì)量25～28 g，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，動物使用許可證號：SYXK （滬）2020-0001。小鼠飼養(yǎng)于SPF 級動物房中獨立送回風(fēng)凈化籠具內(nèi)，自由進(jìn)食進(jìn)水，飲用水經(jīng)高壓處理，飼料經(jīng)鈷60 照射滅菌，溫度維持于22 ℃～24 ℃，濕度為50%～60%，12 h 明暗交替。DOX購于無錫輝瑞制藥有限公司，小鼠N 端BNP 前體（N-terminal pro-BNP，NT-proBNP）、肌鈣蛋白T（cardiac troponin-T，cTn-T）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）和 丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒購于美國Sigma公司，小鼠15-F2t-isoprostane 試劑盒購于美國Cell Biolabs 公司，腺相關(guān)病毒 FSTL1 （AAV9-FSTL1）購于美國Vigene Bioscience 公司，TRIzol試劑購于美國Invitrogen 公司，BCA 試劑盒購于美國Thermo Fisher Scientific 公司。動物心臟超聲儀由加拿大Visual Sonics 公司生產(chǎn)，酶標(biāo)儀由芬蘭Thermo 公司生產(chǎn)。本研究的動物實驗方案已由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實驗動物造模和分組采用單次腹腔內(nèi)注射DOX 建立小鼠急性心肌損傷模型，小鼠按DOX 不同劑量（0、5、10、15 和20 mg·kg－1）分為5 組，每組8 只；按不同干預(yù)時間（0、0.5、1.0、2.0 和3.0 d）分為5 組，每組8 只。另取32 只小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、FSTL1 組、DOX 組和DOX+FSTL1 組。FSTL1 組和DOX+FSTL1 組通過小鼠尾靜脈單次注射AAV9-FSTL1，劑量為5×1011個微粒；生理鹽水組和DOX 組單次注射AAV9-β-gal作為陰性對照，劑量為5×1011個微粒［10-11］。AVV9注射4 周后，DOX 組和DOX+FSTL1 組小鼠單次腹腔內(nèi)注射20 mg·kg－1DOX［12］。DOX 干預(yù)3 d 后進(jìn)行血流動力學(xué)分析和心臟超聲檢測，然后腹腔內(nèi)注射苯巴比妥鈉150 mg·kg－1處死小鼠，留取血液和心臟標(biāo)本以待后續(xù)實驗。

1.3 各組小鼠心臟超聲心動圖和血流動力學(xué)指標(biāo)測定1.5%～2.0%異氟烷持續(xù)吸入麻醉小鼠，待小鼠麻醉狀態(tài)穩(wěn)定后，心臟超聲測定心率（heart rate，HR）、左心室舒張末期容積（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）、左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左心室短軸縮短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）。于小鼠第7 和8 肋間暴露左心室，采用壓力容積導(dǎo)管系統(tǒng)評估心功能，采用Labchart 軟件分析各組小鼠左心室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左心室舒張壓（left ventricular diastolic pressure，LVDP）、左心室內(nèi)壓最大上升速率（maximum rise rate of left ventricular pressure，+dP/dtmax）和左心室內(nèi)壓最大下降速率（maximum drop rate of left ventricular pressure，－dP/dtmax）。

1.4 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 測 定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測各組小鼠血清中TNF-α、NT-proBNP 和cTn-T 水平取小鼠血4 mL，于4 ℃、1 500 r·min－1離心10 min，去上清液，分裝凍存于－80 ℃冰箱。采用ELISA 法檢測各組小鼠血清中TNF-α、NT-proBNP 和cTn-T水平。

1.5 氧化應(yīng)激試劑盒檢測各組小鼠心肌組織中SOD 活性和MDA、4-HNE 及15-F2t-isoprostane 水平按照氧化應(yīng)激試劑盒說明書操作，水溶性四唑鹽1（water-soluble tetrazolium-1，WST-1）法檢測各組小鼠心肌組織中SOD 活性，硫代巴比妥酸（thibabituric acid，TBA）法檢測各組小鼠心肌組織中MDA 水平，ELISA 法檢測各組小鼠心肌組織中4-HNE 和15-F2t-isoprostane 水平。

1.6 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測各組小鼠心肌組織中FSTL1 mRNA 表達(dá)水平提取小鼠心肌組織中總RNA，采用Superscript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，RT-qPCR 法檢測各組小鼠心肌組織中FSTL1 mRNA 表達(dá)水平，以GAPDH 為內(nèi)參。FSTL1 上游引物：5′-GCCTATGCCTACTCCGTGAAGT-3′，下游引物：5′-GTGCTCTGTGCCTCTTCTTAGATCT-3′；GAPDH 上游引物：5′ -ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。采用2－△△Ct法計算各組小鼠心肌組織中FSTL1 mRNA表達(dá)水平。

1.7 Western blotting 法檢測各組小鼠心肌組織中核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）和FSTL1 蛋白表達(dá)水平冰凍小鼠心臟標(biāo)本經(jīng)RIPA 裂解液勻漿，離心后獲取各組小鼠心肌組織總蛋白。按照說明書操作提取心肌組織總蛋白，測定蛋白表達(dá)水平。8%SDSPAGE 電泳分離蛋白溶液，將含蛋白質(zhì)的凝膠轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜上，加入特異性待測抗體（一抗），加入標(biāo)記辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRPO）偶聯(lián)的二抗，化學(xué)發(fā)光法顯色，以GAPDH 為內(nèi)參，采用Gene Tools 密度分析軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組小鼠HR、LVEDV、LVEF、LVFS、LVSP、LVDP、+dP/dtmax和－dP/dtmax，血清中TNF-α、NT-proBNP 和cTn-T 水平，心肌組織中SOD 活性和MDA、4-HNE 及15-F2tisoprostane 水平，F(xiàn)STL1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平及Nrf2 蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以ˉx±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠心臟超聲心動圖和血流動力學(xué)參數(shù)與生理鹽水組比較，DOX組和DOX+FSTL1 組小鼠 LVEF 和 LVFS、LVSP、+dP/dtmax和－dP/dtmax降低 （P＜0.05），HR、LVEDV 和LVDP 升高（P＜0.05）。與DOX 組比較，DOX+FSTL1 組小鼠LVEF、+dP/dtmax和－dP/dtmax升高（P＜0.05），LVEDV降低（P＜0.05）。見表1和2。

表1 各組小鼠心臟超聲心動圖參數(shù)Tab.1 Echocardiographic parameters of mice in various groups（n=8，±s）

表1 各組小鼠心臟超聲心動圖參數(shù)Tab.1 Echocardiographic parameters of mice in various groups（n=8，±s）

*P＜0.05 compared with normal saline group；△P＜0.05 compared with DOX group.

Group Normal saline FSTL1 DOX DOX+FSTL1 FP HR (beat·min－1)424±27 438±31 491±45*476±40*52.32 0.021 LVFS (η/%)74.12±8.02 75.95±8.46 49.43±5.13*47.11±4.54*89.63 0.012 LVEDV (V/μL)52.78±5.12 53.29±4.84 68.34±5.05*62.44±4.83*△102.44 0.004 LVEF (η/%)95.73±10.10 94.36±9.84 75.45±9.69*84.37±8.67*△32.85 0.040

表2 各組大鼠心臟血流動力學(xué)參數(shù)Tab.2 Cardiac hemodynamic parameters of mice in various groups（n=8，±s）

表2 各組大鼠心臟血流動力學(xué)參數(shù)Tab.2 Cardiac hemodynamic parameters of mice in various groups（n=8，±s）

*P＜0.05 compared with normal saline group；△P＜0.05 compared with DOX group.

Group Normal saline FSTL1 DOX DOX+FSTL1 FP－dP/dtmax (mmHg·s－1)5 217.45±295.19 5 102.75±295.04 2 982.70±228.14*4 193.57±188.41*△98.74 0.009 LVSP (P/mmHg)122.31±12.85 132.47±12.56 90.89±13.93*94.76±14.36*74.52 0.017 LVDP (P/mmHg)6.07±1.81 5.97±1.50 11.55±2.66*9.79±2.03*65.12 0.029+dP/dtmax (mmHg·s－1)6 400.07±366.45 6 548.54±356.22 4 000.35±292.07*5 178.07±358.12*△118.17＜0.01

2.2 各組小鼠血清中TNF-α、NT-proBNP和cTn-T水平與生理鹽水組比較，DOX 組和DOX+FSTL1 組小鼠血清中TNF-α、NT-proBNP 和cTn-T 水平升高（P＜0.05）。與DOX 組比較，DOX+FSTL1 組小鼠血清中NT-proBNP 和cTn-T水平降低（P＜0.05），TNF-α 水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組小鼠血清中TNF-α、NT-proBNP 和cTn-T 水平Tab.3 Levels of TNF-α，NT-proBNP，and cTn-T in serum of mice in various groups [n=8，±s，ρB/（ng·L－1）］

表3 各組小鼠血清中TNF-α、NT-proBNP 和cTn-T 水平Tab.3 Levels of TNF-α，NT-proBNP，and cTn-T in serum of mice in various groups [n=8，±s，ρB/（ng·L－1）］

*P＜0.05 compared with normal saline group；△P＜0.05 compared with DOX group.

Group Normal saline FSTL1 DOX DOX+FSTL1 FP cTn-T 88.82±9.34 82.29±10.16 301.14±27.64*143.89±18.56*△148.43＜0.01 TNF-α 13.65±3.04 14.05±2.93 64.67±16.92*50.77±13.14*55.22 0.027 NT-proBNP 83.65±11.67 90.50±12.08 256.48±26.76*139.19±20.50*△139.06＜0.01

2.3 各組小鼠心肌組織中 SOD 活性和MDA、4-HNE 及15-F2t-isoprostane 水平與生理鹽水組比較，DOX 組小鼠心肌組織中SOD 活性降低（P＜0.05），MDA、4-HNE 和15-F2t-isoprostane 水平升高（P＜0.05）；DOX+FSTL1 組小鼠心肌組織中15-F2t-isoprostane 水平升高（P＜0.05）。與DOX 組比較，DOX+FSTL1 組小鼠心肌組織中SOD 活性升高（P＜0.05），MDA、4-HNE 和15-F2t-isoprostane 水平降低（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠心肌組織中SOD 活性和MAD、4-HNE 及15-F2t-isoprostane 水平Tab.4 Activities of SOD and levels of MAD, 4-HNE and 15-F2t-isoprostane in myocardium tissue of mice in various groups（n=8，±s）

表4 各組小鼠心肌組織中SOD 活性和MAD、4-HNE 及15-F2t-isoprostane 水平Tab.4 Activities of SOD and levels of MAD, 4-HNE and 15-F2t-isoprostane in myocardium tissue of mice in various groups（n=8，±s）

*P＜0.05 compared with normal saline group；△P＜0.05 compared with DOX group.

Group Normal saline FSTL1 DOX DOX+FSTL1 FP 15-F2t-isoprostane level 1.00±0.12 1.12±0.14 2.19±0.16*1.88±0.11*△34.97 0.034 SOD activity 1.00±0.03 1.23±0.06 0.71±0.02*0.86±0.03△37.12 0.031 MDA level 1.00±0.14 0.98±0.15 3.55±0.53*1.74±0.03△60.22 0.028 4-HNE level 1.00±0.03 1.07±0.03 2.86±0.04*1.28±0.06△75.18 0.016

2.4 各組小鼠心肌組織中FSTL1 mRNA 表達(dá)水平與0 mg·kg－1DOX 組比較，隨著DOX 劑量增加，其他各組小鼠心肌組織中FSTL1 mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與DOX 0 d 組比較，隨著DOX 應(yīng)用時間延長，其他各組小鼠心肌組織中FSTL1 mRNA 表 達(dá) 水 平 降 低（P＜0.05）。見表5 和6。

表5 不同劑量DOX 干預(yù)后各組小鼠心肌組織中FSTL1 mRNA 表達(dá)水平Tab.5 Expression levels of FSTL1 mRNA in myocardium tissue of mice in various groups after intervented with different doses of DOX （n=8，±s）

表5 不同劑量DOX 干預(yù)后各組小鼠心肌組織中FSTL1 mRNA 表達(dá)水平Tab.5 Expression levels of FSTL1 mRNA in myocardium tissue of mice in various groups after intervented with different doses of DOX （n=8，±s）

*P＜0.05 compared with 0 mg·kg－1 DOX group.

Group DOX( mg·kg－1)FSTL1 mRNA 0 5 10 15 20 FP 1.00±0.17 0.78±0.05*0.57±0.11*0.49±0.13*0.38±0.10*64.12 0.028

表6 DOX 干預(yù)不同時間后各組小鼠心肌組織中FSTL1 mRNA 表達(dá)水平Tab.6 Expression levels of FSTL1 mRNA in myocardium tissue of mice in various groups after intervented with DOX for different time（n=8，±s）

表6 DOX 干預(yù)不同時間后各組小鼠心肌組織中FSTL1 mRNA 表達(dá)水平Tab.6 Expression levels of FSTL1 mRNA in myocardium tissue of mice in various groups after intervented with DOX for different time（n=8，±s）

*P＜0.05 compared with DOX 0 d group.

Group DOX intervertion time FSTL1 mRNA 0 d 0.5 d 1.0 d 2.0 d 3.0 d FP 1.00±0.16 0.77±0.08*0.58±0.05*0.51±0.05*0.28±0.01*79.17 0.015

2.5 各組小鼠心肌組織中FSTL1 和Nrf2 蛋白表達(dá)水平與生理鹽水組比較，DOX 組和DOX+FSTL1 組小鼠心肌組織中FSTL1 和Nrf2 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與DOX 組比較，DOX+FSTL1 組小鼠心肌組織中FSTL1 和Nrf2 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見圖1 和表7。

圖1 各組小鼠心肌組織中FSTL1（A）和Nrf2(B)蛋白表達(dá)電泳圖Fig.1 Electrophoregrams of expressions of FSTL1(A) and Nrf2(B) proteins in myocardium tissue of mice in various groups

表7 各組小鼠心肌組織中FSTL1 和Nrf2 蛋白表達(dá)水平Tab.7 Expression levels of FSTL1 and Nrf2 proteins in myocardium tissue of mice in various groups（n=8，±s）

表7 各組小鼠心肌組織中FSTL1 和Nrf2 蛋白表達(dá)水平Tab.7 Expression levels of FSTL1 and Nrf2 proteins in myocardium tissue of mice in various groups（n=8，±s）

*P＜0.05 compared with normal saline group；△P＜0.05 compared with DOX group.

Group Normal saline FSTL1 DOX DOX+FSTL1 FP FSTL1 protein 0.92±0.12 1.12±0.08 0.39±0.04*0.72±0.09*△71.24 0.013 Nrf2 protein 0.81±0.06 0.92±0.15 0.44±0.08*0.77±0.12*△83.16 0.010

3 討 論

DOX 是一種蒽醌類抗腫瘤化療藥物，臨床用于各種實體腫瘤和血液系統(tǒng)腫瘤的治療，但由于心臟毒性作用使其在臨床上的應(yīng)用受到一定的限制［13］。DOX 誘導(dǎo)的心肌病病理特征多與擴(kuò)張型心肌病相似，包括心肌細(xì)胞凋亡、線粒體腫脹、心肌細(xì)胞能量代謝紊亂和活性氧（reactive oxygen species，ROS）聚集［14］。提示從抗氧化應(yīng)激方面干預(yù)可能對改善DOX 心臟毒性有一定效果。本研究結(jié)果顯示：FSTL1 對DOX 引起的小鼠心肌損傷有一定的保護(hù)作用，能夠改善心臟的血流動力學(xué)指標(biāo)，在機(jī)制上可能通過上調(diào)心肌組織中Nrf2 表達(dá)，以達(dá)到抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)從而減輕心肌損傷的有益效應(yīng)。

DOX 引發(fā)心肌病的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，并且對于嚴(yán)重的DOX 誘導(dǎo)的心肌病，心臟移植可能是唯一的治愈方法［14］。因此，尋找一種有效的預(yù)防DOX 誘導(dǎo)心肌損傷的方法顯得尤為重要。既往研究［15-17］發(fā)現(xiàn)：具有ROS 清除作用的部分天然物質(zhì)可以抑制DOX 引起的急性心肌損傷。研究［18］證實：FSTL1 可以抑制壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心臟肥厚，并可以緩解心肌缺血再灌注損傷。本研究結(jié)果顯示：FSTL1 可以降低DOX 誘導(dǎo)的心肌損傷標(biāo)記物和氧化應(yīng)激標(biāo)記物大量釋放，提高小鼠心臟功能，提示FSTL1 可以作為預(yù)防和治療DOX 相關(guān)心肌損傷的潛在藥物。

DOX 導(dǎo)致急性心臟毒性的一個重要病理基礎(chǔ)是急性炎癥反應(yīng)。研究［19］顯示：抑制心肌炎癥反應(yīng)可以減輕DOX 相關(guān)的小鼠心肌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示：FSTL1 無法降低DOX 導(dǎo)致的急性心肌損傷的炎癥反應(yīng)，表明FSTL1 可能不是通過調(diào)節(jié)心肌炎癥反應(yīng)保護(hù)心肌損傷。15-F2t-isoprostane屬于異構(gòu)前列腺素家族成員，被認(rèn)為是反映機(jī)體氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化損傷強(qiáng)度的理想生化指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示：急性心肌損傷模型小鼠心肌組織中15-F2t-isoprostane 水平升高，F(xiàn)STL1 干預(yù)后小鼠心肌組織中15-F2t-isoprostane 水平降低，提示FSTL1可能通過抑制機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，維持氧化和抗氧化平衡以達(dá)到保護(hù)心臟的作用。研究［20-22］顯示：ROS 與DOX 相關(guān)的心肌損傷密切相關(guān)，而過氧化氫酶和金屬硫蛋白可以改善DOX 導(dǎo)致的小鼠心臟毒性，提示氧化損傷在DOX 性心臟毒性發(fā)病機(jī)制中起到重要作用。DOX 代謝產(chǎn)物導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體損傷和4-HNE 生成，其可以修飾線粒體多種活性蛋白［23］。本研究結(jié)果顯示：FSTL1 可以改善被DOX 抑制的SOD 活性，并抑制心肌組織中MDA 和4-HNE 生成，這可能是FSTL1 保護(hù)心肌損傷的原因之一。Nrf2 是一種轉(zhuǎn)錄因子，在保護(hù)組織免受氧化損傷中起重要作用［24］。本研究結(jié)果顯示：FSTL1 能恢復(fù)DOX 導(dǎo)致的心肌組織中Nrf2 低水平表達(dá)，提示FSTL1 可能通過激活Nrf2 信號通路以拮抗DOX 導(dǎo)致的急性心肌損傷。

綜上所述，F(xiàn)STL1 可以通過激活Nrf2 信號通路抑制心肌組織氧化損傷，保護(hù)DOX 引起的急性心臟毒性反應(yīng)并改善心臟功能，為FSTL1 治療DOX 誘導(dǎo)的心臟毒性提供新的研究方向。