李海濤, 李 沁, 蔡 飛, 胡國富, 滕云飛

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院血管外科，湖北 武漢 430000）

動(dòng)脈粥樣硬化是一種常見的原發(fā)性血管疾病，以動(dòng)脈壁增厚和局部炎癥為主要特征。近年來隨著生活水平的提高，在全球范圍內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率和死亡率逐年升高［1］。動(dòng)脈粥樣硬化通常是一種慢性炎癥的過程，研究［2-3］發(fā)現(xiàn)：氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）可刺激炎癥細(xì)胞分泌炎癥因子，同時(shí)促進(jìn)單核細(xì)胞趨化為巨噬細(xì)胞，ox-LDL 被巨噬細(xì)胞吞噬形成泡沫細(xì)胞，在炎癥因子的刺激下平滑肌細(xì)胞遷移并加速動(dòng)脈斑塊產(chǎn)生，且使得斑塊不穩(wěn)定、較易破裂［2-3］。斑塊破裂后會(huì)在血管內(nèi)形成急性血栓，導(dǎo)致心肌梗死和中風(fēng)［4］。巨噬細(xì)胞根據(jù)其激活狀態(tài)主要分為M1 巨噬細(xì)胞和M2 巨噬細(xì)胞，前者主要由輔助型T 細(xì)胞1（helper T cell 1，Th1）細(xì)胞因子如γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）等誘導(dǎo)產(chǎn)生，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生；后者則主要由輔助型T細(xì)胞2（helper T cell 2，Th2）細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素4（interleukin-4，IL-4）等誘導(dǎo)產(chǎn)生，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著抗炎、修復(fù)和促進(jìn)血管生成活性物質(zhì)的作用［5］。研究［6］表明：巨噬細(xì)胞具有可塑性，其M1和M2 細(xì)胞表型可以互相轉(zhuǎn)換。因此可以通過調(diào)節(jié)斑塊中巨噬細(xì)胞的表型及相對(duì)比例達(dá)到治療動(dòng)脈粥樣硬化的作用。芹菜素（apigenin，API）是一種黃酮類化合物，具有“植物激素”之稱［7］。ASHRAFIZADEH 等［8］發(fā)現(xiàn)：API 具有抗腫瘤、抗炎癥、降血壓和抗氧化等多種功效。研究［9］表明：API 能夠抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，但其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化中巨噬細(xì)胞表型調(diào)控的相關(guān)機(jī)制尚未完全闡明。本研究通過使用API 作用RAW264.7源性泡沫細(xì)胞模型，探討API 對(duì)其炎癥反應(yīng)和極化的作用，并闡明其可能的機(jī)制，為API 治療動(dòng)脈粥樣硬化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7 購自武漢普諾賽生物公司。DMEM 培養(yǎng)基、1%青-鏈霉素溶液和0.25%胰蛋白酶溶液購自武漢普諾賽生物公司，API 和CCK-8 試劑盒購自美國MCE 公司，胎牛血清購自江蘇依科賽生物公司，ox-LDL 和油紅O 染色液購自北京索萊寶科技有限公司，RIPA 裂解液和BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物公司。白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-4、白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒等酶聯(lián)免疫吸附測 定 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自武漢華美生物科技有限公司，HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗、兔多抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、精 氨 酸 酶 1（arginase-1，Arg-1）、核因子κB （nuclear factor kappa B，NF-κB）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子6（signal transducer and activator of transcription 6，STAT6）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，兔單抗磷酸化NF-κB （phosphorylated NF-κB，p-NFκB）和磷酸化STAT6 （phosphorylated STAT6，p-STAT6）購自美國CST 公司。離心機(jī)購自德國Eppendorf 公司，超低溫冰箱購自青島海爾股份有限公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱購自日本Sanyo 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)將RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1% 青-鏈霉素的DMEM 完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2相對(duì)飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長情況2～3 d 傳代1 次，采用0.25 %胰酶消化，取對(duì)數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8 法檢測RAW264.7 細(xì)胞增殖率取處于對(duì)數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的RAW264.7 細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至1×105mL－1，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL 細(xì)胞懸液，同時(shí)設(shè)空白組，37 ℃培養(yǎng)過夜，在細(xì)胞孔周圍孔內(nèi)加入無菌PBS 緩沖液。將細(xì)胞分為RAW264.7 組（不做任何處理）和RAW264.7+API 組（2、4、8、16 和32 μmol·L－1API），每組3 個(gè)復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，37 ℃培養(yǎng)2 h；酶標(biāo)儀于波長450 nm處測定各孔吸光度（A）值，計(jì)算各組細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組A 值/對(duì)照組A 值×100%。依據(jù)CCK-8 實(shí)驗(yàn)選擇無毒的低濃度（2 μmol·L－1）和高濃度（8 μmol·L－1）的API 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

1.4 油紅O 染色觀察RAW264.7 細(xì)胞中泡沫細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)RAW264.7 細(xì)胞分RAW264.7 組、RAW264.7+ox-LDL 組、RAW264.7+ox-LDL+低劑量API 組和RAW264.7+ox-LDL+高劑量API 組。其中RAW264.7 組為正常RAW264.7 細(xì)胞，作為對(duì)照組；RAW264.7+ox-LDL 組為模型組，采用0.08 g·L－1ox-LDL 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞24 h 建立RAW264.7 源性泡沫細(xì)胞模型［10］；RAW264.7+ox-LDL+ 低 劑 量 API 組 和RAW264.7+ox-LDL+高劑量API 組為API 藥物處理組，分別采用2和8 μmol·L－1API及0.08 g·L－1的ox-LDL 處理細(xì)胞24 h。各組細(xì)胞接種于鋪有蓋玻片的6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，處理24 h 后棄細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 緩沖液清洗細(xì)胞3 次，多聚甲醛固定10 min，油紅O 染色15 min；60%油紅O 異丙醇清洗，即刻PBS 緩沖液清洗3 次，光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)。

1.5 ELISA法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β、IL-4 和IL-10 水平細(xì)胞分組同“1.4”步驟，藥物處理細(xì)胞24 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA 試劑盒檢測M1 巨噬細(xì)胞極化相關(guān)炎癥因子TNF-α 和IL-1β 及M2 巨噬細(xì)胞極化相關(guān)抗炎因子IL-4 和IL-10 水平，單位均為ng·L－1，操作步驟參考試劑盒說明書。

1.6 Western blotting 法檢測各組細(xì)胞中NF-κB p65、p-NF-κB p65、iNOS、STAT6、p-STAT6 和Arg-1 蛋白表達(dá)水平細(xì)胞分組同“1.4”步驟，藥物處理細(xì)胞24 h 后收集細(xì)胞，根據(jù)蛋白提取試劑盒步驟提取細(xì)胞總蛋白。蛋白定量30 μg 進(jìn)行SDSPAGE 電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，采用5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，分別加入GAPDH 一抗（1∶20 000）、NF-κB p65 一抗（1∶2 000）、p-NF-κB p65 （1∶500）、iNOS （1∶1 000）、STAT6 （1：1 000）、p-STAT6（1∶500）和Arg-1（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST 清洗3 次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000），室溫下孵育2 h，加入ECL 化學(xué)發(fā)光顯影后掃描膠片，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組RAW264.7 細(xì)胞增殖率，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β、IL-4 和IL-10 水平，細(xì)胞中NF-κB p65、p-NF-κB p65、iNOS、STAT6、p-STAT6 和Arg-1 蛋白表達(dá)水平均呈正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組RAW264.7 細(xì)胞增殖率CCK-8 檢測結(jié)果顯示：與RAW264.7 組比較，RAW264.7+API組2、4 和8 μmol·L－1API 細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），RAW264.7+API 組（16 和32 μmol·L－1API）細(xì)胞增殖率降低（P＜0.05）。依據(jù)CCK-8 法檢測結(jié)果選擇無毒的低濃度2 μmol·L－1和高濃度8 μmol·L－1作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的API 濃度。見圖1。

圖1 CCK-8 法檢測各組RAW264.7 細(xì)胞增殖率Fig.1 Proliferation rates of RAW264.7 cells in various groups detected by CCK-8 method

2.2 各組RAW264.7 細(xì)胞中泡沫細(xì)胞形成情況油紅O 染色結(jié)果顯示：RAW264.7 組極少數(shù)的RAW264.7 細(xì)胞被油紅O 染色；RAW264.7+ox-LDL 組較多的細(xì)胞被染成暗紅色，胞內(nèi)脂質(zhì)明顯增加，表明成功建立了RAW264.7 源性泡沫細(xì)胞；RAW264.7+ox-LDL+ 低劑量 API 組和RAW264.7+ox-LDL+高劑量API 組少量細(xì)胞被油紅O 染色，且其染色程度與劑量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。見圖2。

圖2 油紅O 染色觀察各組RAW264.7 細(xì)胞中泡沫細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)（×400）Fig.2 Morphology of foam cells in RAW264.7 cells in various groups detected by Oil red O staining（×400）

2.3 各組RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β、IL-4 和IL-10 水平ELISA 檢測結(jié)果顯示：與RAW264.7 組比較，RAW264.7+ox-LDL 組和RAW264.7+ox-LDL 低劑量及高劑量API 組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α 和IL-1β 水平均升高（P＜0.05），IL-4 和IL-10 水平均降低（P＜0.05）。與RAW264.7+ox-LDL 組 比 較，RAW264.7+ox-LDL+低劑量和高劑量API 組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α 和IL-1β 水平均降低（P＜0.05），IL-4 和IL-10 水平均升高（P＜0.05）。與RAW264.7+ox-LDL+ 低劑量API 組比較，RAW264.7+ox-LDL+高劑量API 組細(xì)胞中TNF-α 和IL-1β 水平均降低（P＜0.05），IL-4 和IL-10 水平均升高（P＜0.05）。見圖3。

圖3 ELISA 法檢測各組RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α（A）、IL-1β(B)、IL-4(C)和IL-10(D)水平Fig.3 Levels of TNF-α(A), IL-1β(B), IL-4(C)，and IL-10(D) in culture supernatant of RAW264.7 cells in various groups detected by ELISA method

2.4 各組RAW264.7 細(xì)胞中Arg-1 和iNOS 蛋白表達(dá)水平Western blotting 法檢測結(jié)果顯示：與RAW264.7 組比較，RAW264.7+ox-LDL 組、RAW264.7+ox-LDL+ 低 劑 量 API 組 和RAW264.7+ox-LDL+高劑量API 組細(xì)胞中Arg-1蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），iNOS 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與RAW264.7+ox-LDL 組比較，RAW264.7+ox-LDL+ 低劑量 API 組和RAW264.7+ox-LDL+高劑量API 組細(xì)胞中Arg-1蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.05），iNOS 蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05）。與RAW264.7+ox-LDL+低劑量API 組比較，RAW264.7+ox-LDL+高劑量API 組細(xì)胞中Arg-1 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），iNOS 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 Western blotting 法檢測各組RAW264.7 細(xì)胞中Arg-1 和iNOS 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B，C）Fig.4 Electrophoregram(A) and histograms(B, C) of expressions of Arg-1 and iNOS proteins in RAW264.7 cells in various groups detected by Western blotting method

2.5 各組RAW264.7 細(xì)胞中NF-κB p65、p-NF-κB p65、STAT6 和p-STAT6 蛋白表達(dá)水平Western blotting 法檢測結(jié)果顯示：與RAW264.7 組比較，RAW264.7+ox-LDL 組、RAW264.7+ox-LDL+低劑量API 組和RAW264.7+ox-LDL+高劑量API 組細(xì)胞中p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），p-STAT6 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與 RAW264.7+ox-LDL 組 比 較，RAW264.7+ox-LDL+ 低 劑 量 API 組 和RAW264.7+ox-LDL+高劑量API 組細(xì)胞中p-NFκB p65 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），p-STAT6蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與RAW264.7+ox-LDL+低劑量API 組比較，RAW264.7+ox-LDL+高劑量API 組細(xì)胞中p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），p-STAT6 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。各組細(xì)胞中NF-κB p65 和STAT6蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 Western blotting 法檢測各組RAW264.7 細(xì)胞中NF-κB p65、p-NF-κB p65、STAT6 和p-STAT6 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B-E）Fig.5 Electrophoregram(A) and histograms(B-E) of expressions of NF-κB p65, p-NF-κB p65,STAT6, and p-STAT6 proteins in RAW264.7 cells in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展與動(dòng)脈內(nèi)膜泡沫細(xì)胞形成有密切關(guān)聯(lián)。研究［11］證實(shí)：動(dòng)脈內(nèi)膜出現(xiàn)泡沫細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化的早期表現(xiàn)之一，而單核細(xì)胞分化而來的巨噬細(xì)胞是泡沫細(xì)胞的重要來源。泡沫細(xì)胞的主要特征是細(xì)胞中含有多種類型的脂質(zhì)，當(dāng)出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化后體內(nèi)膽固醇攝取和排出間的平衡被破壞，從而誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞大量生成［12］。本研究通過油紅O 染色觀察發(fā)現(xiàn)：RAW264.7+ox-LDL 組泡沫細(xì)胞形成增多，采用API 作用后泡沫細(xì)胞形成減少；表明API 可以有效調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化泡沫細(xì)胞形成，這可能是其可有效治療動(dòng)脈粥樣硬化的具體機(jī)制之一。CLAYTON 等［13］研究發(fā)現(xiàn)：API 可以防止泡沫細(xì)胞形成從而改善動(dòng)脈粥樣硬化。

動(dòng)脈粥樣硬化是以局部炎癥為特征的原發(fā)性血管疾病，而巨噬細(xì)胞與炎癥有密切關(guān)聯(lián)［14］。巨噬細(xì)胞具有M1 和M2 兩種分化表型，其中M1 巨噬細(xì)胞具有促炎作用，并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖產(chǎn)生iNOS和內(nèi)皮素等血管活性分子，加速不穩(wěn)定斑塊的破裂，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展［15-16］。研究［17］顯示：M1 巨噬細(xì)胞分泌代表性炎癥因子主要包括TNF-α、IL-1β 和iNOS 等。TNF-α 可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，使中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞表面分泌炎癥因子［18］。iNOS 主要存在于不穩(wěn)定型斑塊中，其水平升高易導(dǎo)致斑塊破裂，加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展［19］。M2 巨噬細(xì)胞具有抗炎作用，多出現(xiàn)在穩(wěn)定的斑塊中，同時(shí)可分泌IL-10 和IL-4等抗炎因子，抑制炎癥反應(yīng)，同時(shí)具有吞噬組織碎片和清除凋亡小體的作用，進(jìn)一步減輕炎癥反應(yīng)，緩解動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展［20］。研究［21］顯示：M2極化代表抗炎因子主要包括IL-4、IL-10 和Arg-1等，當(dāng)巨噬細(xì)胞分化為M2 巨噬細(xì)胞，抗炎因子可以抑制炎癥因子造成的損傷，緩解動(dòng)脈粥樣硬化［21］。本研究結(jié)果顯示：RAW264.7+ox-LDL 組細(xì)胞M1 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS 和炎癥因子TNF-α及IL-1β 水平升高，M2 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物Arg-1 和抗炎因子IL-4 及IL-10 水平降低，API 作用后細(xì)胞中iNOS、TNF-α 和IL-1β 水平降低，Arg-1、IL-4 和IL-10 水平升高；表明API 可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的表型，能促進(jìn)炎癥相關(guān)的M1 巨噬細(xì)胞減少，抗炎相關(guān)的M2 巨噬細(xì)胞增加，從而改善RAW264.7 的炎癥反應(yīng)。NF-κB 信號(hào)通路和STAT6 信號(hào)通路是常見的炎癥調(diào)控信號(hào)通路，其作用機(jī)制與調(diào)控巨噬細(xì)胞M1/M2 極化轉(zhuǎn)變密切相關(guān)。研究［22-23］顯示：巨噬細(xì)胞中NF-κB 通路激活后，p-NF-κB 蛋白表達(dá)水平升高進(jìn)而激活下游炎癥相關(guān)靶基因表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分化為M1巨噬細(xì)胞；巨噬細(xì)胞中STAT6 通路激活后，p-STAT6 蛋白表達(dá)水平升高，活化的p-STAT6 蛋白進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控下游應(yīng)答基因的表達(dá)，促使巨噬細(xì)胞分化為M2 巨噬細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示：RAW264.7+ox-LDL組細(xì)胞中p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平升高，p-STAT6 蛋白表達(dá)水平降低，表明NF-κB 通路被激活，STAT6 通路被抑制。API 作用后p-NF-κ B p65 蛋白表達(dá)水平降低，p-STAT6 蛋白表達(dá)水平升高，表明API 調(diào)控M1 和M2 巨噬細(xì)胞表型可能與NF-κB 及STAT6 通路有密切關(guān)聯(lián)。

綜上所述，API 可降低RAW264.7 源性泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平，抑制泡沫細(xì)胞的形成及調(diào)控巨噬細(xì)胞向M2 極化改善炎癥反應(yīng)，其調(diào)控巨噬細(xì)胞極化轉(zhuǎn)變的機(jī)制可能與NF-κB 及STAT6 通路有關(guān)。