李艷梅，王 超，張 寧，瞿文豪，賈立周*

1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；2巴彥淖爾市醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000；3右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000

結(jié)腸癌是全球腫瘤相關(guān)死亡的第三大原因，也是我國最常見的惡性腫瘤之一［1］。非轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌一經(jīng)診斷，約80%的患者可以手術(shù)切除，但30%～50%的預(yù)后不良患者出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)［2］。因此，對于高危Ⅱ期或Ⅲ期結(jié)腸癌患者，手術(shù)切除后需要進(jìn)行輔助化療，以降低復(fù)發(fā)風(fēng)險［3］。

奧沙利鉑是第三代鉑類輔助化療藥物，主要通過抑制DNA 復(fù)制進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［4］。據(jù)報(bào)道，奧沙利鉑可有效改善Ⅲ期結(jié)腸癌患者的預(yù)后［5］。然而，臨床治療中結(jié)腸癌患者會出現(xiàn)原發(fā)性或繼發(fā)性奧沙利鉑耐藥，限制了奧沙利鉑的治療效果。因此，探究奧沙利鉑耐藥相關(guān)靶點(diǎn)及機(jī)制符合臨床治療的迫切需求。

本研究通過生物信息學(xué)方法篩選出結(jié)腸癌細(xì)胞中奧沙利鉑耐藥相關(guān)基因鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體8（zinc transporter 8，ZIP8）。ZIP8，又稱溶質(zhì)載體家族39成員8（solute carrier family 39 member 8，SLC39A8），是一種轉(zhuǎn)運(yùn)二價金屬離子的膜蛋白，屬于鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，其異常表達(dá)與多種人類疾病有關(guān)，如高血壓、骨關(guān)節(jié)炎、哮喘和精神分裂癥等，但對結(jié)腸癌化療耐藥的影響尚不清楚。本研究運(yùn)用體外實(shí)驗(yàn)和臨床標(biāo)本驗(yàn)證ZIP8 對結(jié)腸癌奧沙利鉑耐藥的影響，為結(jié)腸癌患者的預(yù)后和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620、Annexin V-APC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物），siRNA-ZIP8（上海吉瑪制藥），DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/硫酸鏈霉素（Gibco 公司，美國），4×蛋白上樣緩沖液（南京諾唯贊），兔抗人ZIP8 多克隆抗體（Abcam 公司，美國），JetPEI轉(zhuǎn)染試劑（PolyPlus公司，法國）、RIPA試劑、兔抗人GAPDH 單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、Pierce ECL 曝光液（Invitrogen 公司，美國），TRIzol 試劑、BeyoRTⅡcDNA 合成試劑盒、BeyoFast SYBR Green 試劑盒（上海碧云天生物），CCK-8 試劑盒（同仁公司，日本），Histostain SP免疫組化染色試劑盒（上海麥約爾）。

本研究包含2014 年1 月—2016 年12 月在巴彥淖爾市醫(yī)院進(jìn)行治療的結(jié)腸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：組織學(xué)證實(shí)的結(jié)腸癌；局部晚期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，納入研究時判定無法完全切除；無傳染性疾病或心臟病；腎、肝和骨髓功能正常；既往無結(jié)腸手術(shù)、化療、放療史。本研究經(jīng)過內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（YKD202001250），所有患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 耐藥相關(guān)基因篩選

從NCBI-GEO 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）下載微陣列數(shù)據(jù)集GSE42387。該數(shù)據(jù)集包含HCT116、HT29和LoVo及相對應(yīng)奧沙利鉑耐藥細(xì)胞株的mRNA 微陣列信息。本研究通過GEO2R 工具對耐藥細(xì)胞株和未處理細(xì)胞株的數(shù)據(jù)進(jìn)行再分析，篩選出4種細(xì)胞株共同的耐藥基因。采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 和|log2差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）|＞1 為判定標(biāo)準(zhǔn)定義各數(shù)據(jù)集中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異基因。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

常規(guī)復(fù)蘇人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620，使用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2的恒溫生物培養(yǎng)箱，每2～3 d 更換培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合度達(dá)到90%，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代。將處于對數(shù)生長期的SW620 細(xì)胞按5×104個/孔的密度種植于6 孔板，待細(xì)胞生長至50%密度時，按照J(rèn)etPEI試劑盒說明書，將siRNA-陰性對照（negative control，NC）和siRNA-ZIP8 轉(zhuǎn)染至SW620細(xì)胞，分別命名為siNC和siZIP8。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）

依據(jù)TRIzol 試劑說明書，分別提取對數(shù)生長期的siNC 組和siZIP8 組細(xì)胞總RNA，根據(jù)BeyoRTⅡcDNA合成試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)BeyoFast SYBR Green 試劑盒說明書于ABI 7500 實(shí)時熒光定量PCR 系統(tǒng)上進(jìn)行樣本擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：qPCR Mix10 μL、ZIP8/GAPDH 上下游引物（3 μmol/L）各1 μL、cDNA 模板2 μL、去離子水6 μL。引物由南京金斯瑞生物有限公司合成，ZIP8：上游5＇-ATGCTACCCAAATAACCAGCTC-3＇，下游5＇-ACAGGAATCCATATCCCCAAACT-3＇；GAPDH：上游5＇-CTGGGCTACACTGAGCACC-3＇，下游5＇-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3＇。每個樣品設(shè)3 個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。反應(yīng)結(jié)束后，以GAPDH為內(nèi)參照基因，計(jì)算各個樣本擴(kuò)增的CT值，基因表達(dá)的相對定量采用2-ΔΔCT法。

1.2.4 Western blot

待siNC 組和siZIP8組細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，使用RIPA 裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白，與蛋白上樣緩沖液按比例混合，95 ℃加熱10 min。將等量蛋白注入ExpressPlus PAGE Gel 預(yù)制膠，200 V 電泳30 min。eBlot L1 快速濕轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%牛血清蛋白常溫孵育2 h，兔抗人ZIP8 多克隆抗體（1∶1 000）或兔抗人GAPDH 單克隆抗體（1∶2 000）4 ℃孵育過夜。次日PBST 漂洗3 次，每次5 min。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶5 000）常溫孵育1 h，PBST漂洗3次，每次5 min。Pierce ECL 曝光液覆蓋PVDF 膜表面，置于Tanon 5200S曝光儀曝光并拍照。Image J測定蛋白條帶灰度值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)

將siNC組和siZIP8組細(xì)胞分別按5×104個/孔的密度種植于96 孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的奧沙利鉑（終濃度分別為0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μg/mL），不同濃度設(shè)3 個復(fù)孔。48 h后去除原培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8 溶液和90 μL DMEM培養(yǎng)基，37 ℃避光孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm 波長處的吸光值。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測

將處于對數(shù)生長期的SW620細(xì)胞按5×104個/孔的密度種植于6 孔板，待細(xì)胞生長至50%密度時加入終濃度為5 μg/mL 的奧沙利鉑，48 h 后消化收集細(xì)胞，500g離心5 min，PBS 緩沖液重懸細(xì)胞，重復(fù)3 次。去上清，根據(jù)Annexin V-APC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書，加入500 μL Binding Buffer 重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-APC 染液混勻，避光室溫孵育5 min，BD FACS AriaⅡSORP 分選型流式細(xì)胞儀檢測。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 免疫組織化學(xué)染色（IHC）分析

所有組織標(biāo)本均采用10%中性緩沖福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm 切片。采用SP 法對結(jié)腸組織樣本進(jìn)行IHC 染色，詳細(xì)步驟參見Histostain SP免疫組化染色試劑盒說明書。

閱片由2 位病理科醫(yī)師雙盲獨(dú)立完成，采用半定量H-score方法對Trop2表達(dá)進(jìn)行評分。采用如下染色強(qiáng)度評分：0分表示陰性；1分為弱陽性；2分為中度陽性；3 分為強(qiáng)陽性。每個強(qiáng)度級別的細(xì)胞總數(shù)乘以相應(yīng)的強(qiáng)度評分，得到強(qiáng)度百分比評分。然后將4 種強(qiáng)度百分比評分相加，計(jì)算最終染色評分。最終染色評分最低為0 分（無染色），最高為300 分（所有細(xì)胞均為強(qiáng)陽性）。使用X-tile 軟件程序確定臨界值，0～130 分認(rèn)為ZIP8 蛋白低表達(dá)，131～300分認(rèn)為ZIP8蛋白高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x ± s）表示，SNK-q檢驗(yàn)比較兩組間差異。滿足PH假設(shè)檢驗(yàn)后，通過Cox比例風(fēng)險回歸模型確定預(yù)后因素。生存曲線繪制采用Kaplan-Meier 法，生存曲線比較采用時序檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥蛋白的篩選

通過比較HCT116、HT29和LoVo耐藥細(xì)胞株與非耐藥株的基因差異，篩選出4 個結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥后 共 同 的 差 異 基 因ZIP8、NUPR1、SLC43A1 和TEME73（圖1A）。使用Ualcan 數(shù)據(jù)庫檢測ZIP8、NUPR1、SLC43A1 和TEME73 基因在結(jié)腸組 織 中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ZIP8 在結(jié)腸癌組織（n=275）中表達(dá)水平顯著高于正常腸組織（n=349）（P＜0.05，圖1B），且僅ZIP8 高表達(dá)的結(jié)腸癌患者預(yù)后較差（P=0.005，圖1C），因此將ZIP8作為進(jìn)一步研究對象。

圖1 耐藥基因的篩選Figure 1 Screening of drug-resistant genes

2.2 干擾SW620細(xì)胞的ZIP8表達(dá)

將siRNA-ZIP8 轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620，通過檢測ZIP8 的表達(dá)情況觀察siRNA-ZIP8 的干擾效率，qPCR 結(jié)果顯示siZIP8 組細(xì)胞的ZIP8 mRNA水平較siNC 組顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2A）。Western blot 結(jié)果顯示，相較于siNC 組細(xì)胞，siZIP8 組細(xì)胞的ZIP8 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05，圖2B）。以上結(jié)果表明，siRNA-ZIP8可以下調(diào)SW620細(xì)胞的ZIP8表達(dá)。

圖2 干擾ZIP8在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)Figure 2 Interference with ZIP8 expression in colon cancer cells

2.3 干擾ZIP8 表達(dá)可增強(qiáng)奧沙利鉑對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制

通過CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測siNC 組和siZIP8 組在奧沙利鉑處理后細(xì)胞增殖情況的變化。如圖3 所示，在相同藥物濃度下，siZIP8 組細(xì)胞增殖抑制率高于siNC 組（P＜0.05，圖3）。經(jīng)計(jì)算得出，奧沙利鉑對siZIP8 組的半數(shù)抑制濃度（IC50）為（1.926±0.103）μg/mL，低于siNC 組［（5.156±0.147）μg/mL］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明，ZIP8 表達(dá)被干擾后，奧沙利鉑對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用得到增強(qiáng)。

圖3 CCK-8檢測奧沙利鉑對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制的影響Figure 3 The effect of oxaliplatin on proliferation inhibition of colon cancer cell was detected by CCK-8 assay

2.4 干擾ZIP8 表達(dá)可促進(jìn)奧沙利鉑治療后結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測siNC 組和siZIP8 組細(xì)胞在奧沙利鉑處理后凋亡情況的變化。未加藥培養(yǎng)時siNC 組和siZIP8 組細(xì)胞的總凋亡率分別為（2.413±0.535）%和（4.213±0.716）%，奧沙利鉑處理后siNC 組和siZIP8 組細(xì)胞的總凋亡率分別為（10.423±1.616）%和（25.374±2.711）%（圖4）。正常情況下siZIP8 組細(xì)胞的總凋亡率略高于siNC 組（P＜0.05），加藥培養(yǎng)后siZIP8組細(xì)胞的總凋亡率顯著高于siNC組（P＜0.05）。結(jié)果表明，ZIP8表達(dá)下調(diào)能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且導(dǎo)致奧沙利鉑誘導(dǎo)的凋亡增加。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測奧沙利鉑對結(jié)腸癌細(xì)胞總凋亡率的影響Figure 4 The effect of oxaliplatin on the total apoptosis rate of colon cancer cells was detected by flow cytometry

2.5 結(jié)腸癌組織中ZIP8 表達(dá)情況與臨床預(yù)后的關(guān)系

本研究入選了142 例結(jié)腸癌患者，中位年齡64（23～78）歲，男107例（75.35%），女35例（24.65%）?；熐盎颊吲R床特征見表1，結(jié)腸癌組織中ZIP8 蛋白的表達(dá)情況見圖5A。本研究中，中位隨訪時間為23.5 個月（3.6～72.4 個月），其中45.07%的患者死亡。61 例患者死于腫瘤進(jìn)展，3 例死于腦梗死?；煹呐R床有效率為75.35%（107 例部分緩解，35 例病情穩(wěn)定）。

表1 化療前患者臨床特征Table 1 Clinical characteristics of patients before chemotherapy

圖5 ZIP8對結(jié)腸癌患者化療預(yù)后的影響Figure 5 Effect of ZIP8 on the prognosis of patients with colon cancer after chemotherapy

分析化療后結(jié)腸癌患者的生存期發(fā)現(xiàn)，ZIP8低表達(dá)的患者有更長的總生存期（OS，log-rankχ2=11.839，P=0.001）和無病生存期（DFS，log-rankχ2=13.404，P＜0.001，圖5B）。在單因素分析中，ZIP8 表達(dá)、AJCC 分期和殘留癌是決定OS 和DFS 的獨(dú)立因素（表2）。多因素分析發(fā)現(xiàn)，ZIP8 表達(dá)高低是化療前預(yù)測OS（HR=3.412，95%CI：1.574～7.869，P=0.002）和DFS（HR=2.676，95%CI：1.362～5.375，P=0.004）的預(yù)后指標(biāo)。

表2 單因素和多因素分析檢測結(jié)腸癌患者的預(yù)后因素Table 2 Univariate and multivariate analyses performed to detect prognostic factors in patients with colon cancer

3 討論

奧沙利鉑是第三代鉑類抗腫瘤藥物，通過與DNA 雙鏈共價結(jié)合形成鏈間交聯(lián)，阻止DNA 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞死亡［6］。奧沙利鉑是結(jié)腸癌臨床化療的一線藥物，大約50%的患者可從奧沙利鉑聯(lián)合化療中受益，但長期大劑量應(yīng)用奧沙利鉑引起的腫瘤耐藥是導(dǎo)致化療效果減弱及喪失的主要原因［7］。同時，奧沙利鉑耐藥與結(jié)腸癌患者根治術(shù)后復(fù)發(fā)率密切相關(guān)［8］。奧沙利鉑耐藥是由多種機(jī)制引起的，包括化療耐藥相關(guān)蛋白的過表達(dá)、DNA-鉑類加成物的形成以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的突變［9］。

本研究通過GEO 數(shù)據(jù)庫對比了結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、HT29和LoVo與各自對應(yīng)耐藥株的基因表達(dá)，分別篩選出213、551和406個差異基因，其中包括4個共同差異基因ZIP8、NUPR1、SLC43A1 和TEME73。在GEPIA 數(shù)據(jù)庫中比較349 例正常結(jié)腸組織和275 例結(jié)腸癌組織的mRNA 信息，發(fā)現(xiàn)ZIP8在結(jié)腸癌組織中顯著高表達(dá)，而NUPR1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著低于正常組織。進(jìn)一步通過Ualcan數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)ZIP8 高表達(dá)的患者預(yù)后較低表達(dá)患者差。以上結(jié)果表明，ZIP8是一個具有研究價值的結(jié)腸癌奧沙利鉑耐藥相關(guān)基因。

ZIP8是一種調(diào)節(jié)二價金屬離子（Zn2+、Fe2+、Co2+、Mn2+和Cd2+）內(nèi)流的多功能膜轉(zhuǎn)運(yùn)體［10］。ZIP8 的異常表達(dá)與多種人類疾病有關(guān)，如血壓升高、骨關(guān)節(jié)炎、哮喘和精神分裂癥［11-14］。ZIP8 也被認(rèn)為對脂質(zhì)多糖、TNF-α和IL-1β等炎癥刺激具有高度的反應(yīng)性［15］。鋅可參與腫瘤的調(diào)節(jié)，而ZIP8在控制鋅濃度方面至關(guān)重要，因此研究人員對ZIP8在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用越來越感興趣［16-17］。研究表明，ZIP8 能通過NF-κB信號通路促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)展，干擾ZIP8 表達(dá)可降低基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤癌細(xì)胞的遷移潛能［18］。此外，ZIP8 還參與了細(xì)胞骨架排列、增殖和遷移的調(diào)控［19］。Geng 等［20］發(fā)現(xiàn)ZIP8 通過調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白Bcl-2 的水平而非順鉑攝取途徑促進(jìn)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的順鉑耐藥。作為多種生物功能必需的轉(zhuǎn)運(yùn)體，ZIP8對腸癌順鉑耐藥的影響有待進(jìn)一步探究。

本文通過轉(zhuǎn)染siRNA-ZIP8 干擾SW620 細(xì)胞中ZIP8的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siZIP8組細(xì)胞中ZIP8 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著降低，表明siRNA-ZIP8成功干擾SW620 細(xì)胞ZIP8 的表達(dá)。CCK-8 實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，奧沙利鉑處理后siNC組細(xì)胞增殖率高于siZIP8 組，奧沙利鉑對siZIP8 組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度降低，siZIP8 組細(xì)胞凋亡率顯著高于siN組，表明ZIP8表達(dá)下調(diào)后奧沙利鉑對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)，奧沙利鉑所致結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡率增高。以上結(jié)果提示干擾ZIP8 表達(dá)可以提高結(jié)腸癌細(xì)胞對奧沙利鉑的敏感性，ZIP8能增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞對奧沙利鉑的耐受性。

隨后本研究通過IHC檢測了142例結(jié)腸癌患者癌組織中ZIP8表達(dá)，并分析了ZIP8水平和患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果證明，ZIP8高表達(dá)患者的無病生存期和總生存期均短于ZIP8 低表達(dá)患者。單因素分析表明，AJCC分期、殘留癌和ZIP8表達(dá)水平與無病生存期和總生存期長短有關(guān)。多因素分析進(jìn)一步證明，ZIP8是結(jié)腸癌患者接受化療后除殘留癌之外的又一預(yù)后指標(biāo)，ZIP8高表達(dá)的結(jié)腸癌患者奧沙利鉑治療效果更差。臨床樣本信息驗(yàn)證了ZIP8 對結(jié)腸癌奧沙利鉑耐藥的促進(jìn)作用。

綜上，本文探究了ZIP8與結(jié)腸癌奧沙利鉑耐藥的關(guān)系，證實(shí)了ZIP8可增強(qiáng)結(jié)腸癌的奧沙利鉑耐藥性。作為預(yù)測結(jié)腸癌化療預(yù)后的潛在指標(biāo)之一，ZIP8有可能成為治療結(jié)腸癌奧沙利鉑耐藥的新靶點(diǎn)。