張?zhí)焘?，蘇 芃，梁景巖，2，顏丙春，2，熊天慶，2*

1揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，江蘇 揚(yáng)州 225001；2江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225001

腦卒中是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致殘疾和死亡的主要原因之一，這給醫(yī)療保健系統(tǒng)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。缺血性卒中是主要的腦卒中亞型，約占腦卒中病例的85%［1］，是由腦部動(dòng)脈血栓阻塞或血管狹窄閉塞造成的腦組織缺血、缺氧引起的腦部疾病。由于腦血流量供應(yīng)不足，導(dǎo)致供血區(qū)組織功能的可逆性受阻，常伴有神經(jīng)元、支持結(jié)構(gòu)損傷及電活動(dòng)喪失，并激發(fā)鈣依賴的興奮性毒性導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，最終造成腦組織壞死、血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）破壞、氧化應(yīng)激等損傷［2］。此外，其引發(fā)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)還將導(dǎo)致神經(jīng)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步促使腦損傷的惡化［3］。目前，臨床治療缺血性卒中的主要方法是靜脈溶栓和血管內(nèi)取栓，以恢復(fù)缺血區(qū)的腦血流，搶救缺血半暗帶中的受損神經(jīng)元［4］。

然而，上述治療具有嚴(yán)格的時(shí)間窗限制，靜脈注射阿替普酶溶栓需要在發(fā)病后4.5 h內(nèi)給藥，血管內(nèi)取栓需要在發(fā)病后24 h內(nèi)進(jìn)行，以降低梗死后出血轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)，因此，不少患者因錯(cuò)過(guò)治療時(shí)間窗導(dǎo)致疾病預(yù)后不佳。缺血性損傷可導(dǎo)致缺血核心區(qū)神經(jīng)元的不可逆損傷或死亡，而缺血周圍半暗帶中的神經(jīng)元可通過(guò)有效的腦保護(hù)治療得到挽救。缺血性卒中的發(fā)展涉及多種機(jī)制，如興奮性毒性、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、炎癥、自噬和BBB 損傷。神經(jīng)元在缺血幾分鐘內(nèi)就可以發(fā)生線粒體功能障礙，進(jìn)而引起三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）耗竭和細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，導(dǎo)致持續(xù)性膜去極化和興奮性遞質(zhì)谷氨酸釋放。細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增加又會(huì)引起活性氧（reactive oxygen species，ROS）的過(guò)量產(chǎn)生，引發(fā)受損神經(jīng)元死亡，并激活炎癥反應(yīng)和導(dǎo)致BBB 通透性增加。這些病理學(xué)改變中可能存在缺血性卒中的潛在治療靶點(diǎn)。

齊墩果酸（oleanolic acid，OA，又名土當(dāng)歸酸）是一種小分子天然產(chǎn)物，已被報(bào)道可通過(guò)抗氧化和抗炎等對(duì)多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)揮保護(hù)作用。它可給予缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)多靶點(diǎn)、多途徑的干預(yù)，是一種潛在的缺血性卒中的治療藥物［5］。本文以O(shè)A 在抗缺血性卒中的作用機(jī)制與靶點(diǎn)為切入點(diǎn)進(jìn)行綜述，為深入研究OA在臨床中的應(yīng)用提供參考。

1 OA來(lái)源、理化特性及藥理作用

OA 是一種具有多種生物活性的五環(huán)三萜類小分子天然產(chǎn)物，以游離體和配糖體形式存在于多種芳香類植物中，具有潛在的藥用價(jià)值。OA 具有較高的疏水性和親油性，往往采用甲醇、乙醇和丙酮等有機(jī)溶劑從植物中進(jìn)行提取，OA 在不同提取方式下表現(xiàn)出形態(tài)各異的晶體樣固體結(jié)構(gòu)，熔點(diǎn)為306～313 ℃，沸點(diǎn)553～554 ℃（標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下）。

OA具備抗炎、抗菌、抗氧化、抗癌和降血糖等多種功能，并被逐步運(yùn)用于多種疾病的治療。OA 可以通過(guò)抑制α-葡萄糖苷酶等關(guān)鍵酶的活性，改善胰島素抵抗，從而降低血糖。OA 可以抑制微生物代謝，破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，從而達(dá)到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的目的，因此對(duì)多種細(xì)菌、寄生蟲(chóng)和真菌都具有抑制作用。OA 可以干擾多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的停滯。OA 還可以通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB、PI3K/Akt 和Wnt/β-Catenin 等多種信號(hào)通路，從而減緩腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［6］。此外，OA 的神經(jīng)保護(hù)作用也有助于治療帕金森等神經(jīng)退行性疾病［7-8］。

2 OA抗缺血性卒中誘導(dǎo)的線粒體損傷和氧化應(yīng)激

缺血缺氧損傷可直接影響神經(jīng)元線粒體ATP合成，線粒體能量代謝障礙又會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙，引起鈣離子內(nèi)流增多，鈣離子內(nèi)流進(jìn)一步刺激線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔道（mPTP）開(kāi)放，加劇線粒體損傷并導(dǎo)致過(guò)量ROS 產(chǎn)生和細(xì)胞質(zhì)鈣離子濃度增高。與此同時(shí)，過(guò)量的ROS 通過(guò)誘導(dǎo)mPTP開(kāi)放和脂質(zhì)過(guò)氧化等加重線粒體損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激損傷關(guān)系密切，二者共同參與了缺血性卒中神經(jīng)元死亡的病理過(guò)程［9-10］。

研究發(fā)現(xiàn)，OA 預(yù)處理能顯著減少過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的原代皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高和細(xì)胞死亡［11］。另一項(xiàng)研究也表明，OA 預(yù)處理能夠逆轉(zhuǎn)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12）線粒體膜電位和琥珀酸脫氫酶活性下降［12］，提示OA對(duì)氧化應(yīng)激損傷下的線粒體功能具有保護(hù)作用，并可以減輕神經(jīng)元鈣超載。

OA 除了具有改善線粒體功能障礙的作用外，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與Nrf2激動(dòng)劑巴多索隆相類似，因此被認(rèn)為具有抗氧化作用［13］。OA 可以減輕過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的原代皮層神經(jīng)元ROS 的產(chǎn)生［11］，OA 還可以通過(guò)增加PC12細(xì)胞中與ROS 轉(zhuǎn)運(yùn)和清除相關(guān)的超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽含量，抑制脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物丙二醛（MDA）的產(chǎn)生，減輕PC12 細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷和減少乳酸脫氫酶（LDH）釋放［12］。在皮質(zhì)-紋狀體神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中，富含OA（35%）的歐夾竹桃苷三萜類提取物也被證實(shí)能夠促進(jìn)共培養(yǎng)系統(tǒng)中神經(jīng)元Nrf2 的激活及其與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）的結(jié)合，與此同時(shí)，OA 可以促進(jìn)Nrf2 下游的ARE 基因谷氨酰半胱氨酸連接酶（glutamate cysteine ligase catalytic，Gclc）、醌氧化還原酶［NAD（P）H：quinone oxidoreductase 1，Nqo1］、血紅素加氧酶1（haem oxygenase-1，Hmox1）和抗氧化蛋白硫氧多辛（sulfiredoxin antioxidant protein，Srx）的表達(dá)。更為重要的是，歐夾竹桃苷三萜類提取物和相當(dāng)劑量的OA均能夠減輕由氧糖剝奪（OGD）誘導(dǎo)的SD 大鼠腦片中皮層神經(jīng)元損傷和死亡［14］。在大腦中動(dòng)脈阻塞/再灌注（MCAO/R）小鼠模型中，OA預(yù)處理（6 mg/kg，連續(xù)3 d，每日1次，腹腔注射）能夠明顯減少缺血再灌注損傷24 h 誘導(dǎo)的皮層梗死區(qū)ROS 和MDA 的產(chǎn)生，并縮小梗死體積，改善神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和維持BBB完整性。其抗氧化作用可能與OA 促進(jìn)胞質(zhì)中Nrf2 進(jìn)入細(xì)胞核并上調(diào)下游血紅素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）有關(guān)，HO-1 被認(rèn)為是人體內(nèi)最有效的ARE，廣泛用于缺血性卒中神經(jīng)保護(hù)治療的依達(dá)拉奉，即是通過(guò)HO-1 途徑發(fā)揮氧自由基清除作用［15］。在另一項(xiàng)研究中，MCAO/R 小鼠術(shù)后即刻給予OA（10 mg/kg）口服處理，能夠顯著減少缺血再灌注損傷1 d 和3 d 時(shí)缺血核心區(qū)4-羥基壬烯酸（4-HNE）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，同時(shí)縮小梗死體積，提示OA 可以通過(guò)降低缺血再灌注損傷后的脂質(zhì)過(guò)氧化水平，減少神經(jīng)元凋亡和抑制缺血核心區(qū)及周圍區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞激活［16］。糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）是調(diào)節(jié)HO-1 抗氧化作用的關(guān)鍵蛋白，研究表明，OA 可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)OGD/R 誘導(dǎo)的GSK-3β去磷酸化和HO-1 表達(dá)降低，進(jìn)而抑制人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）ROS 的產(chǎn)生，并減少OGD/R 導(dǎo)致的細(xì)胞活力受損。此外，在MCAO/R 大鼠模型中，OA 預(yù)處理聯(lián)合術(shù)后處理（10～20 mg/kg，預(yù)處理3 d，術(shù)后處理6 d，每日1 次，腹腔注射）可通過(guò)激活GSK-3β/HO-1信號(hào)通路縮小腦組織梗死體積、增加神經(jīng)元存活數(shù)和減少細(xì)胞凋亡數(shù)目，改善神經(jīng)功能缺損［17］。

3 OA 抗缺血性卒中誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡和促進(jìn)神經(jīng)再生

缺血性卒中后神經(jīng)元有多種死亡形式，OA 被證實(shí)能夠抗缺血性卒中所導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡和焦亡，并在一定程度上促進(jìn)神經(jīng)再生。Bcl-2是一種抗細(xì)胞凋亡蛋白，同時(shí)也是鈣蛋白酶的反應(yīng)底物。神經(jīng)元在缺血缺氧條件下，細(xì)胞內(nèi)鈣超載導(dǎo)致鈣蛋白酶被激活，將Bcl-2剪切為活性形式，呈活性形式的Bcl-2 與線粒體膜上的Bax 蛋白相互結(jié)合形成二聚體，從而促進(jìn)mPTP形成，并導(dǎo)致線粒體內(nèi)多種促凋亡因子，如細(xì)胞色素C 的釋放。細(xì)胞色素C 進(jìn)入胞質(zhì)后與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）和半胱天冬酶原（procaspase）-9形成凋亡小體，激活下游效應(yīng)蛋白半胱天冬酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）-3，進(jìn)而誘導(dǎo)缺血缺氧后神經(jīng)元凋亡［18］。除上述經(jīng)典凋亡途徑以外，有研究表明，神經(jīng)元缺血損傷誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，會(huì)選擇性激活A(yù)TF-4表達(dá)，并促使神經(jīng)元凋亡；神經(jīng)元缺血缺氧后還會(huì)誘導(dǎo)TFAP-1依賴的細(xì)胞代謝異常和凋亡。c-Jun作為TFAP的一員，在細(xì)胞核中廣泛表達(dá)，被認(rèn)為參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄水平變化。此外，有研究也表明CaMKⅡ能夠通過(guò)抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，發(fā)揮抗凋亡作用［19-20］。

在一項(xiàng)腦缺血再灌注損傷研究中，對(duì)大鼠進(jìn)行OA預(yù)處理（25 mg/kg，MCAO/R術(shù)前4 d連續(xù)給藥，每日1 次，腹腔注射）能夠上調(diào)梗死組織周圍Bcl-2 和下調(diào)Bax蛋白表達(dá)水平，并抑制細(xì)胞凋亡，給予PI3K抑制劑處理則部分抵消了OA的抗凋亡作用和下游分子Akt的激活，提示OA可能通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路抑制缺血性卒中導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。雖然研究者并未對(duì)凋亡細(xì)胞類型進(jìn)行檢測(cè)和闡述，但較多相關(guān)研究表明，神經(jīng)元是缺血性卒中后梗死區(qū)周圍凋亡細(xì)胞的主要來(lái)源［21］。研究人員通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)藏藥二十味沉香丸進(jìn)行高效液相色譜和氣相色譜法分析，發(fā)現(xiàn)OA 是其中16 種化學(xué)成分之一，可能與其他藥物成分共同發(fā)揮抗缺血性卒中神經(jīng)元凋亡作用，研究發(fā)現(xiàn)，含OA 成分的二十味沉香丸能夠顯著抑制MCAO/R小鼠梗死半球促凋亡蛋白Bax、caspase-3和細(xì)胞色素C的表達(dá)，提高梗死半球抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平。與此同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)二十味沉香丸可以部分逆轉(zhuǎn)MCAO/R 誘導(dǎo)的CaMKⅡ表達(dá)水平下降和ATF4、c-Jun表達(dá)水平升高［20］。

細(xì)胞焦亡首次發(fā)現(xiàn)于被細(xì)菌感染的巨噬細(xì)胞，是一種caspase-1 介導(dǎo)的細(xì)胞死亡形式，簡(jiǎn)而言之，pro caspase-1在炎性小體中被剪切為活性caspase-1后，招募ASC 并被ASC 激活，分別剪切pro-IL-1β和gasdermin D，促進(jìn)gasdermin D 在細(xì)胞膜打孔和IL-1β的釋放［22］。值得注意的是，雖然有部分研究表明，在創(chuàng)傷、顳葉癲癇和阿爾茨海默病等疾病模型中，神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)與焦亡相關(guān)的分子，如AIM2、ASC和caspase-1等表達(dá)升高和激活，且阻斷caspase-1或NLRP1可以減少神經(jīng)元死亡，然而，神經(jīng)元中caspase-1 的激活還會(huì)導(dǎo)致IL-1β釋放和炎癥反應(yīng)，因此，無(wú)法判斷caspase-1 介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡是否由細(xì)胞焦亡直接導(dǎo)致或與神經(jīng)炎癥共同參與。此外，在缺氧刺激下，體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元可能通過(guò)caspase-1剪切Bcl-2 進(jìn)而增強(qiáng)線粒體膜通透性，激活下游的凋亡信號(hào)通路［23-24］。對(duì)于神經(jīng)元而言，有待更多的實(shí)驗(yàn)證明焦亡相關(guān)蛋白分子與神經(jīng)元死亡形態(tài)和過(guò)程的直接關(guān)系。盡管如此，在原代海馬神經(jīng)元OGD/R模型中，OA被證實(shí)能夠通過(guò)抑制神經(jīng)元miR-186-5p表達(dá)進(jìn)而上調(diào)Ngb水平，顯著減少由caspase-1介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡，并抑制神經(jīng)元LDH和促炎因子IL-1β、IL-18 的釋放，與此同時(shí)，OA 也可以逆轉(zhuǎn)由OGD/R 誘導(dǎo)的神經(jīng)元NLRP3、caspase-1和Gsdmd的表達(dá)升高［25］。

OA 還具有促進(jìn)缺血性卒中神經(jīng)再生作用。研究表明，接受OA預(yù)處理（6 mg/kg，連續(xù)3 d，每日1次，腹腔注射）的MCAO/R 小鼠，梗死核心區(qū)突觸標(biāo)志物PSD-95、突觸蛋白（synapsin）和突觸小泡蛋白（synaptophysin）表達(dá)明顯升高，海馬齒狀回部位雙皮質(zhì)素陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著增加，提示OA 可以增強(qiáng)缺血性卒中損傷后的突觸連接和促進(jìn)新生神經(jīng)元的產(chǎn)生［15］。

4 OA調(diào)控缺血性卒中膠質(zhì)細(xì)胞活動(dòng)

反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生和激活是缺血性卒中后的主要病理表現(xiàn)之一，目前認(rèn)為激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)缺血性卒中具有雙重作用［26-27］。缺血性卒中后，靜息態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞可以分化為促炎表型M1 和抗炎表型M2，兩種表型平衡的維持和破壞對(duì)局部炎癥反應(yīng)具有雙向調(diào)節(jié)作用［28］。星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性卒中早期分泌促炎因子參與早期炎癥反應(yīng)，也可通過(guò)S100β介導(dǎo)的吞噬作用清除興奮性遞質(zhì)，減輕興奮性神經(jīng)毒性［29］。在皮層內(nèi)局部注射氯化鈷誘導(dǎo)的大鼠局灶性缺氧模型中，OA 預(yù)處理（6 mg/kg，每日1次，連續(xù)7 d，腹腔注射）在抑制缺氧皮層部位小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和激活的同時(shí)，能夠減少小膠質(zhì)細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的產(chǎn)生，以及相對(duì)增加星形膠質(zhì)細(xì)胞中S100β的表達(dá)［30］。在MCAO/R 小鼠模型中，OA 預(yù)處理（6 mg/kg，連續(xù)3 d，每日1次，腹腔注射）同樣被證實(shí)能夠顯著抑制缺血區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的增生和激活［15］。NLRP3 炎性小體的激活與缺血性卒中后神經(jīng)炎癥反應(yīng)和損傷密切相關(guān)，而小膠質(zhì)細(xì)胞是缺血性卒中后NLRP3的主要來(lái)源，研究表明OA（10 mg/kg，MACO/R 術(shù)后即刻口服1 次）能夠顯著抑制梗死核心區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3 炎性小體的激活［16］。

5 小結(jié)和展望

缺血性腦卒中嚴(yán)重危害人類健康，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。到目前為止，仍缺乏確切有效的治療方法。重組纖溶酶原激活劑是臨床上使用的唯一藥物，但由于治療時(shí)間窗短和出血風(fēng)險(xiǎn)，其使用受到限制。通過(guò)以前的治療實(shí)踐，來(lái)自植物的天然產(chǎn)物已經(jīng)被用于治療多種疾病，隨著技術(shù)的進(jìn)步，也已經(jīng)進(jìn)行了許多嘗試來(lái)探索天然產(chǎn)物的神經(jīng)保護(hù)作用。目前的研究表明，OA 可通過(guò)抑制神經(jīng)炎癥、調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞活性、抗細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激等方式改善神經(jīng)功能，減輕腦水腫與腦梗死，保護(hù)缺血性卒中后的BBB與腦組織，并減輕缺血再灌注損傷。在缺血性卒中的治療中，多靶點(diǎn)藥物的研究和開(kāi)發(fā)可以更有效地促進(jìn)神經(jīng)元的存活和恢復(fù)，改善病情。OA 具有多個(gè)靶標(biāo)和不同的信號(hào)通路機(jī)制，可通過(guò)合成其衍生物、結(jié)合其他活性化合物以及通過(guò)納米遞藥等方法來(lái)實(shí)現(xiàn)其多靶點(diǎn)作用。然而，作為應(yīng)用于臨床的神經(jīng)保護(hù)劑，OA 仍存在一些不足。目前，臨床應(yīng)用OA 的用藥劑量和時(shí)間沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，治療效果易受到生物學(xué)環(huán)境和腦神經(jīng)元數(shù)量的影響，無(wú)法確保安全性。同時(shí)，OA 的神經(jīng)保護(hù)作用缺乏高質(zhì)量的研究數(shù)據(jù)支持，需要更大規(guī)模的隨機(jī)對(duì)照研究來(lái)證明其療效。此外，OA 治療的不良反應(yīng)尚未得到深入的研究和監(jiān)測(cè)，在臨床應(yīng)用中需要引起更多的關(guān)注。

綜上，OA 在神經(jīng)保護(hù)方面具有廣泛的應(yīng)用前景，需要結(jié)合已知的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制和適用范圍深入研究，探索新的治療策略和藥物設(shè)計(jì)方法。