謝 雯，董洪權(quán)，侍崇龍，金文杰

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，江蘇 南京 210029

固有免疫激活是神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理過程的重要組成部分。中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）的穩(wěn)態(tài)與固有免疫的平衡息息相關(guān)［1］。失調(diào)的CNS固有免疫參與多種CNS疾病的發(fā)生和發(fā)展。研究CNS與固有免疫之間的關(guān)系，有助于更好地了解神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制，制定有效的治療策略。

小膠質(zhì)細胞（microglia，MG）是大腦固有免疫系統(tǒng)的主要細胞成分，受到壓力、腦外傷、感染等刺激時被激活并向受損細胞游走遷徙，吞噬死去的細胞［2］。大腦受損時，損傷相關(guān)分子模式（damagerelated molecular pattern，DAMP）和病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）等作用于MG，產(chǎn)生活性氧、補體和促炎細胞因子，如白介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）等，導(dǎo)致大腦功能進一步受損［3］。MG 的活化和促炎細胞因子的釋放在中樞炎癥中發(fā)揮核心作用。適當(dāng)?shù)闹袠醒装Y可以促進細胞碎片的清除和組織修復(fù)，恢復(fù)神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)并保護神經(jīng)元的完整性［4］。過度且持續(xù)的中樞炎癥活化MG，促炎細胞因子大量釋放，激活MG 的神經(jīng)毒性作用［5］。大量證據(jù)表明，中樞炎癥是CNS 疾病中最常見的病理之一［6-8］。因此，調(diào)控中樞炎癥對于治療CNS疾病具有重要的意義。

近幾年的研究表明，腦膜淋巴管（meningeal lymphatic vessel，mLV）參與大腦中大分子毒性介質(zhì)、免疫細胞、細胞碎片等物質(zhì)的清除和引流［9-10］。Absinta 等［11］通過體內(nèi)磁共振成像的技術(shù)證實人類mLV 的存在。mLV存在于硬腦膜中，表達淋巴管內(nèi)皮細胞的特異性標(biāo)志物：血管內(nèi)皮生長因子受體3（vascular endothelial growth factor receptor 3，VEGFR3）和淋巴管內(nèi)皮細胞透明質(zhì)酸受體1（lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1，LYVE-1），受到血管內(nèi)皮生長因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）/VEGFR3 信號的持續(xù)調(diào)控［10］。它能夠?qū)⑼庵苊庖呒毎?、細胞因子、大分子蛋白和CNS 衍生的抗原從腦膜間質(zhì)和腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）中引流至頸深淋巴結(jié)（deep cervical lymph node，dCLN），隨后進入外周器官代謝清除。腦膜淋巴系統(tǒng)對于清除大腦中的β-淀粉樣蛋白（amyloid β，Aβ）、細胞外tau蛋白和α-突觸核蛋白至關(guān)重要［12-14］。mLV 轉(zhuǎn)運功能損害可導(dǎo)致神經(jīng)毒性物質(zhì)的積累，導(dǎo)致認知功能障礙。然而，mLV轉(zhuǎn)運功能在中樞炎癥中的作用仍然知之甚少。

VEGFR3是一種酪氨酸激酶受體，它與VEGF-C結(jié)合可誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，從而促進淋巴管生成。MAZ51 是VEGFR3 選擇性抑制劑，能夠抑制mLV 生成［15］。本研究通過腹腔注射LPS建立小鼠中樞炎癥模型［16-17］，觀察中樞炎癥對mLV的影響，使用VEGFR3 抑制劑MAZ51 抑制mLV 生成，闡明mLV 功能障礙對中樞炎癥的影響，為臨床治療CNS疾病提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

采用成年雄性SPF 級C57BL/6 小鼠（6～8 周齡）建立模型。實驗小鼠購于維通利華，放置在標(biāo)準(zhǔn)實驗室條件中飼養(yǎng)［（25±2）℃，12 h晝夜循環(huán)光照］，自由飲水?dāng)z食。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。所有動物實驗均經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物使用與管理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：IACUC-2008037）。

1.1.2 主要試劑與儀器

小鼠IL-6、IL-1β Quantikine ELISA 檢測試劑盒（R&D 公司，美國）；LPS 來自大腸桿菌0111：B4（Sigma Aldrich 公司，美國）；Iba-1 抗體（Wako 公司，日本）；LYVE-1 抗體（Abcam 公司，美國）；OVA-647（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；RIPA 緩沖液（上海碧云天公司）；蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑（Roche公司，瑞士）；DAPI染液（Abcam公司，美國）；腦立體定位儀（深圳瑞沃德公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥方法

首先將16 只C57BL/6 小鼠隨機分為4 組，LPS組12 只，分別腹腔注射LPS（2 mg/kg），12、24、72 h后各取4只進行實驗。Control 組4只給予相同體積的生理鹽水腹腔注射，作為對照。

其次將8 只小鼠隨機分為2 組，分別為Control組和MAZ51 組，將MAZ51 溶解于二甲亞砜中，以10 mg/kg腹腔注射，持續(xù)30 d，每周5 d，共6周，對照組給予相同體積的二甲亞砜［15］。42 d后枕大池注射熒光標(biāo)記蛋白OVA-647（3 μL），1 h 后處死小鼠，取dCLN、硬腦膜進行分析。

另取24 只小鼠隨機分為Control 組、MAZ51 組、LPS組、LPS+MAZ51組，每組6只。用相同的方法腹腔注射MAZ51，42 d后將小鼠放入行為學(xué)儀器中進行訓(xùn)練，30 min后對LPS組和LPS+MAZ51組腹腔注射LPS，其余兩組注射相同體積的生理鹽水。1 d后進行行為學(xué)實驗，實驗結(jié)束后處死小鼠，取海馬進行分析。

1.2.2 腦枕大池立體定位注射

腹腔注射50 mg/kg 戊巴比妥鈉麻醉小鼠，頸部皮膚剃毛消毒后放入腦立體定位儀中并三角固定。切開皮膚，暴露枕大池，用Hamilton微量注射器吸取OVA-647（3 μL）以2 μL/min 的速率注入枕大池中。注射后，將注射器停留在原處2 min，以免CSF回流，然后縫合頸部皮膚，讓小鼠在加熱墊上恢復(fù)至完全清醒。

1.2.3 免疫熒光染色

麻醉小鼠后剪開頸部皮膚，向下牽拉胸鎖乳突肌，暴露dCLN 并用鑷子取出，放入4%多聚甲醛中固定24 h，用20%和30%的蔗糖梯度脫水后連續(xù)冰凍切片（厚度10 μm），用PBS 洗去殘余OCT 包埋膠后DAPI 封片。取完dCLN 后用生理鹽水和4%多聚甲醛灌注心臟，剪去頸部肌肉，剝出頭蓋骨，放入4%多聚甲醛中固定24 h，PBS 洗滌1 遍，在顯微鏡下用鑷子剝出硬腦膜，貼在載玻片上，烘干。

LYVE-1 染色：腦膜用PBS 洗滌后，在室溫下用含2 g/L Triton X-100牛血清白蛋白孵育1 h，加入帶有紅色熒光基團的兔抗-LYVE-1（1∶200），在4 ℃冰箱中孵育過夜，次日用PBS洗滌（5 min×3次）后，用DAPI封片。

封片后使用Thunder Imager 快速高分辨倒置熒光成像系統(tǒng)（LEICA 公司，德國）掃描拍照。計算mLV內(nèi)皮細胞標(biāo)志物L(fēng)YVE-1熒光面積以及淋巴結(jié)內(nèi)OVA-647熒光占整個淋巴結(jié)面積的百分比。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色

用戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，用生理鹽水和4%多聚甲醛進行灌注，取出大腦，用4%多聚甲醛固定24 h，蔗糖溶液梯度脫水，待沉底后用OCT 膠包埋腦組織，固定后連續(xù)切片（厚度10 μm），選出海馬切片，用PBS 清洗后在常溫下放入3%H2O2中浸泡10 min，洗滌后用5% BSA 封閉液中封閉1 h，加入用1% BSA 稀釋后的一抗（1∶200），在4 ℃冰箱中過夜，次日用PBS 洗滌3 次后加入相應(yīng)的二抗，孵育1 h 后PBS 洗滌3 次，用DAPI 封片。選取海馬CA1 和CA3 區(qū)拍照。細胞計數(shù)應(yīng)用NIH Image J 軟件。

1.2.5 ELISA

使用小鼠IL-6、IL-1β Quantikine ELISA 試劑盒測量小鼠海馬組織勻漿中細胞因子IL-6、IL-1β水平。具體步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.6 逃避恐懼實驗

逃避恐懼實驗用來評估小鼠的海馬依賴性記憶。訓(xùn)練小鼠將無條件刺激（足部電擊）和條件刺激（音調(diào)）與環(huán)境聯(lián)系起來。先進行訓(xùn)練，將小鼠放入TFC 儀器中自由探索100 s，然后給予小鼠聽覺刺激20 s（80 db，5 kHz），后立即給予足底電擊（0.8 mA），重復(fù)2 次，中間間隔100 s。刺激結(jié)束后30 min 腹腔注射LPS，1 d后評估小鼠學(xué)習(xí)恐懼的情景記憶，通過視頻跟蹤軟件（Xeye Fcs，北京天鳴鴻遠科技發(fā)展有限公司）自動記錄小鼠300 s內(nèi)除呼吸以外沒有任何運動的僵直反應(yīng)時間。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析和t檢驗確定差異顯著性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS腹腔注射對mLV轉(zhuǎn)運功能的影響

小鼠腹腔注射LPS，12、24、72 h 后于枕大池中注射OVA-647（3 μL），取腦膜和dCLN 進行分析，如圖1 所示，與Control 組相比，LPS 組小鼠腦膜中mLV 標(biāo)志物L(fēng)YVE-1 面積、dCLN 的OVA-647 熒光面積明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，其中24 h 時達到最低，72 h 時面積有所回升，仍低于基礎(chǔ)水平。取小鼠海馬分析MG 活化情況和炎癥因子水平，MG 活化標(biāo)志物Iba-1、炎癥因子IL-6、IL-1β水平在24 h 達到最高（P＜0.01，圖2），72 h 回落，說明LPS 導(dǎo)致mLV 轉(zhuǎn)運功能下降，并隨著時間有所恢復(fù)。

圖1 LPS處理對小鼠腦膜淋巴管轉(zhuǎn)運功能的影響Figure 1 Effects of LPS treatment on the transport function of meningeal lymphatic vessels

圖2 LPS處理對海馬小膠質(zhì)細胞活化和炎癥因子的影響Figure 2 Effects of LPS treatment on microglia activation and inflammatory factors in the hippocampus

2.2 VEGFR3抑制劑可影響mLV轉(zhuǎn)運功能

小鼠腹腔注射VEGFR3 抑制劑MAZ51，42 d后檢測mLV 的轉(zhuǎn)運功能。如圖3 所示，與Control組相比，MAZ51 組的mLV 內(nèi)皮細胞標(biāo)志物L(fēng)YVE-1熒光面積顯著減少，OVA-647面積減少，提示VEGFR3抑制劑通過抑制mLV 的生成來降低mLV 的轉(zhuǎn)運功能。

圖3 MAZ51對腦膜淋巴管轉(zhuǎn)運功能的影響Figure 3 Effects of MAZ51 on the transport function of meningeal lymphatic vessels

2.3 VEGFR3抑制劑促進LPS誘導(dǎo)的MG激活

小鼠腹腔注射MAZ51 后，腹腔注射LPS，檢測海馬MG 的活化情況。如圖4 所示，MAZ51 組的海馬CA1、CA3 區(qū)Iba-1 表達量與Control 組相比無差異。LPS 組Iba-1 表達相比Control 組大幅提高，而LPS+MAZ51 組Iba-1 表達相比LPS 組則進一步升高，提示預(yù)先注射MAZ51 導(dǎo)致淋巴功能下降會進一步增加LPS 引起的MG 活化。

圖4 MAZ51對小膠質(zhì)細胞活化的影響Figure 4 Effects of MAZ51 on the activation of microglia

2.4 VEGFR3抑制劑可影響炎癥因子的釋放

通過ELISA 測定小鼠海馬區(qū)IL-6 和IL-1β的含量。結(jié)果如圖5 所示，LPS 和LPS+MZA51 組海馬區(qū)炎癥因子表達增加；與LPS 組相比，LPS+MAZ51 組炎癥因子表達顯著增加。以上結(jié)果說明LPS促進海馬炎癥因子的釋放，VEGFR3抑制劑加劇這一過程。

圖5 MAZ51對小鼠海馬區(qū)炎癥因子表達的影響Figure 5 Effects of MAZ51 on expression of inflammatory cytokines in the hippocampus of mice

2.5 VEGFR3抑制劑可以加重LPS誘導(dǎo)的小鼠恐懼記憶損傷

許多疾病和狀態(tài)都會出現(xiàn)mLV的損傷，伴隨認知功能障礙，如阿爾茲海默癥和衰老［18］，為此，本研究進行逃避恐懼實驗評估小鼠的認知功能。如圖6所示，MAZ51組小鼠并未出現(xiàn)恐懼記憶損傷，LPS組則出現(xiàn)明顯的恐懼記憶損傷，僵直時間減少，LPS+MAZ51 組小鼠僵直時間相比LPS 組顯著縮短，說明MAZ51 導(dǎo)致的淋巴管轉(zhuǎn)運功能下降加重LPS 對認知功能的損傷。

圖6 MAZ51加重LPS誘導(dǎo)的小鼠恐懼記憶損傷Figure 6 MAZ51 exacerbates LPS-induced fear memory impairment in mice

3 討論

本研究探討了mLV 轉(zhuǎn)運功能障礙對LPS 誘導(dǎo)的小鼠中樞炎癥的影響。研究發(fā)現(xiàn)小鼠中樞炎癥模型建立后腦膜LYVE-1 以及dCLN 中OVA-647 的熒光面積明顯減少，mLV 轉(zhuǎn)運功能顯著降低，1 d達到高峰，可至少持續(xù)3 d；同時伴有炎癥因子IL-6、IL-1β的水平增加，MG 活化標(biāo)志物Iba-1 表達增加。VEGFR3 抑制劑MAZ51 導(dǎo)致的mLV 轉(zhuǎn)運功能障礙可進一步升高海馬中炎癥因子IL-6、IL-1β的水平，促進MG活化，加重小鼠認知功能損傷。

CNS 疾病是全世界死亡和殘疾的主要原因。2016年全球疾病負擔(dān)、傷害和風(fēng)險因素研究分析發(fā)現(xiàn)CNS 疾病是2016 年全球第二大死因［19］。中樞炎癥是改善CNS 疾病導(dǎo)致的認知功能損傷的重要靶點［20］。研究表明，創(chuàng)傷性腦損傷前存在mLV功能障礙會導(dǎo)致與神經(jīng)炎癥和補體信號相關(guān)的基因在損傷后24 h表達升高［15］；對肝性腦病小鼠應(yīng)用VEGF-C增強mLV功能可以降低促炎因子的表達［21］。因此，本研究探討mLV 功能障礙對中樞炎癥的影響。首先，本研究通過對小鼠腹腔注射LPS 成功建立中樞炎癥模型，并發(fā)現(xiàn)中樞炎癥可以影響mLV轉(zhuǎn)運清除功能，導(dǎo)致認知功能障礙。

為進一步研究的mLV 功能障礙對中樞炎癥的影響，本研究使用腹腔注射VEGFR3 受體拮抗劑MAZ51，抑制mLV 的轉(zhuǎn)運功能，檢測小鼠海馬中IL-6 和IL-β的水平，以及MG 活化情況。結(jié)果顯示MAZ51 組mLV 標(biāo)志物L(fēng)YVE-1 熒光面積相對于Control組顯著減少，但海馬炎癥介質(zhì)水平、MG活化水平以及小鼠行為學(xué)均無明顯變化，提示年輕小鼠mLV清除大分子毒性物質(zhì)的功能由血腦屏障、自噬等途徑代償。中樞炎癥會破壞血腦屏障，導(dǎo)致線粒體功能障礙，Aβ、tau等大分子毒性物質(zhì)難以從腦實質(zhì)中排出［22-23］。mLV 功能障礙導(dǎo)致腦實質(zhì)/腦間質(zhì)液大分子流出和進入dCLN 減少，排出中樞大分子毒性物質(zhì)的功能進一步下降［18］。本研究結(jié)果還顯示，與LPS 組相比，注射MZA51 的小鼠用LPS 處理后，海馬炎癥因子水平增加，MG 活化增多，與認知損傷趨勢一致，說明預(yù)先存在的mLV功能損傷導(dǎo)致大分子毒性物質(zhì)在腦內(nèi)累積，引起IL-6、IL-1β等炎癥介質(zhì)在海馬中聚集，誘導(dǎo)MG活化，使LPS處理后的小鼠更容易出現(xiàn)認知功能障礙。

綜上所述，LPS 誘導(dǎo)的中樞炎癥損害mLV 轉(zhuǎn)運功能，而mLV功能損傷增加IL-6和IL-1β聚集，增加MG活化，加重LPS誘導(dǎo)的認知功能障礙。但是除了影響炎癥介質(zhì)聚積和MG 活化，mLV 損傷是否通過影響其他通路對中樞炎癥產(chǎn)生作用，目前尚不清楚，未來還需更多的實驗進行分析和判斷。