劉雪昂，時 堅，胡 冉，朱 巖，馬文靜，朱 毅*

1南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胰腺中心，江蘇 南京 210029；2南京醫(yī)科大學胰腺研究所，江蘇 南京 210029；3南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院公共實驗中心，4病理科，江蘇 南京 210029

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是一種高度侵襲性和致命性的惡性腫瘤，是目前癌癥死亡的第三大原因［1］，遠處轉移超過50%［2］，對放療、化療不敏感，只有15%～20%的患者能從手術中獲益，5 年生存率低于10%［3］。胰腺癌發(fā)生隱匿、起病早期階段無癥狀、迄今尚缺乏可靠的早期診斷生物標志物與特異敏感的診斷方法等都是導致胰腺癌確診晚、治療難和病死率高的根源［4］。目前糖類抗原CA19-9 雖然被廣泛用于胰腺癌發(fā)生與預后的監(jiān)測［5］，但由于大約有10%的人群不表達Lewis 抗原，CA19-9 也可在良性胰膽管疾病和膽道梗阻的情況下升高等原因，CA19-9 尚不能提供足夠的準確性來早期發(fā)現(xiàn)和診斷胰腺癌。為了解決胰腺癌早期診斷、根治、預后等棘手問題，探索新的生物標志物是重要和緊要的研究工作［6］。

糖基化是在酶的控制下，將糖鏈連接到糖類、脂類或蛋白質分子上的過程。糖基化代表了一組獨特的蛋白質修飾，可能涉及單糖甚至整個寡糖（聚糖）與糖蛋白內的特定氨基酸相連接的過程。糖基化修飾主要發(fā)生在高爾基體和內質網(wǎng)中，反映了一系列復雜的酶、細胞器和其他因素的協(xié)調作用，糖鏈與脂質和蛋白質連接的兩種最常見的機制是O-連接和N-連接的糖基化［7］。

糖基化也是腫瘤轉化過程中的表觀遺傳學變化之一［8］。腫瘤中的異常糖基化修飾在50 年前被首次描述［9］，迄今，許多研究表明糖基化基因主導的糖基化修飾與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關［10］。特別是，聚糖不能像蛋白質和核酸那樣直接從基因組編碼模板合成，其保真度主要取決于糖基轉移酶（glycosyltransferase，GT）的特異性，后者通過一次添加一種糖來合成復雜的聚糖。大多數(shù)真核生物GT 定位于分泌通路的腔內，并在向細胞表面或細胞外間隙轉運時修飾蛋白質和脂質［11］。與未惡性轉化的細胞相比，腫瘤細胞顯示出異常的糖基化改變，異常的糖基化已被認為是所有癌癥的一個普遍標志。

通過系統(tǒng)整合在公共數(shù)據(jù)庫TCGA 與GTEx 中胰腺癌患者生物樣本的測序數(shù)據(jù)，本研究篩選出與胰腺癌預后相關的糖基化差異表達基因，其中，風險比（hazard ratio，HR）最大的基因是β-1，4-半乳糖基轉移酶5（beta-1，4-galactosyltransferase 5，B4GALT5）。B4GALT5 是7 個β-1，4-半乳糖基轉移酶基因之一，B4GALT5 催化半乳糖從UDP-半乳糖向葡萄糖神經(jīng)酰胺（GlcCer）轉移合成乳糖基神經(jīng)酰胺（LacCer）［12-13］。B4GALT5 主要存在于細胞表面，也定位于高爾基復合體中，類似于其他糖基轉移酶，它們修飾的蛋白分子作為黏附分子參與基質相互作用、細胞擴散和遷移以及信號轉導級聯(lián)。B4GALT5的功能在肝細胞癌［14］、婦科腫瘤［15］中已有報道，但是B4GALT5在胰腺癌中的作用迄今尚未見報道。本研究還進一步在本中心的胰腺生物樣本組織和胰腺癌細胞系中驗證了B4GALT5 的表達情況，通過系列體外實驗證明了其在胰腺癌惡性生物學行為中的作用。

1 資料和方法

1.1 資料

本研究從公共癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫（TCGA，https：//portal.gdc.cancer.gov/）中獲得了178例胰腺癌患者和4例正常胰腺樣本的轉錄組測序數(shù)據(jù)和相關臨床參數(shù)（如性別、年齡、分級、TNM 分期、生存期等）。另外165 個正常胰腺樣本的信息來自基因型組織表達數(shù)據(jù)庫（GTEx，https：//www.gtexportal.org/home/index.html）。糖基化相關基因集來源于在線數(shù)據(jù)庫GGDB（GlycoGene DataBase，https：//acgg.asia/ggdb2/）［16］。驗證樣本集來源于南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胰腺中心2019—2022 年行胰十二指腸切除術60 例患者的胰腺癌組織和配對的鄰近非腫瘤組織，組織樣本由ISO90012015 質量認證的胰腺專病生物樣本庫提供，并由兩位病理醫(yī)生核對與證實。醫(yī)院倫理委員會批準了該研究使用患者的生物樣本（倫理號：2020-SRFA-364），所用的生物樣本均有書面的患者簽名知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 糖基化相關的差異表達基因（differential expression genes related to glycosylation，DE-GRG）的篩選

使用Wilcoxon 檢驗進行糖基化差異基因的鑒定，納入標準為P＜0.05 且|log2FC|≥1。使用R 包“ComplexHeatmap”繪制聚類熱圖。

1.2.2 單因素Cox分析

使用R 包“survival”進行單變量Cox 分析，篩選出與胰腺癌患者生存相關的DE-GRG。

1.2.3 GO/KEGG富集分析

GO 分析用于對基因或蛋白質進行功能分類，主要應用于基因表達譜分析、蛋白質互作網(wǎng)絡分析和新基因功能預測等領域。KEGG分析主要針對生物體中的代謝通路。使用R 包“clusterProfiler”進行GO/KEGG富集分析。

1.2.4 表達驗證及生存分析

應用在線分析網(wǎng)站GEPIA（http：//gepia.cancerpku.cn/）對目的基因進行表達水平和預后相關分析，Kaplan-Meier 曲線又稱生存曲線，主要分析與評估單一因素對患者生存期的影響。

1.2.5 細胞培養(yǎng)

人胰腺癌細胞系（CFPAC-1、MIA PaCa-2、BxPC-3、PANC-1）和正常人的胰腺導管上皮細胞系（HPNE）均購于上海細胞庫。小鼠胰腺癌細胞系Panc02 購于北京國家實驗細胞資源共享服務平臺。細胞系均使用含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，在5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。

1.2.6 定量PCR

使用TRIzol 試劑抽提細胞和研磨后組織中的總RNA。接下來，使用1 μg 總RNA 和TRUEscript RT 試劑盒在20 μL 的最終體積中進行逆轉錄。采用2×SYBR Green Master Mix和終體積10 μL的體系進行定量PCR。采用2-ΔΔCt法計算相對基因表達量。每次實驗均設置3 個復孔，共重復3 次。B4GALT5 引物序列如下：上游5＇-GATCCGGGACAACGTGA-GAAC-3＇；下游5＇-TTCAGGGCAGGTATGGTTTGC-3＇。GAPDH 引物序列如下：上游5＇-ACGGGAAGC-TTGTCATCAAT-3＇；下 游5＇-TGGACTCCACGACGTACTCA-3＇。

1.2.7 Western blot

使用RIPA 緩沖液分離總蛋白，然后用BCA 蛋白分析試劑盒定量。用10%SDS-PAGE 膠電泳，恒壓100 V 持續(xù)1 h。接著用PVDF 膜恒流0.4 A 濕轉40 min。用5%脫脂牛奶封閉2 h 后，使用稀釋后的一抗在4 ℃下孵育過夜，然后加入辣根過氧化物酶標記的二抗在室溫下孵育2 h。洗滌3 次后，使用ECL 化學發(fā)光試劑檢測。使用Image J 軟件對電泳條帶進行灰度掃描，同時進行半定量分析。

1.2.8 質粒轉染

取無酶1.5 mL EP 管，加入對應比例的Lipofectamine 3000 轉染試劑和不含抗生素的DMEM 培養(yǎng)基，吹打混勻靜置5 min；另取1.5 mL EP管，加入質粒，再加入不含抗生素的DMEM 培養(yǎng)基，吹打混勻靜置5 min。最后將兩個EP 管中的試劑混合均勻，靜置15 min 后將Lipofectamine 3000和質?；旌先芤壕徛D加入細胞培養(yǎng)皿中。24 h 后換液，48～72 h檢驗轉染效率。

1.2.9 CCK-8實驗檢測細胞的增殖水平

將轉染后的胰腺癌細胞接種于96孔板，37 ℃培養(yǎng)48 h 后，替換為100 μL/孔10%的CCK-8 溶液，放置培養(yǎng)箱避光孵育1 h，酶標儀測定450 nm 處的吸光度值。

1.2.10 劃痕實驗

鋪板前用記號筆在6 孔板背面劃2 條橫線，線間距為0.5～1.0 cm，橫穿過孔。每孔加入5×105個細胞。24 h后用槍頭垂直于背后的橫線劃痕。PBS洗3 次去除漂浮的細胞，加入無血清培養(yǎng)基，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。按0 h、24 h 時間點取樣，拍照。使用Image J 軟件測量最開始（0 h）的劃痕面積和24 h的傷口面積，計算24 h的傷口劃痕百分比=24 h的傷口面積/0 h的劃痕面積×100%。

1.2.11 Transwell侵襲實驗

用1∶5 稀釋的基質膠包被上室底部，放置于37 ℃培養(yǎng)箱約30 min。用無血清的DMEM 制備細胞懸液，細胞濃度調整為2×105個/mL。在上室加入200 μL 細胞懸液，在下室加入500 μL 含10% FBS的培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用棉簽輕輕擦拭上室的細胞，用4%多聚甲醛固定10 min，然后用0.1%結晶紫染色5～10 min，用PBS 洗滌3 次，在倒置顯微鏡下隨機選擇10 個高倍視野（×200）進行細胞計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和可視化均在R4.2.1版本及GraphPad Prism 7 中進行，每個實驗獨立重復3 次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，pROC［1.18.0］用于受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析，生存分析采用Kaplan-Meier 法并進行l(wèi)og-rank 檢驗，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌預后相關糖基化基因的篩選

基于TCGA-GTEx 聯(lián)合數(shù)據(jù)庫中178 例胰腺癌患者數(shù)據(jù)（表1）和169 例正常組織數(shù)據(jù)，在糖基化基因集中共篩選出66 個DE-GRG，包含20 個下調基因和46 個上調基因，繪制熱圖將其進行可視化（圖1A）。為了進一步鑒定與預后相關的DE-GRG，根據(jù)TCGA 數(shù)據(jù)庫中的轉錄本信息和臨床參數(shù)，使用單因素Cox 分析得到20 個與預后相關的DE-GRG，其中14個為危險性因素，6個為保護性因素（圖1B），其中，HR 最大的基因是糖基轉移酶B4GALT5（HR=21.372，P＜0.05）。

圖1 預后相關DE-GRG的篩選Figure 1 Identification of prognosis-related DE-GRG

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫中患者的臨床信息Table 1 Clinical information of patients in the TCGA database

進一步對20個預后相關的DE-GRG 進行了GO和KEGG富集分析。在GO分子功能中，DE-GRG主要富集在各類糖基轉移酶活性領域GO 生物過程中，包括乙酰葡糖胺轉移酶活性、乙酰半乳糖胺基轉移酶活性、UDP-糖基轉移酶活性等。DE-GRG 與腫瘤的糖蛋白途徑密切相關，包括糖蛋白的生物合成過程和代謝過程，大分子和蛋白質的糖基化修飾過程等。在細胞內，DE-GRG 主要定位于高爾基體中，亞細胞器分布集中于高爾基體亞室、高爾基體堆棧和高爾基體池中。KEGG通路富集分析結果進一步提示，DE-GRG 主要在黏蛋白O-糖基化生物合成、乳酸和新乳酸生物合成、糖基磷脂酰肌醇的錨定過程等各種類型的糖基化生物合成通路中發(fā)揮作用（圖1C）。20 個預后相關的DE-GRG 相關性如圖1D所示。

2.2 B4GALT5高表達與胰腺癌不良預后正相關

公共數(shù)據(jù)庫TCGA-GTEx中的數(shù)據(jù)分析顯示，與正常胰腺組織相比，B4GALT5在胰腺癌組織中表達升高，且其高表達與不良預后正相關（圖2A）。ROC曲線分析顯示，1、3、5年OS的AUC值為0.643、0.752和0.877，證明B4GALT5 具有良好的預測能力（圖2B）。

圖2 B4GALT5的表達與胰腺癌預后的相關性分析Figure 2 Analysis of the correlation between the expression of B4GALT5 and the prognosis of pancreatic cancer

進一步通過定量PCR 檢測本中心的60 對癌和癌旁組織中B4GALT5 的表達。這些患者術前均未接受化療或放療，在2019—2022年接受了胰十二指腸切除術，并經(jīng)病理證實為胰腺癌，術后嚴格隨訪?？偵嫫诒欢x為從手術到死亡或最后一次隨訪日期的時間。結果顯示，與癌旁組織相比，B4GALT5在胰腺癌組織中的表達同樣升高（圖2C），B4GALT5 高表達的患者預后更差，生存期更短（圖2D），與公共數(shù)據(jù)庫研究結果的趨勢一致。

TCGA數(shù)據(jù)庫中亞組臨床參數(shù)生存分析的結果顯示，高表達B4GALT5 在不同的TNM、年齡、性別、臨床分期組中均能夠作為不良預后的顯著預測因素（圖2E～L）。因此，推測B4GALT5 的高表達可能在胰腺癌惡性演進中有重要作用。

2.3 B4GALT5 表達量與胰腺癌組織中免疫浸潤水平的相關性分析

有研究報道腫瘤周圍浸潤淋巴細胞的差異與胰腺癌惡性演進和不良預后有關，且免疫治療也是胰腺癌綜合治療方案的重要組成之一［17］。本研究使用在線數(shù)據(jù)庫TIMER（http：//timer.comp-genomics.org/）分析B4GALT5 表達與浸潤性免疫細胞的關聯(lián)。分析結果顯示，在胰腺癌組織中，B4GALT5 基因的表達水平與B 細胞（r=0.196，P=0.010）、CD8+T細胞（r=0.376，P＜0.001）、骨髓來源的抑制性細胞（r=0.265，P＜0.001）、中性粒細胞（r=0.439，P＜0.001）、巨噬細胞（r=0.260，P＜0.001）、腫瘤相關成纖維細胞（r=0.320，P＜0.001）、淋巴樣祖細胞（r=0.231，P＜0.001）、樹突狀細胞（r=0.427，P＜0.001）的浸潤水平呈正相關（圖3A）；與CD4+T 細胞（r=-0.221，P=0.004）、自然殺 傷（natural killer，NK）T 細 胞（r=-0.265，P＜0.001）的浸潤水平呈負相關（圖3B）。

圖3 B4GALT5基因表達與免疫細胞浸潤的相關性Figure 3 Correlation between B4GALT5 gene expression and immune infiltration

2.4 過表達和敲低B4GALT5 基因的人胰腺癌細胞株的構建

首先，以胰腺正常導管細胞HPNE 為對照，在mRNA 和蛋白兩種水平檢測4 種人胰腺癌細胞系（BxPC-3、CFPAC-1、MIA PaCa-2、PANC-1）中B4GALT5 表達情況，結果顯示：相較于HPNE 細胞，B4GALT5 在胰腺癌細胞系中表達升高（圖4A），該變化趨勢與前述的胰腺癌組織中的檢測結果一致。我們選擇其中B4GALT5 表達水平相對較高的CFPAC-1 和MIA PaCa-2 兩株胰腺癌細胞系進行后續(xù)功能實驗。使用過表達質粒和shRNA 質粒轉染細胞，48～72 h后進行定量PCR及Western blot實驗，結果表明：B4GALT5 干擾及B4GALT5 過表達的穩(wěn)轉細胞株構建成功（圖4B～C）。

圖4 定量PCR及Western blot檢測B4GALT5在胰腺癌細胞親本株、干擾或過表達后的表達情況Figure 4 B4GALT5 expression in pancreatic cancer parent strains after interference or overexpression detected by qRT-PCR and Western blot

2.5 B4GALT5促進胰腺癌細胞的侵襲和增殖

接下來，基于構建的干擾和過表達B4GALT5的人胰腺癌細胞系，對其在腫瘤進展中發(fā)揮的功能進行探究，進行CCK-8 細胞增殖實驗。在兩種胰腺癌細胞系中，過表達B4GALT5 可以促進胰腺癌細胞增殖，干擾B4GALT5 則抑制胰腺癌細胞增殖（圖5A～D）。同時，細胞劃痕實驗結果表明：與對照組相比，在CFPAC-1 和MIA PaCa-2 兩種胰腺癌細胞株中，B4GALT5 過表達均可促進細胞的遷移，相反B4GALT5 干擾抑制細胞的遷移（圖5E～F）。Transwell 細胞侵襲實驗結果表明：與對照組相比，B4GALT5 過表達組中穿過基質膠的細胞數(shù)量顯著增加（P＜0.01），相反，在B4GALT5干擾組中穿過基質膠的細胞數(shù)量相較于對照組顯著減少（P＜0.05，圖5G～H）。以上結果說明B4GALT5 促進胰腺癌細胞的增殖和浸潤。

圖5 B4GALT5過表達或干擾對胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響Figure 5 Effects of B4GALT5 overexpression or interference on proliferation,migration and invasion of pancreatic cancer cells

3 討論

胰腺癌是消化道高度惡性腫瘤之一，是人類癌癥死亡的第三大原因，發(fā)病率以每年1.3%的速度增長，起病隱蔽、進展迅速，死亡風險高。胰腺癌預后極差的原因之一是早期缺乏特異性的臨床表現(xiàn)，90%的腫瘤在擴散到胰腺外才被診斷出來，就診時已失去手術切除的機會［18］。異常的糖基化改變被認為是癌癥的一個普遍標志。腫瘤細胞與未轉化的同類細胞相比，顯示出廣泛的糖基化改變［19］，但胰腺癌中的糖基化研究目前僅集中在血清糖蛋白生物標志物中［20］，發(fā)現(xiàn)在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中起作用的新的糖基化基因和探索其作用機制，對找到高特異性及敏感性的診斷標志物和靶向治療具有重要意義［15，21］。

本研究首先通過GGDB網(wǎng)站獲得糖基化相關基因，并從TCGA-GTEx聯(lián)合數(shù)據(jù)庫中檢測其在胰腺癌中的差異表達情況?；趩我蛩谻ox 回歸分析，確定了20 個與預后相關的DE-GRG 用于進一步研究。進行GO和KEGG分析及相關性分析后，最終聚焦于B4GALT5基因上。與癌旁組織相比，該基因在胰腺癌組織中高表達，風險比在這20 個基因中最高，是胰腺癌發(fā)生的高危因素。

B4GALT5是7個β-1，4-半乳糖基轉移酶基因之一，于2005年被首次報道［22］，B4GALT5和B4GALT6負責乳糖神經(jīng)酰胺合酶的產生，其在神經(jīng)節(jié)苷脂生物合成的初始步驟中發(fā)揮作用［23］。在成熟的3T3-L1 脂肪細胞中，腫瘤壞死因子-α誘導的胰島素抵抗伴隨著糖鏈結構的各種變化，包括B4GALT5 的表達增加，這表明B4GALT5 也可能參與炎癥反應過程［24］。此外，B4GALT5參與N-連接寡糖和各種糖脂的合成，有助于形成高度半乳糖基化的細胞表面蛋白，這些蛋白與胚胎外發(fā)育以及宮頸癌［25］和神經(jīng)膠質瘤［26］的發(fā)生有關。近年來，關于B4GALT5的作用機制研究逐漸增加。在乳腺癌中，B4GALT5通過糖基化修飾調節(jié)乳腺癌干細胞，以穩(wěn)定Frizzled-1并激活Wnt/β-catenin 信號，以維持細胞干性［13］。在膀胱癌和肝細胞癌中，B4GALT5可作為致癌基因發(fā)揮促癌作用。B4GALT5 較高的mRNA 表達與較差的總生存率相關。體外實驗表明，B4GALT5的缺失顯著抑制了肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，表明B4GALT5 可能是肝細胞癌的預后生物標志物［14］。使用CDK7 抑制劑可以抑制下游B4GALT5 表達，提高膀胱癌細胞的化療藥物敏感性［27］。此外，B4GALT5 也是幾種明星通路的共同下游靶標。circ_0009910可以通過下調急性骨髓性白血病細胞中的miR-491-5p 來激活PI3K/AKT 信號通路，調節(jié)B4GALT5的表達［28］。SIRT2在去勢抵抗前列腺癌癥和神經(jīng)內分泌前列腺癌癥中過表達，并可通過激活ERK1/2通路和上調B4GLAT5來誘導乳糖神經(jīng)酰胺的產生，促進細胞生長和遷移［29］。

本研究使用2個公共數(shù)據(jù)庫及本中心的胰腺癌組織樣本與對應臨床數(shù)據(jù)，進行了包括臨床亞組分析在內的多層次統(tǒng)計分析，證明：①與癌旁組織相比，B4GALT5 在胰腺癌組織中高表達，提示后續(xù)可以進行血清學檢測，驗證其是否可以作為生物標志物用于早期診斷；②B4GALT5的表達量增高與胰腺癌不良預后呈顯著正相關。B4GALT5 的表達量增高在不同的TNM、年齡、性別、臨床分期組中均能夠作為不良預后的顯著預測因素。進一步，本研究結果還顯示B4GALT5 的表達量增高與多種免疫細胞浸潤呈正相關，其中包括骨髓來源的抑制性細胞與巨噬細胞，但與CD4+T細胞和NK T細胞浸潤呈負相關，提示胰腺癌細胞可能利用B4GALT5與腫瘤微環(huán)境中的各種免疫細胞發(fā)生復雜的互作關系，后續(xù)的深入研究，有可能為胰腺癌的個體化免疫治療與預后改善帶來新思路。此外，通過系列體外功能實驗，本研究初步證明B4GALT5 在促進胰腺癌的增殖、運動與浸潤功能中發(fā)揮重要作用，初步的體內實驗結果也和體外實驗趨勢一致（結果未公布）?？傊?，雖然本研究找到了影響胰腺癌發(fā)生發(fā)展的糖基化修飾中發(fā)揮關鍵作用且未曾報道過的糖基轉移酶，并初步驗證其功能，但是尚未完成系統(tǒng)的體內實驗驗證與糖基化修飾作用具體機制的闡明，因此，本課題組正在計劃開展系統(tǒng)的體內實驗與深入的機制研究。