黃梓熙，孟 琳，陳良標(biāo)*，陳 忠

1上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院心內(nèi)科，上海 201306

心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）的患病率近年來逐步提升，已經(jīng)成為我國重大公共衛(wèi)生問題，每年有2/5的死亡可歸因于CVD［1］。除此之外，CVD的治療費(fèi)用也十分高昂，并且仍在不斷增長［2-3］。因此，CVD 的影響因素和治療方法都需要深入研究。紅細(xì)胞是運(yùn)輸氧氣的載體，血紅蛋白在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用，雖然血紅蛋白水平和CVD之間的關(guān)系仍不明確，但是它與攜氧量、血流量及某些炎癥過程相關(guān)，而有研究顯示，血紅蛋白水平和CVD 之間的關(guān)系并不是線性關(guān)系［4］，而是呈U 型相關(guān)［5］，因此血紅蛋白水平增高或降低都可能與CVD 有密切的關(guān)系［6］，目前對于血紅蛋白水平調(diào)控心血管發(fā)育的機(jī)制研究較少。

斑馬魚基因與人類具有高度的同源性，本研究充分利用斑馬魚易于繁殖、便于在體觀察的特點(diǎn)以及現(xiàn)有成熟的基因操縱技術(shù)，首次在斑馬魚中使用CRISPR/Cas9 技術(shù)對3 號染色體上血紅蛋白基因從hbba2到hbae3的片段進(jìn)行敲除，對基因敲除后斑馬魚的血紅蛋白水平及不同時期心血管發(fā)育進(jìn)行研究，以闡明血紅蛋白水平變化影響心血管發(fā)育的分子機(jī)制，為CVD 的防治提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

鄰聯(lián)茴香胺（o-Dianisidine）粉末（Sigma公司，美國）；rTaq 酶、PrimeScriptTMRT Master Mix 試劑盒、TB Green?Premix Ex TaqTM（TaKaRa 公司，日本）；PBS 緩沖液、甲基纖維素（北京索萊寶）；Tween-20、醋酸鈉、無水乙醇、甘油（上海生工）；30%過氧化氫（上海國藥試劑）；4% PFA（上海Lab Top）；TRIzol（Ambion公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚飼養(yǎng)

AB品系野生型斑馬魚（購于中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所）及kdrl：EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚（購于國家斑馬魚資源中心）在上海海圣斑馬魚養(yǎng)殖循環(huán)系統(tǒng)中按照標(biāo)準(zhǔn)方法飼養(yǎng)。養(yǎng)殖水循環(huán)水溫控制在28 ℃，pH值為7.4±0.2，自動進(jìn)行暗/光循環(huán)（10 h/14 h）。通過自然配對交配獲得斑馬魚胚胎，并將其保存在裝有養(yǎng)殖水的培養(yǎng)皿中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱。斑馬魚胚胎的年齡以受精后小時數(shù)或天數(shù)（hpf或dpf）表示。所有實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)上海海洋大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2.2 CRISPR/Cas9敲除

利用CRISPR/Cas9 技術(shù)［7］對斑馬魚3 號染色體上編碼血紅蛋白的基因片段hbba2到hbae3進(jìn)行雙靶點(diǎn)敲除（圖1）?；蚯贸罄没蚪MDNA提取試劑盒提取DNA，進(jìn)行基因組擴(kuò)增。參照NCBI 上斑馬魚基因序列設(shè)計(jì)引物，并在上海生工公司進(jìn)行合成。分別使用3 對引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，鑒定斑馬魚的基因型。鑒別結(jié)果可分為以下3 種情況，①使用第1 對引物進(jìn)行擴(kuò)增：上游引物H6-1-F（5＇-GTGAAAGGGTGCTGGTTGTT-3＇）；下游引物H5-12-R（5＇-TTAGCTTGCAGAGAGACGGA-3＇）。擴(kuò)增后無條帶則為野生型（WT）斑馬魚；若擴(kuò)增出220 bp的條帶，則說明此斑馬魚為雜合子（Hb+/-）或純合子（Hb-/-），接著再分別使用HB-2-F1（5＇-CAAAGCTTAAATGTTCGTGC-3＇）、HB-2-R1（5＇-CGATGACAATGCTCAGGCAGTC-3＇）和H5-2-F（5＇-GCGTTCAAAACAATGCTCTTC-3＇）、H5-2-R（5＇-GGGTAAACGAACAAAGTCCTGTAAA-3＇）兩對引物擴(kuò)增；②若擴(kuò)增出472 bp和393 bp的目的條帶，則此斑馬魚為雜合子（Hb+/-）；③若擴(kuò)增不出472 bp 和393 bp 的目的條帶，則此斑馬魚為純合子（Hb-/-）。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95 ℃下預(yù)變性5 min；95 ℃下變性30 s，62 ℃（/58 ℃/55 ℃）下退火30 s，72 ℃下延伸30 s，共進(jìn)行35 個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸5 min。PCR產(chǎn)物使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳成像。

圖1 基因敲除及基因型鑒定引物設(shè)計(jì)示意圖Figure 1 Schematic diagram of gene knockout and primer design for genotype identification

1.2.3 固藍(lán)染色

血紅蛋白催化過氧化氫釋放出氧后會使o-Dianisidine 呈現(xiàn)出鐵銹的顏色，根據(jù)這一特性，使用o-Dianisidine 檢測受精卵中血紅蛋白的含量及分布情況。

配制固藍(lán)染液［7］：取0.36 mg o-Dianisidine粉末、13 μL 30%過氧化氫、2 μL 3 mol/L 醋酸鈉（pH4.5）、240 μL無水乙醇，使用ddH2O定容到600 μL。

將敲除得到的雜合突變體斑馬魚（Hb+/-）以及野生型斑馬魚（WT）雌雄各一對分別進(jìn)行自交，所產(chǎn)受精卵收集于不同的培養(yǎng)皿中，同時記錄產(chǎn)卵時間，隨后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別取24、28、30、33、36、48、52 hpf Hb+/-和WT斑馬魚胚胎（n=30），早期胚胎未出膜時，需先將卵膜剝離再進(jìn)行染色。使用o-Dianisidine 染液室溫染色15 min，全程避光，隨后用PBST漂洗3次，每次漂洗3 min，漂洗完成后將受精卵置于4% PFA 中固定超過6 h，PBST 再漂洗3 次，每次3 min，放置在100%的甘油中，顯微鏡觀察染色情況并拍照。

1.2.4 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)

分別將5 月齡Hb+/-和WT 成年斑馬魚（n=10）放在冰上麻醉后，酒精棉球擦拭尾柄取血，吸取2 μL血液在1 mL PBS溶液中混勻后，取1 μL置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上在顯微鏡下計(jì)數(shù)紅細(xì)胞。

1.2.5 血管發(fā)育觀察

分別收集Hb+/-與血管標(biāo)記轉(zhuǎn)基因斑馬魚（kdrl：EGFP）雜交及kdrl：EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚自交的受精卵，記錄產(chǎn)卵時間，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在28、30、32、36、48、72、96、120、144、168 hpf 這10 個時間點(diǎn)在熒光體式顯微鏡（Stemi 2000，ZEISS）下拍照記錄斑馬魚胚胎（n=30）血管發(fā)育情況。

1.2.6 總RNA提取、轉(zhuǎn)錄組測序及分析

用TRIzol法分別提取Hb+/-和WT成年斑馬魚心臟總RNA（n=8×3），使用NanoDrop 2000 Spectrophotometer 檢測總RNA 的濃度和純度，而后使用質(zhì)量濃度為1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA 的提取質(zhì)量。將提取后的總RNA 提交至北京安諾優(yōu)達(dá)公司進(jìn)行mRNA 純化、文庫制備和轉(zhuǎn)錄組測序。使用DESeq2 進(jìn)行差異基因分析，設(shè)置差異倍數(shù)（fold change）＞2 且校正后P＜0.05 檢測差異表達(dá)的基因。使用GOseq 對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO（gene ontology）富集分析，校正基因長度偏差。校正后P＜0.05 的GO 術(shù)語被認(rèn)為在差異表達(dá)基因中顯著富集。我們還使用KOBAS 軟件進(jìn)行了京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路中差異表達(dá)基因的富集統(tǒng)計(jì)。

1.2.7 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）驗(yàn)證基因表達(dá)

使用PrimeScriptTMRT Master Mix 試劑盒反轉(zhuǎn)錄心臟總RNA 為cDNA。TB Green?Premix Ex TaqTM用于qRT-PCR?；驍U(kuò)增和檢測使用CFX Opus 96 Real-Time PCR系統(tǒng)進(jìn)行。使用2-ΔΔCT方法計(jì)算相對于對照組mRNA表達(dá)的基因表達(dá)水平。用于qRTPCR 的引物：hbba2，5＇-ATTGCGAGTGTCTGGAG-3＇和5＇-CCGTGTTCTGAAACTTTGG-3＇；hif3a（hif1al），5＇-GCTGGATGGCTTGTCTGATGG-3＇和5＇-CCCTCATGAGAGCTGCTGTG-3＇；nos2b，5＇-AAGCCCCGACTCTACTCCAT-3＇和5＇-TGGACCTTTTCCCTCCTGTG-3＇；cybb，5＇-CTTTCGTTATGAAGCGGTGATG-3＇和5＇-GGTTCTCCTGGACGTGTTTAT-3＇；tnnt2c，5＇-GACCGAACGTGAGAAGAAGA-3＇和5＇-AGGACTTCCTGGTGGTTTTC-3＇；β-actin，5＇-TACAATGAGCTCCGTGTTGC-3＇和5＇-ACATACAATGGCAGGGGTGTT-3＇。β-actin作為mRNA的內(nèi)參基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism9 對所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪圖。所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。通過t檢驗(yàn)比較兩組間差異。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRISPR/Cas9構(gòu)建Hb+/-突變體

將CRISPR/Cas9 靶點(diǎn)分別設(shè)計(jì)在hbba2基因第2 外顯子和hbae3基因第2 外顯子的反義鏈上。將Cas9 蛋白和gRNA 混合注入一細(xì)胞期的斑馬魚胚胎，取發(fā)育至96 hpf 的F0 胚胎基因組PCR 純化產(chǎn)物進(jìn)行測序，并采用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，突變型在220 bp 處出現(xiàn)1 個條帶，野生型無條帶。F0 斑馬魚性成熟后與野生型斑馬魚雜交產(chǎn)生F1代，3 個月后對其剪尾鑒定，將PCR 純化產(chǎn)物進(jìn)行測序，經(jīng)序列比對及瓊脂糖凝膠電泳分析（圖2），表明成功篩選出從hbba2到hbae3缺失的雜合突變體。

圖2 可遺傳的F0代及F1代突變體篩選Figure 2 Screening of heritable F0 and F1 generation mutants

2.2 對斑馬魚胚胎血紅蛋白水平的影響

選取多個時間點(diǎn)對斑馬魚胚胎進(jìn)行固藍(lán)染色。24 hpf WT斑馬魚顯示少數(shù)o-Dianisidine陽性細(xì)胞，而Hb+/-未有陽性顯示；28、30、33、36 hpf時與WT斑馬魚相比，Hb+/-血紅蛋白明顯減少（圖3A～D），36 hpf 時WT 斑馬魚胚胎在心臟位置顯示強(qiáng)烈的染色陽性，相反，Hb+/-只有個別胚胎在該位置顯示陽性；當(dāng)斑馬魚胚胎發(fā)育至48 hpf以后，血紅蛋白的表達(dá)量趨近一致，從染色結(jié)果來看，WT 斑馬魚胚胎的血紅蛋白在腹部的分布比Hb+/-更分散，50 hpf可以明顯觀察到血紅蛋白的異位表達(dá)，WT 的血紅蛋白主要分布在斑馬魚上腹部橫向斑紋的上方，而在Hb+/-中主要分布于其下方（圖3E）。

圖3 斑馬魚胚胎不同發(fā)育時期固藍(lán)染色Figure 3 o-Dianisidine staining of zebrafish embryos at different developmental stages

2.3 對成年斑馬魚紅細(xì)胞發(fā)育的影響

對5 月齡Hb+/-和WT 成年斑馬魚紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果表明兩者之間的紅細(xì)胞數(shù)量沒有顯著差異（P＞0.05），但是將雌、雄斑馬魚的紅細(xì)胞數(shù)量分開統(tǒng)計(jì)對比發(fā)現(xiàn)，Hb+/-雌魚紅細(xì)胞數(shù)量增多、雄魚紅細(xì)胞數(shù)量減少（P均＜0.05，圖4）。

圖4 5月齡斑馬魚紅細(xì)胞統(tǒng)計(jì)分析Figure 4 Statistical analysis of erythrocytes in 5-month-old zebrafish

2.4 對斑馬魚胚胎血管發(fā)育的影響

將血管標(biāo)記轉(zhuǎn)基因斑馬魚（kdrl：EGFP）與Hb+/-雜交后收集受精卵，28 ℃恒溫培養(yǎng)至24 hpf，挑選帶有綠色熒光的血管標(biāo)記的胚胎繼續(xù)培養(yǎng)。結(jié)果顯示，28、30、32 hpf Hb+/-斑馬魚胚胎腹部與心臟相接的主血管及共同基靜脈（common cardinal vein，CCV）較WT均發(fā)育遲緩（圖5A～C），腹部大血管發(fā)育遲緩的情況一直持續(xù)到36 hpf（圖5D），但48 hpf后，Hb+/-與WT 斑馬魚的血管發(fā)育趨近一致，且未能觀察到明顯的差異。與WT 的血管發(fā)育相比，48 hpf 時Hb+/-的節(jié)間血管（intersegmental vessel，ISV）橫向分支發(fā)育緩慢（圖5E），3 dpf時Hb+/-的腸下靜脈（subintestinal vein，SIV）發(fā)育更快（圖5F）；4～7 dpf Hb+/-的ISV發(fā)育異常，且觀察到尾部出現(xiàn)了血管增生，Hb+/-比WT多1對ISV（圖5G）；背長軸血管（dorsal longitudinal anastomotic vessel，DLAV）在整個發(fā)育過程中并未受到影響。另外，Hb+/-和WT 的腹部和背部的拍照結(jié)果并未顯示差異。

圖5 斑馬魚胚胎及幼魚血管發(fā)育Figure 5 Vascular development of zebrafish embryos and larvae

2.5 成魚心臟轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果及qRT-PCR驗(yàn)證

為了闡明血紅蛋白基因大片段敲除影響心血管發(fā)育的機(jī)制，我們使用RNA 測序?qū)b+/-心臟和WT心臟進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。在Hb+/-斑馬魚心臟中共鑒定出1 675個差異表達(dá)基因，包括794個上調(diào)基因和881個下調(diào)基因（圖6A）。hbba2是下調(diào)幅度最大的基因之一。用上調(diào)和下調(diào)的基因生成了熱圖以說明Hb+/-斑馬魚心臟的轉(zhuǎn)錄譜（圖6B）。KEGG注釋的分子通路分析顯示，血紅蛋白敲除影響氧化磷酸化、心肌收縮、HIF1 信號通路和壞死性凋亡等通路（圖6C）。血紅蛋白水平降低，導(dǎo)致心臟供氧不足，缺氧誘導(dǎo)因子HIF1信號通路中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（NOS2/iNOS）編碼基因nos2b顯著上調(diào)以及缺氧誘導(dǎo)因子HIF3α編碼基因hif1al（hif3a）的顯著下調(diào)。此外，缺氧還導(dǎo)致NADPH 氧化酶2（NOX2）編碼基因cybb和肌鈣蛋白T2（TNNT2）編碼基因tnnt2c顯著上調(diào)（圖6D）。qRT-PCR 分析結(jié)果也證實(shí)了Hb+/-中hbba2和hif1al顯著下調(diào)，nos2b、cybb及tnnt2c顯著上調(diào)（P＜0.001，圖6E）。氧化磷酸化通路中其復(fù)合物Ⅰ～Ⅳ（電子傳遞鏈的組成成員）相關(guān)基因顯著下調(diào)，復(fù)合物Ⅴ（ATP合酶）相關(guān)基因顯著上調(diào)（圖6F），提供ATP 的合成質(zhì)子動力減弱，ATP 合酶表達(dá)量增多。

圖6 成年斑馬魚心臟轉(zhuǎn)錄組分析及差異基因qRT-PCR的驗(yàn)證Figure 6 Transcriptome analysis and qRT-PCR verification of adult zebrafish hearts

3 討論

血紅蛋白在機(jī)體中承擔(dān)著運(yùn)輸氧的功能，其將氧氣輸送到組織，再將二氧化碳輸送到肺部進(jìn)行氣體交換，血紅蛋白的濃度與CVD有著密切聯(lián)系。研究表明，高濃度血紅蛋白可引起血管收縮、血壓升高［8］；低色素性貧血則是因?yàn)榍虻鞍椎暮铣蓽p少或鐵吸收減少［9］。紅細(xì)胞生成刺激劑（erythropoiesis stimulating agents，ESA）是臨床上治療貧血的常用藥物，ESA 治療會增加高血壓和血栓的風(fēng)險，并且可能會導(dǎo)致純紅細(xì)胞再生障礙性貧血（pure red cell aplasia，PRCA）［10］，因此血紅蛋白基因調(diào)控機(jī)制對臨床上治療貧血及CVD 有指導(dǎo)意義。而體內(nèi)完全不含血紅蛋白的南極冰魚的相關(guān)研究，則為實(shí)驗(yàn)室血紅蛋白雜合突變體斑馬魚的構(gòu)建提供了可能性［11-12］。

斑馬魚是一種與哺乳動物類似，適合于研究人類CVD的模式生物，現(xiàn)已成功建立多種CVD斑馬魚模型，如動脈粥樣硬化、擴(kuò)張性心肌病和先天性心臟缺陷等疾病模型［13-14］。目前對CVD 的機(jī)制研究多集中于與線粒體能量代謝以及微小RNA 調(diào)控的關(guān)系［15-16］，而對血紅蛋白基因影響心血管發(fā)育的機(jī)制鮮有研究。斑馬魚的紅細(xì)胞與人類一樣含有血紅蛋白，且斑馬魚的α-珠蛋白和β-珠蛋白位于同一染色體上，并且按照胚胎期到成熟期的表達(dá)順序排列［17］。本研究首次使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對斑馬魚3 號染色體血紅蛋白基因hbba2到hbae3進(jìn)行了大片段的敲除，利用斑馬魚與人類基因的高度同源性［18］對該基因片段的缺失進(jìn)行功能學(xué)研究。

固藍(lán)染色結(jié)果表明，Hb+/-斑馬魚胚胎與WT 胚胎相比，血紅蛋白水平更低，分布較分散，同時還觀察到血紅蛋白的異位分布，這與已有研究結(jié)果相一致［7，11］，敲除hbae3基因或hbae1.1基因都對血紅蛋白的生成有著明顯影響。對于血紅蛋白分布的差異，推測是由于血管發(fā)育的差別導(dǎo)致的，在固藍(lán)染色結(jié)果的基礎(chǔ)上利用kdrl：EGFP轉(zhuǎn)基因型斑馬魚與Hb+/-進(jìn)行雜交后觀察血管的發(fā)育，結(jié)果證實(shí)，Hb+/-的血管發(fā)育延遲明顯，且能觀察到Hb+/-血管管徑有增大的趨勢以及節(jié)間血管的增生。血管和血細(xì)胞擁有類似的發(fā)育機(jī)制，且只有同步發(fā)育才能滿足機(jī)體的需要［19］，這個結(jié)論與本研究結(jié)果相符，當(dāng)血紅蛋白的數(shù)量顯著減少時會明顯影響到同期血管的發(fā)育。ISV 的增生則可能是為了補(bǔ)償紅細(xì)胞和血管發(fā)育異常產(chǎn)生的不利影響，保證機(jī)體的正常發(fā)育和運(yùn)行，血管發(fā)育發(fā)生了代償。紅細(xì)胞內(nèi)的α-珠蛋白和β-珠蛋白合成的平衡對血紅蛋白的功能至關(guān)重要［20］，兩者對血紅蛋白疾病的分子遺傳學(xué)機(jī)制有極其重要的意義，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，WT和Hb+/-成魚的紅細(xì)胞數(shù)量沒有顯著差異，但是統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示出明顯的雌、雄紅細(xì)胞數(shù)量兩極分化，于是將雌魚與雄魚分開比較，發(fā)現(xiàn)Hb+/-雌魚的紅細(xì)胞顯著增多，而雄魚的紅細(xì)胞顯著減少，導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因及機(jī)制仍不清楚。

為了探究血紅蛋白基因影響心血管發(fā)育的機(jī)制，本研究取成年斑馬魚的心臟進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，并對測序結(jié)果進(jìn)行了KEGG 富集分析，發(fā)現(xiàn)了50 個顯著富集的信號通路?；趆bba2到hbae3血紅蛋白基因敲除后導(dǎo)致血紅蛋白含量降低、紅細(xì)胞數(shù)量不變及血管發(fā)育異常的現(xiàn)象，我們整理了Hb+/-中18個可能與心血管發(fā)育有關(guān)的信號通路，并對與能量代謝密切相關(guān)的氧化磷酸化途徑、缺氧誘導(dǎo)因子HIF1信號通路、心肌收縮及壞死性凋亡通路和關(guān)鍵基因展開分析。血紅蛋白水平降低會導(dǎo)致機(jī)體缺氧，而缺氧會引起心臟氧化應(yīng)激和炎癥及心肌細(xì)胞死亡［21］。HIF1信號通路是缺氧誘導(dǎo)的主要通路，除了HIF1α和HIF2α之外，HIF3α也是HIFα家族的確定成員，hif3a（hif1al）的缺失會減弱斑馬魚的缺氧耐受性并破壞紅細(xì)胞的生成，研究發(fā)現(xiàn)hif3a敲除后的斑馬魚耗氧率降低［22］。并且HIFα可以增加一氧化氮合酶的表達(dá)［22］，過表達(dá)nos2a可減輕cbs和cth突變體中的腦血管發(fā)育缺陷［23］，nos2bmRNA 的過度表達(dá)可恢復(fù)tnnt2a或klf2a突變體中的血管缺陷［24］，提示HIF3α表達(dá)量下調(diào)可以減少機(jī)體的耗氧量，并且通過HIF1 信號通路誘導(dǎo)NOS2 顯著上調(diào)，促進(jìn)血管發(fā)育，以提高機(jī)體的缺氧耐受性。ALAS1是血紅素合成的限速酶［25］，推測可能是通過alas1的上調(diào)補(bǔ)償了hbba2及hif1al下調(diào)對紅細(xì)胞生成造成的影響。NOX 家族的線粒體呼吸鏈和NADPH 氧化酶是心肌細(xì)胞中ROS 的主要來源，NOX 亞型NOX1、NOX2、NOX4 和NOX5 在心血管系統(tǒng)中表達(dá)，其中，NOX1、NOX2 和NOX4 在心肌細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生的ROS 進(jìn)一步導(dǎo)致心肌細(xì)胞的氧化損傷［26］，而肌鈣蛋白是心肌損傷的標(biāo)志物，TNNT2的升高提示心肌損傷或壞死［27-28］，這與本研究分析的結(jié)果一致。在缺氧條件下為了維持ATP的產(chǎn)生以保護(hù)組織功能，線粒體可通過g0s2的表達(dá)等效質(zhì)子動力，表達(dá)g0s2的心肌細(xì)胞群體在常氧和缺氧條件下ATP 的合成都增加［29］，復(fù)合物Ⅰ～Ⅳ的顯著下調(diào)而復(fù)合物Ⅴ的顯著上調(diào)，可能是線粒體的代償保護(hù)機(jī)制，具體途徑需要進(jìn)一步研究。

另外，本研究中雖然敲除了hbba2到hbae3的血紅蛋白基因，但是尚未獲得純合突變體，根據(jù)Hb+/-胚胎基因型的鑒定情況，WT、Hb+/-、Hb-/-比例嚴(yán)重失衡，推測是卵子產(chǎn)生攜帶敲除片段與不攜帶敲除片段配子的比例失衡，導(dǎo)致產(chǎn)生的后代中極少有純合子，而產(chǎn)生的個別純合子也因發(fā)育不全而在早期死亡，具體機(jī)制有待后續(xù)進(jìn)一步研究和探索。

本研究對斑馬魚3號染色體血紅蛋白基因進(jìn)行了全序列敲除，其中既含有胚胎時期表達(dá)的血紅蛋白基因（hbbe1、hbae1和hbae3）又包含了成年時期的血紅蛋白基因（hbba2、hbaa2、hbaa1、hbba1），同時包含α和β亞基的成員，分別對胚胎和成年斑馬魚進(jìn)行觀察和分析，發(fā)現(xiàn)血紅蛋白水平降低會影響斑馬魚心血管的發(fā)育，但是斑馬魚機(jī)體的補(bǔ)償機(jī)制使其能維持正常生理活動，了解其中的分子機(jī)制可以為臨床治療CVD提供新方向。