叢林海 ，湯 勇 ，殷家志 ，鄧 苙 ，高慧芳 ，方紅麗 ，李 昕

（1）昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科;2）健康管理中心;3）檢驗科，云南 昆明 650032）

聽力損失影響著全球約15 億人，而在中國所有年齡段中就有約2 億多人，這些病例中有大約一半被認為是遺傳性的[1-2]。在遺傳性耳聾的基因變異中，SLC26A4 是除GJB2 外最常見的耳聾致病基因，是導致大前庭導水管綜合征（large vestibular aquduct syndrome，LVAS）的致病基因，在聾人中占19.4%，正常人群中的攜帶率為2%，典型表現(xiàn)為兒童時期的聽力損失，90%的患者為雙側(cè)性，聽力損失程度不一，病程一般為進行性或波動性聽力下降，在跌倒、撞擊等行為時易致明顯的不可逆的聽力下降[3]。在此種情況下，找到能對SLC26A4 基因進行調(diào)控的方法就顯得尤為重要。目前對于聽力損失的治療方案仍然局限于聲音放大和人工耳蝸植入，但是聽力恢復遠非完美，特別是對嘈雜環(huán)境中的聲音的感知[4-5]。這就迫切需要找到針對人類聽力損失的生物治療方法，去尋找并開發(fā)針對于各種類型聽力損失的基因、細胞和藥物療法，從而為廣大聽力損失患者提供新的治療手段和決策。miRNAs 已被證實廣泛存在于不同的細胞和組織中，在細胞周期、細胞凋亡、腫瘤發(fā)生和神經(jīng)發(fā)生等生物學過程中發(fā)揮重要作用，有許多研究表明miRNA 的異常導致了耳聾的發(fā)生，而關(guān)于miR-26a-5p 與耳聾的機制研究非常少，因此，本文擬對miR-26a-5p 調(diào)控SLC26A4 表達在聽力減退中的作用做一研究，以期能為SLC26A4 基因突變導致的耳聾的治療提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物及分組本實驗所使用的SPF 級別雄性C57 小鼠（標準體重）均購自于昆明醫(yī)科大學實驗動物學部，本研究的實驗方法和操作方法均已得到昆明醫(yī)科大學實驗動物福利委員會的批準。所有小鼠都飼養(yǎng)于實驗動物學部，飼養(yǎng)環(huán)境均符合相關(guān)標準。18 只C57 小鼠被分為3 組，為假手術(shù)組、聽力損傷組和耳聾組。假手術(shù)組是注射生理鹽水，而不注射致聾藥物D-半乳糖。

1.1.2 實驗試劑D-半乳糖購自于山東萍聚生物科技有限公司，氯化鈉注射液（Nacl）購自于云南南詔藥業(yè)有限公司，無水乙醇、三氯甲烷、異丙醇均購自于天津市瑞明威化工有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PerfectStartUniRTKIT）和qPCR 擴增試劑盒（PerfectStartUnigPCRKIT）均購自于昆明云科生物技術(shù)有限公司，異氟烷購自于深圳瑞沃德生命科技有限公司，miR-26a-5p 和SLC26A4 引物均購自于安徽九德科技有限公司，miR-26a-5p 和SLC26A4 的干擾和過表達載體均購自于廣州銳博生物有限公司。

1.1.3 實驗設(shè)備高速低溫離心機購自于湖南赫西儀器裝備有限公司，熒光定量PCR 儀和酶標儀購自于美國伯樂公司，TDT 聽覺誘發(fā)電位工作站購自于北京愛生科貿(mào)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型構(gòu)建參照郝帥的D-半乳糖造模方法[6]進行一定改良，觀測指標為：小鼠活動是否遲緩，小鼠雙側(cè)耳廓反應(yīng)是否靈敏。對聽力損傷模型制造組給予100 mg/kg 的量進行腹腔注射給D-半乳糖，耳聾模型制造組給D-半乳糖150 mg/kg的量，假手術(shù)組根據(jù)小鼠的體重比例，腹腔注射同等量的Nacl 注射液。以上注射時間均為每天2 次，持續(xù)1 個月。

1.2.2 聽性腦干反應(yīng)測試（ABR）本實驗在隔聲屏蔽室內(nèi)進行測試，通過不同頻率的刺激信號在8 kHz、16 kHz、24 kHz 和32 kHz 時誘導小鼠在麻醉狀態(tài)下的電生理反應(yīng)，儀器通過平均技術(shù)進行相關(guān)信號處理，通過解析聽性腦干反應(yīng)測試頻譜中8 個諧波的相位和幅度，采用序貫檢驗的方法來消除持續(xù)的EEG 噪聲和診斷聽力的其他干擾。刺激聲音強度以5 dB 依次遞減，如果能分辨出最低刺激強度的即為ABR 閾值，重復3 次。

1.2.3 注射治療對聽力損傷和耳聾模型小鼠進行尾靜脈注射miR-26a-5p 和SLC26A4 的干擾和過表達載體，每天1 次，持續(xù)10 d。

1.2.4 小鼠耳蝸取材在實驗達到終止階段，對所有小鼠進行異氟烷吸入過度麻醉處死，然后取出小鼠兩側(cè)聽泡，放入液氮中保存用于后續(xù)qPCR 實驗。

1.2.5 qPCR 實驗在Pubmed 官網(wǎng)上下載miR-26a-5p 及內(nèi)參U6 和SLC26A4 及內(nèi)參β-actin 的核酸序列，通過PrimerPremier 6 軟件對它們的引物序列進行設(shè)計，將引物序列發(fā)九德科技有限公司進行合成，具體序列見表1。使用電動研磨液對小鼠的耳蝸進行研磨處理，使用Trizol 法對耳蝸組織進行總RNA 的提取。得到總RNA 后，使用酶標儀測定RNA 的濃度及純度，并根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒PerfectStartUniRTKIT 說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再根據(jù)熒光定量試劑盒PerfectStartUnig-PCRKIT 說明書進行PCR 擴增反應(yīng)，得到PCR 擴增的CT 值后根據(jù)2-△△CT 公式來計算miR-26a-5p 和SLC26A4 的相對表達量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3 統(tǒng)計學處理

所有的實驗數(shù)據(jù)都使用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計分析，通過獨立樣本t 檢驗統(tǒng)計2 組之間（antagomir 和agomir 注射后小鼠miR-26a-5p 和SLC26A4 的相對表達量）的數(shù)據(jù)，通過單因素方差分析統(tǒng)計3 組及3 組以上（18 只小鼠聽性腦干測試及小鼠miR-26a-5p 和SLC26A4 的相對表達量）的數(shù)據(jù)，而后根據(jù)方差齊性檢驗比較組內(nèi)差異，P＜ 0.05 即表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠聽力損傷模型和小鼠耳聾模型構(gòu)建成功

使用聽性腦干反應(yīng)測試來檢測各組C57 小鼠的右耳聽力情況，結(jié)果顯示，無論是8 kHz、16 kHz、24 kHz 還是32 kHz，同組之間的小鼠之間的聽力閾值無明顯差異，但是相對于假手術(shù)組來說，聽力損傷和耳聾小鼠聽力閾值明顯提高，耳聾小鼠閾值有顯著的翻倍，見圖1，結(jié)果表明模型構(gòu)建成功。

圖1 聽力損傷和耳聾小鼠模型的鑒定Fig.1 Identification of mouse model of hearing loss and deafness

2.2 小鼠聽力損傷和耳聾后miR-26a-5p 下調(diào)和SLC26A4 上調(diào)

在使用qPCR 實驗檢測小鼠聽力損傷和耳聾后耳蝸中miR-26a-5p 和SLC26A4 的表達情況后發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，miR-26a-5p 在小鼠聽力損傷和耳聾后表達異常，出現(xiàn)明顯降低，見圖2A；相反的是SLC26A4 的表達卻明顯升高，見圖2B。

圖2 miR-26a-5p 和SLC26A4 在聽力損傷和耳聾小鼠耳蝸中的表達Fig.2 Expression of miR-26a-5p and SLC26A4 in the cochlea of mice with hearing impairment and deafness

2.3 miR-26a-5p 可以靶向調(diào)控SLC26A4 的表達

使用TargetScan 網(wǎng)站（https://www.targetscan.org/vert_72/）對miR-26a-5p 和SLC26A4 的靶向結(jié)合位點進行生信預測，結(jié)果顯示miR-26a-5p 和SLC26A4 可以靶向結(jié)合，結(jié)合位點共有7 對堿基，見圖3A。通過熒光素酶報告基因?qū)嶒瀬頇z測miR-26a-5p 和SLC26A4 兩者之間是否靶向結(jié)合，可以看到野生型SLC26A4 組熒光素酶活性與對照組相比明顯降低，而突變型SLC26A4 無明顯差異，見圖3B。對C57 小鼠分別注射miR-26a-5p 的antagomir 和agomir，而后對小鼠的耳蝸使用qPCR 實驗檢測miR-26a-5p 和SLC26A4 的表達量，結(jié)果顯示，miR-26a-5p 的antagomir 可以顯著降低miR-26a-5p 的表達，而SLC26A4 正好相反；此外agomir 明顯提高了miR-26a-5p 的表達，同時也抑制了SLC26A4 的表達，見圖3C 和圖3D。

圖3 miR-26a-5p 可靶向SLC26A4 調(diào)控其表達Fig.3 miR-26a-5p targets SLC26A4 and regulates its expression

2.4 miR-26a-5p 調(diào)控SLC26A4 改善了聽力減退

通過分別給聽力損傷小鼠注射miR-26a-5p的干擾和過表達載體以及SLC26A4 的干擾和過表達載體，繼而使用ABR 監(jiān)測小鼠的聽力閾值情況，結(jié)果顯示，si-SLC26A4 和miR-26a-5p agomir 可以顯著降低小鼠的聽力閾值，見圖4A 和圖4B，這表明miR-26a-5p 可以通過調(diào)控SLC26A4 達到改善小鼠聽力減退的功能。

圖4 miR-26a-5p 調(diào)控SLC26A4 達到改善小鼠聽力減退Fig.4 miR-26a-5p regulates SLC26A4 to improve hearing loss in mice

3 討論

遺傳性耳聾在出生缺陷中已經(jīng)是一種非常常見的臨床現(xiàn)狀，許多與耳聾（聽力損傷）相關(guān)的基因已經(jīng)被陸續(xù)確定[7]，這就表明致病基因的檢測在未來先天性耳聾患者中進行醫(yī)學檢查是不可或缺的[8]。第一個miRNA 在1993 年被發(fā)現(xiàn)，miRNA可以結(jié)合到mRNA 上，導致靶mRNA 完全降解，從而使得靶mRNA 的翻譯受到抑制[9-10]。miRNAs已被證實廣泛存在于不同的細胞和組織中，在細胞周期、細胞凋亡、腫瘤發(fā)生和神經(jīng)發(fā)生等生物學過程中發(fā)揮重要作用[11]，同樣在遺傳性耳聾中也擔任重要的角色[12]。有許多研究表明miRNA的異常導致了耳聾的發(fā)生，如Mohammad-Reza發(fā)現(xiàn)miR-183 的異常會導致毛細胞逐漸失去頂端結(jié)構(gòu)，聽力閾值增加，而通過提高miR-183 家族在聽細胞中的水平，可以恢復耳尖結(jié)構(gòu)和聽力[13]。而關(guān)于miR-26a-5p 與耳聾的機制研究非常少，這就值得筆者去探究miR-26a-5p 在耳聾中是什么樣的作用。本研究發(fā)現(xiàn)miR-26a-5p 在小鼠聽力損傷后尤其是耳聾后表達異常的降低，在小鼠體內(nèi)增加其表達后發(fā)現(xiàn)小鼠聽力閾值變得更高，聽力損傷加重，這些結(jié)果都說明miR-26a-5p 是耳聾的潛在保護基因。

SLC26A4 是溶質(zhì)載體家族的一員，是一種pendrin 蛋白編碼基因，主要在甲狀腺、內(nèi)耳和腎臟中表達[14]。已有許多研究表明該基因的致病性變異可導致耳聾伴前庭導尿管增大（EVA），包括感音神經(jīng)性聽力損失[15-16]。本次研究發(fā)現(xiàn)了SLC26A4 在小鼠聽力損傷后表達異常高，且miR-26a-5p 可以靶向調(diào)節(jié)SLC26A4 的相關(guān)表達。在小鼠體內(nèi)提高miR-26a-5p 的表達后，SLC26A4表達明顯受到抑制，此外筆者發(fā)現(xiàn)小鼠的聽力減退得到了改善。同時筆者在小鼠體內(nèi)抑制掉SLC26A4 表達，結(jié)果與上面一致，這表明SLC26A4 是耳聾的致病基因，會引起一系列的聽力損傷。

綜上所述，miR-26a-5p 可以通過調(diào)控SLC26A4從而挽救聽力減退，SLC26A4 是耳聾中導致聽力減退的罪魁禍首之一，而通過miR-26a-5p 吸附SLC26A4 靶向抑制其表達后在小鼠動物實驗中可以有效改善聽力損傷。本次研究從miRNA 調(diào)控靶mRNA 表達機制研究，揭示了miR-26a-5p 調(diào)控SLC26A4 的作用機制，為miR-26a-5p 和SLC26A4 在遺傳性耳聾的基因治療中提供一定的科學依據(jù)。