陸霓虹，劉洪璐，陳楊君，劉梅艷，楊永銳，杜映榮

（昆明市第三人民醫(yī)院，云南省傳染性疾病臨床醫(yī)學(xué)中心，云南 昆明 650041）

抗結(jié)核藥物導(dǎo)致的肝損傷發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響結(jié)核病患者的治療效果，延長患者治療時間，導(dǎo)致耐藥結(jié)核病的發(fā)生[1]。抗結(jié)核藥物性肝損傷（anti-tuberculosis drug-induced liver injury，ATB-DILI）的發(fā)生機制不明，目前有炎癥機制、免疫機制等理論學(xué)說，但均未得到研究證實[2]。國內(nèi)研究有異煙肼（INH）、利福平（RIF）單藥導(dǎo)致的肝損傷小鼠模型，INH 聯(lián)合RIF 的肝損傷小鼠模型報道[3]，但未見四聯(lián)抗結(jié)核藥物（異煙肼+利福平+乙胺丁醇+吡嗪酰胺，INH+RIF+EB+PZA）的肝損傷小鼠模型，尤其是經(jīng)牛分枝桿菌減毒株卡介苗（bacillus Calmette-Guérin，BCG）滴鼻建立結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染的ATB-DILI 小鼠模型。本研究通過建立單藥、四聯(lián)抗結(jié)核藥物導(dǎo)致的感染MTB 肝損傷小鼠模型，分析其不同病理表現(xiàn)及原因，進(jìn)一步探討ATBDILI 發(fā)生機制，為防治ATB-DILI、避免耐藥結(jié)核病發(fā)生打下前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

藥物與試劑：藥物選擇：異煙肼片（isoniazid，INH，每片0.1 g，批號：H51020788）、利福平膠囊（rifampicin，RIF，每粒0.15 g，批號：H51020786）、鹽酸乙胺丁醇片（ethambutol hydrochloride，EB，每片0.25 g，批號：H51020917）、吡嗪酰胺片（pyrazinamide，PZA，每片0.25 g，批號H51020877）均為成都錦華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。根據(jù)動物與人體的每公斤體重劑量折算系數(shù)，查60 kg 成人與2 g小鼠折算系數(shù)為9.01，得出小鼠藥物給藥劑量為：異煙肼45 mg/（kg·d）（INH）、利福平90 mg/（kg·d）（RIF）、乙胺丁醇135 mg/kg·d（EB），吡嗪酰胺180 mg/（kg·d）（PZA）[4]。臨用前，用0.5% CMC配成所需濃度的混懸液備用。

試劑選擇:谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（Glutamyltransferase，GGT，試劑號：CH01070011）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase，ALT，試劑號：CH01070012）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase，AST，試劑號：CH01070022）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL，試劑號：CH0107003）、（alkaline phosphatase，ALP，試劑號：CH0107001），測定試劑盒均購自廣東省西隴化工科學(xué)股份有限公司。牛分枝桿菌減毒株卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG，試劑號：S20123007，成都生物制品研究所）。

1.2 實驗動物

動物類型：昆明種（KM）小鼠，SPF 級，♂，體質(zhì)量（18～24）g，由中國科學(xué)院昆明動物所實驗動物中心提供，合格證號：YNXY（滇）-2019-22。小鼠飼養(yǎng)于中國科學(xué)院昆明動物所實驗動物中心屏障系統(tǒng)，合格證號：（昆）-2019-103，室溫（21～26）℃，濕度（55～65）%，明暗各12 h。

1.3 實驗儀器

LST-008 型全自動生化分析儀（日本日立株式會社），Leica RM2135，Germany 石蠟切片機，Leica EG1160，Germany 石蠟包埋機，Leica CM 1900，Germany 冰凍切片機、闊?？萍糑H-TK 組織脫水機、青島海爾電冰箱股份有限公司4℃/-20℃電冰箱等。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組與指標(biāo)檢測感染BCG 實驗步驟：150 只小鼠分為2 組，25 只設(shè)為對照組，125 只設(shè)為BCG 感染組。BCG 組每只小鼠經(jīng)鼻腔滴入1×107CFU 的BCG，4 周后隨機抽取5 只BCG 感染的小鼠，及5 只對照組小鼠取樣檢測。肺組織病理切片及菌落計數(shù)證實BCG 組小鼠感染結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB），對照組未發(fā)現(xiàn)感染MTB，證實感染MTB 小鼠模型建立成功。

抗結(jié)核藥物性肝損傷小鼠模型建立步驟：100 只感染MTB 小鼠隨機分為5 組，每組20 只。每組抽取5 只，按照用藥設(shè)為INH 組、RIF 組、EB 組、PZA 組、四聯(lián)組。5 組分別單次灌胃給藥INH、RIF、EB、PZA 及四聯(lián)抗結(jié)核藥物12 h 后，稱體重，斷頭取血，全自動生化儀檢查ALT、AST、ALP、TBIL、GGT。取肝臟，計算肝指數(shù)及分析肝臟病理改變。剩余每組15 只小鼠同樣按照用藥分為3 個亞組，每組5 只，分別給予INH、RIF、EB、PZA 及四聯(lián)抗結(jié)核藥物后1 周取樣、2 周取樣、3 周取樣及檢測。感染MTB 小鼠20 只設(shè)為MTB 感染組，未感染MTB 小鼠20 只設(shè)為對照組，2 組按照實驗時間分為4 組，每組5 只，跟隨實驗組時間進(jìn)行喂養(yǎng)及取樣對比。本研究經(jīng)昆明市第三人民醫(yī)院倫理委員會審批同意（201902313）。

肝臟病理制片：取小鼠肝臟稱濕重，計算其臟器指數(shù)，肝指數(shù)（Live index）=肝濕質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%。取5 g 小鼠肝臟4 ℃冰浴滅菌生理鹽水沖洗，常規(guī)脫水，石蠟包埋后采用石蠟切片機進(jìn)行連續(xù)切片，厚度約為4 μm，HE 染色后用中性樹膠50 μL 進(jìn)行封片。每張切片均用顯微鏡進(jìn)行20 倍鏡下觀察病變范圍，40 倍鏡下觀察病變組織形態(tài)，并留存圖片。由病理學(xué)專家在顯微鏡下根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行盲法評分（評分標(biāo)準(zhǔn)參照表1）。

表1 病理觀察結(jié)果分級（%）Tab.1 Classification of pathological observation results（%）

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)均用SPSS26.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)均用表示，組間差異采用SNK-q檢驗。偏態(tài)分布的計量資料以“中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（Q1，Q3）]” 描述，組間差異的比較采用Kruskal-WallisH秩和檢驗，總體差異的比較選用Kruskal-wallis 單因素ANOVA（k樣本）檢驗。相關(guān)性分析采用spearman相關(guān)性分析，P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠模型的肝臟表觀特征和病理改變

比較小鼠肝臟平鋪面積發(fā)現(xiàn)，感染MTB 前后小鼠肝臟體積無明顯改變（P＞ 0.05），灌胃藥物2周后，除EB 組外，小鼠肝臟平鋪面積較MTB 感染組、對照組均明顯增大（P＜ 0.05），見圖1。

圖1 不同抗結(jié)核藥物灌胃2 周小鼠肝臟表觀特征Fig.1 Apparent characteristics of liver in mice treated with different antituberculosis drugs for 2 weeks

病理分析發(fā)現(xiàn)，抗結(jié)核藥物性肝損傷后，肝細(xì)胞水腫、變形，胞漿有空泡，核漿比增加，核膜深染，可見部分細(xì)胞壞死、凋亡。MTB 感染組可見核大深染；INH 組可見毛細(xì)血管增多，細(xì)胞增大核深染，RIF 可見條索樣改變，細(xì)胞水腫，核增大；其余3 組改變同MTB 感染組表現(xiàn)（圖2）。

圖2 不同抗結(jié)核藥物灌胃2 周導(dǎo)致的小鼠肝損傷病理變化（40×）Fig.2 Pathological changes of liver injury in mice caused by intragastric administration of different antituberculosis drugs for 2 weeks（40×）

2.2 單次INH、RIF、EB、PZA 及四聯(lián)抗結(jié)核藥物灌胃12 h 后對小鼠肝臟指標(biāo)的影響

單次灌胃小鼠INH、RIF、EB、PZA、四聯(lián)抗結(jié)核藥物12h 后，INH 組、RIF 組、四聯(lián)組小鼠血清AST、ALT 升高，與MTB 感染組、對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，表2），兩兩對比后，RIF 組、四聯(lián)組與MTB 感染組、對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。用藥5 組ALP、GGT、TBIL、肝指數(shù)無明顯改變，與MTB感染組、對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 不同抗結(jié)核藥物灌胃12 h 后的小鼠肝臟指標(biāo)變化（）Tab.2 Changes in liver indicators of mice after 12 hours of intragastric administration of different anti-tuberculosis drugs（）

表2 不同抗結(jié)核藥物灌胃12 h 后的小鼠肝臟指標(biāo)變化（）Tab.2 Changes in liver indicators of mice after 12 hours of intragastric administration of different anti-tuberculosis drugs（）

不同組別中該組與MTB感染組比較，*P ＜ 0.05。

2.3 連續(xù)INH、RIF、EB、PZA 及四聯(lián)抗結(jié)核藥物灌胃1 周對小鼠肝臟相關(guān)指標(biāo)的影響

連續(xù)INH、RIF、EB、PZA 及四聯(lián)抗結(jié)核藥物灌胃小鼠1 周，INH 組、RIF 組、四聯(lián)組小鼠AST、ALT、TBIL 升高，與MTB 感染組、對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。INH 組及RIF 組、四聯(lián)組小鼠肝臟組織有不同程度損傷，3 組肝指數(shù)與病理改變范圍與MTB 感染組、對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。EB 組、PZA 組所有指標(biāo)輕度升高，與MTB 感染組、對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），見圖1、圖2、表3。

表3 不同抗結(jié)核藥物灌胃1 周的小鼠肝臟指標(biāo)變化（）Tab.3 Changes in liver indicators of mice after 1 week of intragastric administration of different anti-tuberculosis drugs（）

表3 不同抗結(jié)核藥物灌胃1 周的小鼠肝臟指標(biāo)變化（）Tab.3 Changes in liver indicators of mice after 1 week of intragastric administration of different anti-tuberculosis drugs（）

不同組別中該組與MTB感染組比較，*P ＜ 0.05。

2.4 連續(xù)INH、RIF、EB、PZA 及四聯(lián)抗結(jié)核藥物灌胃2 周對小鼠肝臟相關(guān)指標(biāo)的影響

表4 結(jié)果顯示，連續(xù)INH、RIF、EB、PZA及四聯(lián)抗結(jié)核藥物灌胃2 周，INH 組、RIF 組、四聯(lián)組小鼠肝臟組織進(jìn)行性損傷，INH 組及RIF組損傷程度達(dá)到重度，3 組AST、ALT、TBIL、肝臟指數(shù)及病變范圍與MTB 感染組、對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。EB 組、PZA 組肝臟血清學(xué)指標(biāo)及肝臟指數(shù)、病變范圍輕度升高，但與MTB 感染組、對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。

表4 不同抗結(jié)核藥物灌胃2 周的小鼠肝臟指標(biāo)變化（）Tab.4 Changes in liver indicators of mice after 2 weeks of intragastric administration of different anti-tuberculosis drugs（）

表4 不同抗結(jié)核藥物灌胃2 周的小鼠肝臟指標(biāo)變化（）Tab.4 Changes in liver indicators of mice after 2 weeks of intragastric administration of different anti-tuberculosis drugs（）

不同組別中該組與MTB感染組比較，*P ＜ 0.05。

2.5 連續(xù)INH、RIF、EB、PZA 及四聯(lián)抗結(jié)核藥物灌胃3 周對小鼠肝臟相關(guān)指標(biāo)的影響

連續(xù)INH、RIF、EB、PZA 及四聯(lián)抗結(jié)核藥物灌胃3 周，INH 組、RIF 組、四聯(lián)組AST、ALT、GGT、TBIL 繼續(xù)升高，與MTB 感染組、對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。INH 與RIF 組小鼠肝組織重度損傷，部分極重度損傷，肝臟指數(shù)與病變范圍與MTB 感染組、對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），四聯(lián)組肝組織損傷緩慢進(jìn)展，未達(dá)重度，肝臟指數(shù)與病理改變范圍與MTB 感染組、對照組比較，差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。其余各組指標(biāo)與MTB 感染組、對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），見表5。

表5 不同抗結(jié)核藥物灌胃3 周的小鼠肝臟指標(biāo)變化（）Tab.5 Changes in liver indicators of mice after 3 weeks of intragastric administration of different anti-tuberculosis drugs（）

表5 不同抗結(jié)核藥物灌胃3 周的小鼠肝臟指標(biāo)變化（）Tab.5 Changes in liver indicators of mice after 3 weeks of intragastric administration of different anti-tuberculosis drugs（）

不同組別中該組與MTB感染組比較，*P ＜ 0.05。

2.6 小鼠肝損傷指標(biāo)隨用藥時間的變化趨勢

所有用藥組均按照用藥時間進(jìn)行相關(guān)性分析，EB 組、PZA 組、四聯(lián)組肝損傷血清學(xué)指標(biāo)、肝臟指數(shù)、病變范圍與用藥時間無明顯相關(guān)性（P值均 ＞ 0.05）。INH 組、RIF 組ALT 及AST、ALP、GGT、TBIL 水平升高、肝臟指數(shù)增加、病變范圍增加，與用藥時間有明顯相關(guān)性（P＜ 0.05），提示INH、RIF 在抗結(jié)核藥物性肝損傷中起到主要作用，對小鼠肝臟損傷具有明顯時間累積效應(yīng)，見表6、表7，圖3、圖4。

圖3 INH 組不同灌胃時間肝損傷指標(biāo)變化Fig.3 Changes in liver injury indicators in the INH group at different gastric lavage times

圖4 RIF 組不同灌胃時間肝損傷指標(biāo)變化Fig.4 Changes in liver injury indicators in the RIF group at different gastric lavage times

表6 INH 組小鼠肝損傷指標(biāo)與用藥時間的相關(guān)性分析（）Tab.6 Correlation analysis between liver injury indicators and medication time in INH group mice（）

表6 INH 組小鼠肝損傷指標(biāo)與用藥時間的相關(guān)性分析（）Tab.6 Correlation analysis between liver injury indicators and medication time in INH group mice（）

*P ＜ 0.05 。

表7 RIF 組小鼠肝損傷指標(biāo)與用藥時間的相關(guān)性分析（）Tab.7 Correlation analysis between liver injury indicators and medication time in RIF group mice（）

表7 RIF 組小鼠肝損傷指標(biāo)與用藥時間的相關(guān)性分析（）Tab.7 Correlation analysis between liver injury indicators and medication time in RIF group mice（）

*P ＜ 0.05。

3 討論

目前國內(nèi)外研究已經(jīng)有ATB-DILI 的小鼠模型建立研究，但是多為單藥如INH、RIF 或INH聯(lián)合RIF 的肝損傷小鼠模型[5]，未見EB、PZA 及四聯(lián)抗結(jié)核藥物導(dǎo)致感染MTB 小鼠模型肝損傷的研究報道。通過建立感染MTB 的ATB-DILI 小鼠模型，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ATB-DILI 發(fā)病機制，是目前防治肺結(jié)核，尤其是防治耐藥肺結(jié)核發(fā)生發(fā)展的方向及熱點[6]。

本研究結(jié)果證實，INH 致肝損傷小鼠組（簡稱INH 組）、RIF 致肝損傷小鼠組（簡稱RIF 組）、EB 致小鼠肝損傷組（簡稱EB 組）、PZA 致小鼠肝損傷組（簡稱PZA 組）以及四聯(lián)抗結(jié)核藥物導(dǎo)致小鼠肝損傷組（簡稱四聯(lián)組）在給藥12 h 后，RIF、四聯(lián)抗結(jié)核藥物可以導(dǎo)致小鼠ALT、AST 升高（P＜ 0.05），提示急性肝損傷主要與RIF 及RIF 聯(lián)合其他抗結(jié)核藥物相關(guān)，與EB 及PZA 無明顯相關(guān)性。給藥1～2 周后，RIF 組、INH 組及四聯(lián)組病理改變明顯，主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞增大變形，部分細(xì)胞壞死凋亡（P＜ 0.05），提示INH、RIF 主要導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，對肝血管等組織影響較小。通過藥物減少INH、RIF 對肝細(xì)胞的損傷，可以降低ATB-DILI 發(fā)病率[7]。

本研究結(jié)果證實，連續(xù)灌胃3 周后，各組損傷程度均有上升，其中INH 組、RIF 組、四聯(lián)組血清學(xué)指標(biāo)AST、ALT、GGT、TBIL 與MTB 感染組、對照組相比均具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。四聯(lián)抗結(jié)核藥物使用后，肝臟指標(biāo)升高程度與病理改變范圍均低于單藥INH、RIF，考慮為4 種抗結(jié)核藥物同時使用，藥物效應(yīng)可以互相拮抗，從而導(dǎo)致肝損傷程度較輕，與目前研究報道相符[8]。

本研究結(jié)果顯示，RIF 組、INH 組、四聯(lián)組在1 周給藥時，肝臟病理改變程度均比血清學(xué)肝功能指標(biāo)改變程度嚴(yán)重，且肝細(xì)胞壞死出現(xiàn)較早，用藥1 周時已經(jīng)出現(xiàn)中度肝損傷，而血清學(xué)指標(biāo)僅為輕度。給藥2 周后，INH 組及RIF 組血清學(xué)肝功能指標(biāo)未達(dá)重度，但肝臟病理表現(xiàn)已經(jīng)出現(xiàn)重度或極重度改變，尤其是RIF 組改變更為明顯。本研究這一病理改變與目前文獻(xiàn)結(jié)果不完全相符[9-10]，考慮入組研究的小鼠均為感染MTB 的小鼠，而其他研究為未感染MTB 的小鼠。感染MTB 小鼠的炎癥反應(yīng)更重，肝損傷進(jìn)展更快，所以病理改變更嚴(yán)重、病變范圍擴大更快。本研究結(jié)果也顯示，MTB 感染組小鼠與對照組小鼠在伴隨試驗中，肝臟指標(biāo)無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞ 0.05），但MTB 感染組小鼠肝臟異常指標(biāo)仍略高于對照組，提示MTB 感染也可以導(dǎo)致部分肝臟指標(biāo)異常，可能與MTB 感染導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)相關(guān)[11-12]。

本研究結(jié)果顯示，INH、RIF 均有時間累積效應(yīng)的肝損傷，多項肝臟血清學(xué)指標(biāo)及病理改變、肝臟指數(shù)與INH、RIF 的時間累積效應(yīng)具有明顯相關(guān)性（P＜ 0.05），提示INH、RIF 的用藥時間越長，藥物累積效應(yīng)越明顯，從而導(dǎo)致?lián)p傷程度加重，該研究結(jié)論與目前研究報道相符[13]。ATBDILI 的結(jié)核病患者調(diào)整治療時，應(yīng)重點關(guān)注INH、RIF 的用藥時間與疾病嚴(yán)重程度，對ATB-DILI患者用藥選擇進(jìn)行規(guī)范、科學(xué)的指導(dǎo)，可以防止因反復(fù)停藥導(dǎo)致耐藥肺結(jié)核的發(fā)生。

綜上所述，ATB-DILI 發(fā)生發(fā)展與INH、RIF密切相關(guān)，兩種藥物主要損傷肝細(xì)胞，并以細(xì)胞壞死水腫為主要病理表現(xiàn)[14]。INH 與RIF 對肝臟損傷具有時間累積效應(yīng)，同時ATB-DILI 的病理損傷程度重于及早于血清學(xué)檢測指標(biāo)。ATBDILI 小鼠血清學(xué)指標(biāo)顯示輕度異常的時候，肝臟的病理性損傷已經(jīng)達(dá)到中度或重度。及早應(yīng)用保護(hù)肝細(xì)胞損傷的藥物，可能對ATB-DILI 的發(fā)生發(fā)展具有一定防治作用。本研究為基礎(chǔ)實驗研究，是否與臨床表現(xiàn)相符合，仍需要更多研究來進(jìn)行證實。