姜濤，趙薇，王茸，魏琳，劉暢，王冰梅，王微

長春中醫(yī)藥大學(xué) 吉林長春 130117

“心力衰竭”簡稱心衰，是指由于心臟的收縮功能和（或）舒張功能發(fā)生障礙，不能將靜脈回心血量充分排出心臟，導(dǎo)致靜脈系統(tǒng)血液淤積，動脈系統(tǒng)血液灌注不足，從而引起心臟循環(huán)障礙癥候群，此障礙癥候群集中表現(xiàn)為肺淤血、腔靜脈淤血[1]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種藥物研究的新模式出現(xiàn)，其整體性和系統(tǒng)性特征與中醫(yī)的整體理解、辨證治療以及與處方配伍的原則相吻合[3]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從整體角度探討藥物與疾病之間的關(guān)系，突出了從“單個(gè)靶標(biāo)”到“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)”研究模式的轉(zhuǎn)變[2-3]。

溫陽強(qiáng)心顆粒具有明顯的改善慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）的作用，但是目前對于溫陽強(qiáng)心顆粒的作用機(jī)理研究和文獻(xiàn)很少，也比較單一，尚需進(jìn)一步研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展為我們提供了預(yù)測和分析“藥物-靶標(biāo)”相互作用的可能。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測溫陽強(qiáng)心方的活性成分，篩選治療心力衰竭的作用靶點(diǎn)，結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)研究多角度、全方位揭示溫陽強(qiáng)心方對心力衰竭的效應(yīng)機(jī)制[4]。

資料與方法

1 溫陽強(qiáng)心顆粒有效活性成分及作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP，http//：lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp）檢索溫陽強(qiáng)心顆粒（黨參、甘草、葶藶子、附子、丹參、三七、茯苓、黃芪、當(dāng)歸、白術(shù)、桂枝）各組分的有效成分及作用靶點(diǎn)。以口服生物利用度（oral bioavilability，OB）≥ 30%，類藥性（druglike，DL）≥ 0.18為篩選條件，篩選出溫陽強(qiáng)心顆粒的有效成分及靶點(diǎn)[5]。將篩選后所得的藥物靶點(diǎn)通過全球蛋白質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫（Uniprot，https：//www.uniprot.org/），限定物種為“Homo sapiens”，并點(diǎn)擊Reviewed進(jìn)行基因的標(biāo)準(zhǔn)化處理，從而將蛋白名稱轉(zhuǎn)換為Gene Symbol。

2 CHF靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

通過在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，http：//www.omim.org/）和基因卡片數(shù)據(jù)庫（GeneCards，https：//www.genecards.org/）輸入關(guān)鍵詞“chronic heart failure”檢索與CHF相關(guān)的基因，點(diǎn)擊選項(xiàng)Export選擇Export to Excel格式，并篩選出相關(guān)分?jǐn)?shù)Relevance score ≥ 15的基因構(gòu)建疾病數(shù)據(jù)庫。

3 溫陽強(qiáng)心顆粒治療CHF靶點(diǎn)及有效成分的篩選

將“1”取得的溫陽強(qiáng)心顆粒靶點(diǎn)與“2”取得的疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1平臺取其交集，所得交集靶點(diǎn)即為溫陽強(qiáng)心顆粒治療CHF的潛在作用靶點(diǎn)，并制作Venny圖。

4 中藥活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“3”取得的溫陽強(qiáng)心顆粒與疾病的交集靶點(diǎn)進(jìn)行分析，找出各個(gè)中藥之間的重復(fù)成分，對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并準(zhǔn)備好網(wǎng)絡(luò)文件和屬性文件。先將網(wǎng)絡(luò)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件，設(shè)置第一列為MOL、第二列為Gene，接著導(dǎo)入屬性文件，即可獲得一個(gè)初步的中藥有效成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，再對其初步的網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行調(diào)整美化得到最終的中藥有效成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了探討CHF與溫陽強(qiáng)心顆粒之間的潛在靶點(diǎn)相互作用的關(guān)系，將“3”獲得的交集靶點(diǎn)蛋白輸入String數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/），限定物種為“Homo sapiens”進(jìn)行分析，隨后導(dǎo)入輸出文件和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖[2]。為了確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，設(shè)置選項(xiàng)“minimum required interaction score = 0.4”的PPI關(guān)系數(shù)據(jù)，構(gòu)建溫陽強(qiáng)心顆粒對治療CHF的 PPI網(wǎng)絡(luò)圖。將溫陽強(qiáng)心顆粒與疾病CHF在String數(shù)據(jù)庫取得的交集靶點(diǎn)輸入到Cytoscape 3.9.1軟件中，在得到的PPI互作圖中去除掉游離的邊緣靶點(diǎn)蛋白，再對剩余比較集中的交集靶點(diǎn)蛋白的網(wǎng)絡(luò)互作圖進(jìn)行修飾，通過計(jì)算靶點(diǎn)蛋白結(jié)點(diǎn)之間的Degree值，根據(jù)Degree值的大小來進(jìn)行作圖，最終得到PPI網(wǎng)絡(luò)互作圖。

6 基因本體（gene ontology，GO）功能與 KEGG 通路富集分析

為了進(jìn)一步闡明溫陽強(qiáng)心顆粒的作用機(jī)制，本研究擬采用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對溫陽強(qiáng)心顆粒治療靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能和 KEGG 通路富集分析。將得到的數(shù)據(jù)以 P ≤ 0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，通過微生信網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）以圖表的方式進(jìn)行生物過程、分子 功能、 細(xì)胞組分以及KEGG 氣泡圖的可視化處理[3]。

結(jié) 果

1 溫陽強(qiáng)心顆粒治療CHF的有效成分及靶點(diǎn)

應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索溫陽強(qiáng)心顆粒的各成分信息，設(shè)置OB（%）≥ 30%和DL ≥ 0.18作為篩選條件，據(jù)統(tǒng)計(jì)符合條件的共有278種活性化合物。去除重復(fù)數(shù)據(jù)，共篩選出246種活性化合物，見表1，獲得靶點(diǎn)231個(gè)。

表1 溫陽強(qiáng)心顆?；衔锛鞍悬c(diǎn)數(shù)量表

2 溫陽強(qiáng)心顆粒治療CHF靶點(diǎn)篩選結(jié)果

通過CHF致病基因數(shù)據(jù)庫構(gòu)建，篩選CHF疾病相關(guān)靶點(diǎn)10698個(gè)，并以相關(guān)分?jǐn)?shù)（Relevance score）≥15為條件檢索出CHF疾病相關(guān)靶點(diǎn)1060個(gè)。通過 Venny 2.1 平臺將“1”所得藥物靶點(diǎn)與“2”所得的相應(yīng)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行取交集，從而獲取有效靶點(diǎn)，保存交集靶點(diǎn)，共得到交集靶點(diǎn)共有106 個(gè)，并制作Venny圖，見圖1。

圖1 溫陽強(qiáng)心顆粒與心力衰竭相關(guān)

3 構(gòu)建中藥活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

將“3”取得的溫陽強(qiáng)心顆粒與疾病的交集靶點(diǎn)進(jìn)行分析，找出各個(gè)中藥之間的重復(fù)成分，對其進(jìn)行標(biāo)注，然后對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過Cytoscape 3.9.1軟件獲得一個(gè)初步的中藥有效成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，再對其初步的網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行調(diào)整美化得到最終的中藥有效成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖見圖2。

圖2 中藥有效成分-交集靶點(diǎn)

橘色代表黃芪（HQ）、茯苓（FL）、白術(shù)（BZ）、三七（SQ）、茯苓（FL）、桂枝（GZ）、丹參（DS）、附子（FZ）、川芎（CX）、當(dāng)歸（DG）、附子（FZ）、黨參（DANGS）；藍(lán)色代表靶點(diǎn)蛋白；粉色代表有效成分；綠色代表共有成分（注：A1為黨參和丹參的共有成分；A2為黨參、當(dāng)歸、三七的共有成分；A3為黨參、甘草的共有成分；B1為當(dāng)歸、三七、葶藶子的共有成分；C1為川芎、桂枝、甘草、附子的共有成分；C2為川芎、三七的共有成分；D1為三七、甘草、葶藶子、黃芪的共有成分；F1為甘草、葶藶子、黃芪的共有成分；F2為甘草、黃芪的共有成分；F3為甘草、葶藶子、黃芪的共有成分；F4為甘草、黃芪的共有成分）。

4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了進(jìn)一步探討核心靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，將“1”得到的藥物與疾病的 106個(gè)交集靶蛋白基因名導(dǎo)入到 String數(shù)據(jù)庫，將物種限定為“人”，得到藥物-疾病之間的 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖[6]見圖3。

圖3 溫陽強(qiáng)心顆粒治療CHF的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖中共有105個(gè)節(jié)點(diǎn)，1997條邊，平均節(jié)點(diǎn)度 38；節(jié)點(diǎn)代表靶標(biāo)蛋白，邊表示蛋白與蛋白之間的關(guān)系，邊連接節(jié)點(diǎn)構(gòu)建靶蛋白網(wǎng)絡(luò)。將 String 數(shù)據(jù)庫得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Cytoscape 3.9.1 軟件中，繪制 藥物 -疾病的核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖見圖4。其中節(jié)點(diǎn)度值前二十的分別為AKT1、IL6、TNF、VEGFA、IL1B、CASP3、TP53、EGFR、MMP9、PTGS2、CCL2、SERPINE1、MYC、ERBB2、HIF 1A、IL10、PPARA、MPQ、CRP、HMOX1推測這20個(gè)靶蛋白在溫陽強(qiáng)心顆粒治療CHF過程中發(fā)揮重要的作用。

圖4 核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖可視化

5 GO生物過程結(jié)果分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫對獲得的106個(gè)“溫陽強(qiáng)心顆粒-心力衰竭”共同靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析。GO屬于基因功能分類體系，有3個(gè)分支，即生物學(xué)過程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。通過對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以 P ≤ 0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，最終得到556個(gè)BP，54個(gè)CC，91個(gè)MF。其中涉及的生物學(xué)過程包括成骨細(xì)胞發(fā)育、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性的激活、壞死過程的負(fù)調(diào)節(jié)等；涉及的細(xì)胞組成有低密度脂蛋白顆粒、毛孔復(fù)合物、細(xì)胞頂端部分等；涉及的分子功能有低密度脂蛋白顆粒結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、β-連環(huán)蛋白結(jié)合等。應(yīng)用微生信網(wǎng)站根據(jù)“Enrichment score（-log（Pvalue））”對富集的前10個(gè)BP、CC、MF進(jìn)行柱狀圖可視化見圖5。

圖5 GO富集分析

6 KEGG通路富集分析結(jié)果

將106個(gè)靶蛋白數(shù)據(jù)通過DAVID在線進(jìn)行KEGG通路分析。結(jié)果顯示：富集出 KEGG信號通路共127條（P ≤ 0.01，F(xiàn)DR ＜ 0.05）。其中與舒張血管有關(guān)通路PI3K-AKT信號通路[7]（PI3K-Akt signaling pathway）；與腫瘤相關(guān)通路有癌癥通路（Pathways in cancer）、甲狀腺癌（Thyroid cancer）、胃癌（Gastric cancer）；與血管新生有關(guān)通路有VEGF信號通路[8-9]（VEGF signaling pathway）；與心律失常有關(guān)通路有Ca信號通路[10-11]（Calcium signaling pathway）、NA重新收信號通路（Aldosterone-regulates sodium reabsorption）；與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的信號通路有T細(xì)胞受體信號通路（T cell receptor signaling pathway）、NOD樣受體信號通路[12]（NOD-like receptor signaling pathway）、Toll樣受體信號通路[13]（Toll-like receptor signaling pathway）；與心室重構(gòu)和心肌修復(fù)有關(guān)通路腎素分泌信號通路[14-15]（Renin secretion）、JAKSTAT信號通路[9，16]（JAK-STAT signaling pathway）。由此可見，溫陽強(qiáng)心顆粒中的活性成分可以作用于上述的這些信號通路，從而達(dá)到調(diào)節(jié)CHF和治療疾病的目的。運(yùn)用微生信平臺對前20個(gè)的富集結(jié)果進(jìn)行可視化處理見圖6。

圖6 KEGG 富集分析的氣泡圖（前20）

討 論

在以前的藥物研發(fā)模式中，主要遵循“一個(gè)藥物、一個(gè)基因、一種疾病”的模式，這是導(dǎo)致70%的新藥在臨床試驗(yàn)失敗的主要原因[17]。然而，目前對CHF作用機(jī)制的研究相對較為單一，因此有必要研究溫陽強(qiáng)心顆粒治療CHF的作用機(jī)制[18]。

對比傳統(tǒng)的藥理學(xué)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從整體網(wǎng)絡(luò)的角度認(rèn)識藥物的作用機(jī)制，指導(dǎo)臨床合理用藥。在進(jìn)行新藥發(fā)現(xiàn)和新藥作用評價(jià)以及新藥開發(fā)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)藥物的靶點(diǎn)并不是隨機(jī)分布在網(wǎng)絡(luò)中，而是具有靶點(diǎn)分布的特點(diǎn)和一定的規(guī)律。因此，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對中藥復(fù)方溫陽強(qiáng)心顆粒的有效成分、靶蛋白和信號通路進(jìn)行預(yù)測和分析，構(gòu)建與CHF相關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)，對溫陽強(qiáng)心顆粒治療CHF的可能作用機(jī)制進(jìn)行初步的分析。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)溫陽強(qiáng)心顆?？梢酝ㄟ^作用于抗心律失常、免疫炎癥反應(yīng)、舒張血管平滑肌、血管新生等方面治療心力衰竭[19]。

為了探究溫陽強(qiáng)心顆粒治療心力衰竭的作用機(jī)制，本研究對溫陽強(qiáng)心顆粒中的中藥活性成分進(jìn)行了分析，構(gòu)建了中藥活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，分析了中藥活性成分與靶點(diǎn)的作用關(guān)系[20]。在中藥活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中有多個(gè)與疾病緊密相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白，如AKT1、IL6TNF、VEGFA等，由此可推測溫陽強(qiáng)心顆粒正是與這些靶點(diǎn)直接或間接作用發(fā)揮藥理作用。

此外，本研究還對溫陽強(qiáng)心顆粒在GO功能和KEGG通路進(jìn)行富集分析。GO功能富集分析結(jié)果顯示，溫陽強(qiáng)心顆粒作用的靶點(diǎn)參與了成骨細(xì)胞發(fā)育、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性的激活、壞死過程的負(fù)調(diào)節(jié)、低密度脂蛋白顆粒、毛孔復(fù)合物、細(xì)胞頂端部分、低密度脂蛋白顆粒結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、β-連環(huán)蛋白結(jié)合等生物過程、細(xì)胞組成和分子功能。KEGG通路進(jìn)行富集分析顯示，溫陽強(qiáng)心顆粒大多數(shù)基因富集到與癌癥有直接關(guān)系的通路上，包括Choline metabolism in cancer、Central carbon metabolism in cancer等；另一部分負(fù)責(zé)調(diào)控信號通路，包括Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection、Adrenergic signaling in cardiomyocytes、GnRH signaling pathway等。

綜上所述，溫陽強(qiáng)心顆粒治療CHF的作用機(jī)制是多成分、多靶點(diǎn)、多通路的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[21]。在溫陽強(qiáng)心顆粒治療CHF中，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測了溫陽強(qiáng)心顆粒對該疾病的主要作用機(jī)制，為其活性成分的深入研究以及藥理實(shí)驗(yàn)提供了理論依據(jù)。