◎ 張樹成，隋楊林，楊進(jìn)潔，蔣金栓，趙 收

（煙臺(tái)雙塔食品股份有限公司，山東 招遠(yuǎn) 265400）

豌豆（Pisum sativum Linn）又名青豆、寒豆、荷蘭豆，是一種豆科植物，一年生或越年生[1-2]。豌豆可作為蔬菜，飼料，甚至主糧[3-4]。豌豆中富含淀粉、蛋白質(zhì)、膳食纖維等。其中，淀粉占比在48%左右，蛋白質(zhì)占比在22%左右，膳食纖維占比在15%左右。豌豆淀粉是優(yōu)質(zhì)淀粉，主要用于加工龍口粉絲、涼粉等。相比谷類和薯類淀粉來(lái)說(shuō)，豌豆淀粉的直鏈淀粉含量較高，這也是形成龍口粉絲特有品質(zhì)的關(guān)鍵所在。豌豆蛋白是淀粉提取的副產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)氨基酸組成比較豐富，氨基酸評(píng)分能達(dá)到0.8以上。除含硫氨基酸外[5]，其他必需氨基酸的含量水平都較高，特別是賴氨酸含量高達(dá) 7.2%，是良好的必需氨基酸來(lái)源[6]。近幾年，國(guó)內(nèi)和國(guó)際上對(duì)豌豆蛋白利用場(chǎng)景越來(lái)越多樣化，對(duì)豌豆蛋白的研究也越來(lái)越深入。

蛋白酶是由傳統(tǒng)食品加工用微生物菌株和確認(rèn)無(wú)害的菌株生產(chǎn)，中性蛋白酶的生產(chǎn)菌株主要是枯草芽孢桿菌[7]。中性蛋白酶能在適宜的條件下將蛋白質(zhì)大分子水解成蛋白質(zhì)胨、多肽、氨基酸等。目前，中性蛋白酶被廣泛應(yīng)用于洗滌劑、制革、發(fā)酵和釀造、蛋白質(zhì)的水解以及功能肽等生產(chǎn)工藝中。

本研究旨在采用中性蛋白酶將豌豆蛋白粉酶解，測(cè)定其酶解產(chǎn)物豌豆蛋白肽的抗氧化活性的變化。通過(guò)控制酶解反應(yīng)的溫度、時(shí)間、pH和底物濃度4個(gè)條件，優(yōu)化出最佳酶解反應(yīng)參數(shù)，并以·O2-自由基清除率作為豌豆蛋白肽的抗氧化活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中性蛋白酶：購(gòu)自諾維信（中國(guó)），酶活力為4.5×104U·g-1。

豌豆蛋白：煙臺(tái)雙塔食品股份有限公司自產(chǎn)，蛋白質(zhì)含量在80%～85%。

1.2 儀器與設(shè)備

SHA-BA數(shù)顯水浴恒溫振蕩器；TD5M型離心機(jī)；N-1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；T6新世紀(jì)型紫外可見分光光度計(jì)。

1.3 豌豆蛋白的酶解方法

將一定質(zhì)量的豌豆蛋白粉用清水溶解后，用磷酸鹽緩沖液調(diào)整pH。加入設(shè)定比例的中性蛋白酶后，恒溫震蕩酶解3 h，沸水浴加熱10 min滅酶。冷卻后，將酶解液離心，保留上清液，其主要成分為豌豆蛋白肽。

1.4 最佳酶解參數(shù)確定

通過(guò)查閱相關(guān)資料文獻(xiàn)，初步確定影響酶解效果的主要因素分別是加酶量、反應(yīng)液的pH、反應(yīng)溫度和底物濃度。對(duì)這4個(gè)參數(shù)分別做單因素實(shí)驗(yàn)，再根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)。以酶解產(chǎn)物自由基·O-2清除率為衡量指標(biāo)，來(lái)確定最佳酶解參數(shù)。

1.5 豌豆蛋白肽的提純分離

采用不同孔徑的透析袋，對(duì)豌豆蛋白酶解上清液進(jìn)行依次分離。將上清液注入透析袋中，置于蒸餾水中攪拌透析，不斷換水直至透析液顏色穩(wěn)定無(wú)變化。對(duì)濃縮液進(jìn)行濃縮和干燥，獲得豌豆蛋白肽粉。

1.6 酶解產(chǎn)物自由基·O2- 清除率的測(cè)定[8]

取4.5 mL濃度在0.05 mol·L-1，pH為8.2的磷酸鹽緩沖液于大試管中，在25 ℃水浴20 min后，加入1 mL豌豆蛋白肽樣品和0.4 mL濃度為25 mmol·L-1的鄰苯三酚溶液。搖勻后放回25 ℃水浴中反應(yīng)5 min。隨后加入1 mL 8 mol·L-1的鹽酸終止反應(yīng)，于325 nm下測(cè)反應(yīng)液的吸光度A樣。同時(shí)做空白對(duì)照A空。

1.7 酶解條件正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以加酶量、反應(yīng)液的pH、反應(yīng)溫度和底物濃度做4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)。因素水平表見表1。

表1 酶解條件正交實(shí)驗(yàn)各因素及水平表

1.8 豌豆蛋白肽分子量測(cè)定

參照GB/T 22492—2008 大豆肽粉 附錄A ，測(cè)定豌豆蛋白肽的分子量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 酶解條件單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

豌豆蛋白使用中性蛋白酶酶解的不同反應(yīng)參數(shù)（酶添加量、反應(yīng)pH、反應(yīng)時(shí)間和底物濃度）對(duì)反應(yīng)后酶解產(chǎn)物的·O2-清除率的影響，分別由圖1、圖2、圖3和圖4表示。由圖1可知，控制加酶量在6%~14%之間，酶解產(chǎn)物對(duì)·O2-清除率在10%左右有了快速提升，之后變化不明顯。由圖2可知，隨著反應(yīng)pH的升高，酶解產(chǎn)物對(duì)·O2-清除率先上升再下降，并且在pH為7左右時(shí)達(dá)到最高，且pH的影響較劇烈。由圖3可知，隨著反應(yīng)溫度的提升，酶解產(chǎn)物對(duì)·O2-清除率先快速上升，然后快速下降，當(dāng)反應(yīng)溫度在40 ℃左右時(shí)，達(dá)到峰值。由圖4可知，底物濃度越低時(shí)，酶解產(chǎn)物對(duì)·O-2清除率越高。但是，該參數(shù)要考慮到生產(chǎn)的實(shí)際成本控制，濃度越低，生產(chǎn)成本越高。結(jié)合實(shí)際，將該濃度控制在7%左右較為適宜。

圖1 加酶量對(duì)酶解產(chǎn)物·O2-清除率的影響圖

圖2 反應(yīng)pH對(duì)酶解產(chǎn)物·O2-清除率的影響圖

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)酶解產(chǎn)物·O2- 清除率的影響圖

圖4 底物濃度對(duì)酶解產(chǎn)物·O2-清除率的影響圖

2.2 酶解條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2中極差分析結(jié)果可以看出，4個(gè)因素的影響主次順序?yàn)椋悍磻?yīng)pH（B）＞加酶量（A）＞反應(yīng)溫度（C）＞底物濃度（D）。且最佳酶解參數(shù)為A3B2C2D1。即加酶量為12.0%，反應(yīng)pH為7.0，反應(yīng)溫度為40 ℃，底物濃度為5.0%。由于該條件組合在實(shí)驗(yàn)中沒有出現(xiàn)，所以，在該條件下做了3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，·O2-清除率分別為70.4%、71.5%、71.7%，平均值在71.2%，確實(shí)高于表中其他實(shí)驗(yàn)組，說(shuō)明該組參數(shù)為最佳反應(yīng)參數(shù)?？稍谠搮?shù)下進(jìn)行抗氧化性豌豆肽的提升。

表2 酶解條件正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析表

2.3 豌豆蛋白肽的分離

采用透析袋對(duì)中性蛋白酶酶解產(chǎn)物進(jìn)行分級(jí)提純，獲得不同分子量的豌豆蛋白肽，并對(duì)其進(jìn)行·O2-清除率的測(cè)定，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，中性蛋白酶的酶解產(chǎn)物經(jīng)提純后獲得的豌豆蛋白肽，雖然分子量不同，但是都具有·O-2的清除能力，說(shuō)明其具有抗氧化性。但是不同分子量的豌豆蛋白肽的抗氧化能力差距較大。隨著分子量的降低，抗氧化能力會(huì)有快速提升的趨勢(shì)。在分子量小于1 ku時(shí)，·O2-的清除能力最強(qiáng)。這與朱國(guó)洪等人的文獻(xiàn)報(bào)道一致[9-10]。

2.4 豌豆蛋白肽小于1 ku組分的分子量分析

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)可知，豌豆蛋白肽在分子量小于1 ku時(shí)，能夠表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化性。因此，對(duì)＜1 ku的分子量組成進(jìn)行進(jìn)一步的分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。

校正曲線：Lg（MW）=7.390-0.250 T，R2=0.999 6

分子量小于1 ku的豌豆蛋白肽分子量分布圖，如圖6所示。

圖6 豌豆蛋白肽分子量分布圖

由圖5和圖6可知，將分子量小于1 ku的蛋白肽進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)其分子量大多集中在200~800 U之間，在這個(gè)區(qū)間的肽往往是2肽到8肽。小分子量肽具有較高的氧化性。這與張秋萍等人的研究結(jié)論基本一致[10-11]。

3 結(jié)論

采用中性蛋白酶酶解豌豆蛋白，優(yōu)化出·O2-清除率最高的酶解產(chǎn)物的參數(shù)即加酶量為12.0%，反應(yīng)pH為7.0，反應(yīng)溫度為40 ℃，底物濃度為5.0%，在此條件下，·O2-清除率為71.2%。分級(jí)提純后分析，發(fā)現(xiàn)分子量小于1 ku的豌豆蛋白肽的·O2-清除率最高，可達(dá)到79.3%，分析其分子量集中在200~800 U之間。說(shuō)明透析技術(shù)能夠達(dá)到提純蛋白肽的目的，并且能夠通過(guò)分級(jí)獲得抗氧化能力較高的蛋白肽。分離出的抗氧化肽具有良好的抗氧化活性，可應(yīng)用于食品防腐、清除自由基等多個(gè)領(lǐng)域。