李云萱，朱 帥，鄭仕劍

（浙江方圓檢測(cè)集團(tuán)股份有限公司，浙江 杭州 310018）

近幾年，我國(guó)人民生活水平逐步提高，堅(jiān)果已成為幾乎每日都在攝取的食物[1]，因此堅(jiān)果的食品安全和人們的生活健康息息相關(guān)。由于堅(jiān)果水分、水分活度、營(yíng)養(yǎng)成分、pH 值和能長(zhǎng)期貯存的特性導(dǎo)致其容易發(fā)霉。堅(jiān)果中常見(jiàn)的可檢測(cè)到的真菌多是曲霉屬、根霉屬和青霉屬[2-3]。而堅(jiān)果中經(jīng)常出現(xiàn)潛在的產(chǎn)毒物種，如黃曲霉、寄生曲霉和黑曲霉[4-5]，這些霉菌種類是眾所周知的黃曲霉毒素的生產(chǎn)者，具有遺傳毒性和致癌性[6-7]。其中，黃曲霉毒素對(duì)免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)具有損傷性[8]，而黃曲霉毒素B1的毒性最烈，為氰化鉀的10 倍，砒霜的68 倍[9]，是目前受真菌污染的堅(jiān)果中毒性最大、涉及面最廣的霉菌毒素之一。尤其在濕熱環(huán)境中發(fā)生幾率較高，易在玉米、花生、谷物、果仁、堅(jiān)果等油脂含量較高的糧油作物上生長(zhǎng)[10]。1993 年，黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)確定為天然存在的一類致癌物質(zhì)[11]。每年世界上約有25%的食物受黃曲霉毒素污染[12]。黃曲霉毒素是由真菌屬的黃曲霉和寄生曲霉等產(chǎn)生的一類帶有香豆素或雙呋喃環(huán)的化合物[13]。黃曲霉毒素對(duì)肝臟的毒性尤為明顯，過(guò)量攝入會(huì)導(dǎo)致肝炎、肝硬化和肝壞死等，除了對(duì)腎臟等器官的功能造成嚴(yán)重?fù)p外，還抑制生長(zhǎng)發(fā)育、影響生殖代謝和免疫調(diào)節(jié)等[14]。

開(kāi)心果、核桃和杏仁由于對(duì)身體健康有良好的功效而備受青睞。開(kāi)心果可降低膽固醇水平并降低血壓[15]，減少身體氧化和炎癥壓力、控制血糖、更好地控制食欲并控制體重[16]。核桃仁中含有的亞油酸，則可預(yù)防和治療老年人血管疾病[17]?？嘈尤手械目嘈尤受站哂幸种坪蜌⑺腊┘?xì)胞的作用[18]。因此，快速篩查堅(jiān)果中真菌毒素含量，并保障其含量在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)成為一個(gè)與食品安全息息相關(guān)的問(wèn)題。

目前，常用的黃曲霉毒素檢測(cè)方法有薄層色譜法[19]、熒光光度法[20-21]、酶聯(lián)免疫法[22-24]、高效液相色譜法[25-26]等。但上述方法前處理繁瑣、操作步驟多、雜質(zhì)影響較大、易產(chǎn)生干擾，尤其黃曲霉毒素B1，柱前衍生所用試劑對(duì)操作者和環(huán)境都有一定危害，柱后衍生又需要專用的配套儀器，應(yīng)用易受限制。與此同時(shí)，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法越來(lái)越多應(yīng)用于各類真菌毒素分析，并且使黃曲霉毒素的分析能力得到顯著提高，這主要得益于質(zhì)譜的高靈敏度和定量能力，且還無(wú)需衍生，更可以同時(shí)對(duì)多種化合物進(jìn)行定性定量分析。研究建立了用MycoSep226 多功能凈化柱凈化的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定開(kāi)心果、核桃和杏仁中的黃曲霉毒素。

1 儀器、試劑及方法

1.1 儀器設(shè)備

Sciex Triple Quad 5500 型三重四級(jí)桿液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI），美國(guó)AB 公司產(chǎn)品；Milli-Q Integral 型超純水儀，美國(guó)默克公司產(chǎn)品；ST16R 型高速冷凍離心機(jī)，Thermo Fisher 公司產(chǎn)品；HY-2A 型調(diào)速振蕩器，江蘇金壇榮華產(chǎn)品；VORTEX GENIUS3 型渦旋混合器，IKA 公司產(chǎn)品；DS-800DTH 型超聲波清洗器，上海生析超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品和試劑

黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2（100 μg/mL），Dr.Ehrenstorfer 公司提供。

乙腈、甲醇（均為色譜純），德國(guó)Merck 公司提供；無(wú)水硫酸鎂（分析純），西隴科學(xué)股份有限公司提供；Z-Sep 凈化管，Supelco 公司提供；C18，深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司提供；實(shí)驗(yàn)室一級(jí)用水，符合GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》；MycoSep226 凈化柱，美國(guó)Romer Labs 公司提供。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2標(biāo)準(zhǔn)工作液（100ng/mL）：準(zhǔn)確移取黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10 mL 至100 mL容量瓶中，乙腈定容。此溶液密封后避光-20 ℃下保存，3 個(gè)月有效。

標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（100 ng/mL） 50，100，200，500，1 000 μL 至10 mL容量瓶中，用空白萃取液定容至刻度，配置質(zhì)量濃度為0.5，1.0，2.0，5.0，8.0，10.0 ng/mL。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取處理好的樣品5.00 g（精確到0.01 g）于50 mL 具塞離心管中，加入20 mL 乙腈水（8∶2），渦旋1 min，振蕩10 min，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心5 min，取上清液于裝有5 g 無(wú)水硫酸鈉、200 mg Z-SEP 的離心管中，振蕩2 min，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心5 min。

取6 mL 上述離心后的提取液過(guò)MycoSep226 多功能凈化柱，舍去前2 mL，取后4 mL 凈化液40~50 ℃氮吹干，殘?jiān)? mL 50%乙腈水定容，過(guò)0.22 m濾膜，待上機(jī)測(cè)定。

1.5 LC-MS/MS 儀器條件

液相色譜條件：WatersACOUITYUPLC? HSST3 型色譜柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；流動(dòng)相：A 為乙腈，B 為0.1%甲酸水溶液；流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM） 模式，電噴霧電壓（IS） 5 500 V，離子源溫度（TEM） 550 ℃，碰撞氣（CAD，N2） 壓力41.3 kPa（6 Psi），氣簾氣（CUR，N2） 壓力206.8 kPa（30 Psi），霧化氣（GS1，N2） 壓力413.7 kPa（60 Psi），輔助加熱氣（GS2，N2） 壓力413.7 kPa（60Psi）。

黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2 的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2在ESI+模式下有較高的響應(yīng)，通過(guò)一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜全掃描，選取其中豐度最高的離子作為黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2各自的特征離子，調(diào)試出最佳的去簇電壓、碰撞室出口電壓、碰撞能量。選取響應(yīng)最強(qiáng)的離子作為定量離子，響應(yīng)次之的作為定性離子。

2.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

在正離子模式下，相比用純水作流動(dòng)相，加入甲酸更有助于離子化，隨著甲酸濃度的增加，質(zhì)譜響應(yīng)值增加，但超過(guò)一定的濃度響應(yīng)反而下降。而乙腈則讓黃曲霉毒素有很高的響應(yīng)。因此，采用乙腈- 0.1%甲酸水作為流動(dòng)相，在6 min 內(nèi)分離效果良好。

黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2 譜圖

2.3 提取劑的優(yōu)化

針對(duì)黃曲霉毒素極性較大的特點(diǎn)，選取了不同比例甲醇水和乙腈水作為提取劑進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)甲醇∶水（7∶3） 和乙腈∶水（8∶2） 時(shí)有較高的回收率，均能達(dá)到80%以上，且基質(zhì)效應(yīng)影響較小。不同比例溶劑提取液對(duì)回收率的影響見(jiàn)表3。

表3 不同比例溶劑提取液對(duì)回收率的影響

2.4 凈化劑的優(yōu)化

QuEChERS 凈化方法比傳統(tǒng)的從樣品提取目標(biāo)物，更能有效地去除更多的脂肪和顏色，其方法快速、簡(jiǎn)便、廉價(jià)、有效、耐用、安全。選取的Z-Sep凈化產(chǎn)品，是在凈化管中加入提取液，樣品在提取液和散裝SPE 填料之間進(jìn)行分配或吸附，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基質(zhì)樣品的凈化，能有效消除基質(zhì)干擾的問(wèn)題。試驗(yàn)對(duì)比Z-Sep 與C18不同比例下的提取效率，在添加量為20 μg/kg 下進(jìn)行回收。

不同比例溶劑提取液對(duì)回收率的影響見(jiàn)表4。

表4 不同比例溶劑提取液對(duì)回收率的影響%

2.5 線性關(guān)系及檢出限

用空白基質(zhì)配置濃度為0.1~10.0 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜上機(jī)測(cè)試，以目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度X（μg/L） 為橫坐標(biāo)，目標(biāo)化合物對(duì)應(yīng)的峰面積Y 縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示在0.1~10.0 μg/L 范圍內(nèi)線性良好。

回歸方程及檢出限（S/N=3）、定量限（S/N=10）見(jiàn)表5。

表5 回歸方程及檢出限、定量限

2.6 精密度及回收率

稱取樣品，添加0.5，1.0 和5.0 μg/kg 3 水平的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.3 節(jié)的試驗(yàn)方法進(jìn)行前處理，計(jì)算回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

典型樣品的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）見(jiàn)表6。

表6 典型樣品的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

結(jié)果表明，堅(jiān)果中黃曲霉毒素的回收率為85.9%~112.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） ≤10%，滿足日常檢測(cè)需求。

3 結(jié)論

建立了QuEChERS 凈化超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定堅(jiān)果中的黃曲霉毒素含量的方法。高、中、低不同質(zhì)量濃度加標(biāo)回收率85.9%~112.4%，相對(duì)偏差（RSD） 在1.02%~5.75%。黃曲霉B1，B2，G1，G2方法定量限為0.5 g/kg。該方法操作簡(jiǎn)便、方便快捷、回收穩(wěn)定，可為堅(jiān)果中的黃曲霉毒素檢測(cè)提供技術(shù)支持。