張翠綿，賈楠，彭杰麗，馬佳，胡棟，王旭，王占武

（河北省農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源環(huán)境研究所/河北省肥料技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050051）

馬鈴薯糧菜兼用，已成為我國第三大種植作物。近年來，馬鈴薯的種植面積和產(chǎn)量均呈逐年增加趨勢[1，2]，其深加工產(chǎn)品和副產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于造紙、醫(yī)藥、化工等多個(gè)領(lǐng)域，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的馬鈴薯晚疫病已成為世界第一大作物病害，防治困難[3]。生產(chǎn)上除選用抗病品種外，主要采用化學(xué)防治[4]。而不合理使用化學(xué)農(nóng)藥易造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染，長期使用還會產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致防效降低[5，6]。利用植物益生菌進(jìn)行生物防治可以有效克服化學(xué)防治的上述缺點(diǎn)，已受到我國學(xué)者的高度重視[7]。前人利用芽孢桿菌（Bacillus spp.）及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行馬鈴薯晚疫病（potato late blight）防控已有較多研究。李雙東等[8]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌（Botrytis cinerea）EB-28 對盆栽馬鈴薯晚疫病的防效為74.22%。和鳳美等[9]發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens） B9601 對早期的馬鈴薯晚疫病具有較好防效。張笑宇等[10]研究報(bào)道，地衣芽孢桿菌（B.licheniformis） 對馬鈴薯晚疫病也具有較好防效。王翠翠等[11]報(bào)道，拮抗細(xì)菌S34-1 對馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長具有較強(qiáng)的抑制作用。年洪娟等[12]發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞桿菌（Pseudomonas fluorescens） 對疫霉屬（Phytophthora）等引起的植物病害具有較強(qiáng)的防控作用。但截至目前，利用簡單芽孢桿菌（B.simplex）防控馬鈴薯晚疫病的研究鮮有報(bào)道。簡單芽孢桿菌P10 菌株由河北省農(nóng)林科學(xué)院資源環(huán)境研究所微生物工程研究室分離鑒定，前期研究表明，該菌株功能多樣、作用廣譜，可顯著提高小麥和玉米的耐鹽性，并具有促生、溶磷、固氮等特性，對鐮刀菌、絲核菌和腐霉菌等均具有抑制作用[13]。為了從理論上明確P10 菌株菌劑的防病機(jī)制，利用P10 菌株進(jìn)行馬鈴薯晚疫病防治研究，旨為該菌株進(jìn)一步的應(yīng)用研究和生防產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 參試馬鈴薯品種為冀張薯12 號。在聚乙烯塑料盆（32 cm×27 cm）內(nèi)裝土2 kg，調(diào)節(jié)土壤含水量至2%，然后點(diǎn)種馬鈴薯塊種1 粒/盆，在日光溫室內(nèi)培養(yǎng)至出苗后30 d，備用。

1.1.2 菌株 簡單芽孢桿菌P10 菌株由河北省農(nóng)林科學(xué)院資源環(huán)境研究所微生物工程研究室分離鑒定，并提供；馬鈴薯晚疫病菌菌株由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

P10 菌株發(fā)酵菌液和無菌濾液的制備。挑取已活化的P10 菌株，接入事先置入三角瓶的液體培養(yǎng)基（裝液量100 mL/瓶）中，在30 ℃下180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h；按照5%的接種量將種子液接到滅菌的細(xì)菌培養(yǎng)液中，在30 ℃下180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，制成P10 菌株發(fā)酵菌液。將發(fā)酵液在4 ℃下5 000 r/min 離心20 min，沉淀（菌體）經(jīng)無菌水重懸浮，并稀釋至與原發(fā)酵液等體積的菌液，制成P10 活菌體；上清液于無菌條件下經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，得到無菌濾液，保存?zhèn)溆谩?/p>

馬鈴薯晚疫病菌孢子囊懸液的制備。參照宋風(fēng)平等[14]方法進(jìn)行制備。用接種環(huán)在已長好的馬鈴薯晚疫病菌落上輕刮，并用細(xì)菌液體培養(yǎng)基多次沖洗，吸出孢子囊懸液，調(diào)至濃度為104個(gè)/mL，備用。

1.1.3 培養(yǎng)基 P10 菌株培養(yǎng)基為PDA 培養(yǎng)基，成分為馬鈴薯200.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L 和瓊脂18.0 g/L，pH值自然。馬鈴薯晚疫病菌培養(yǎng)基為RTA 培養(yǎng)基，成分為黑麥60.0 g/L、蔗糖15.0 g/L、胡蘿卜汁60.0 mL/L和瓊脂18.0 g/L。發(fā)酵培養(yǎng)液為NB 培養(yǎng)基，成分為牛肉浸膏3.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L 和氯化鈉5.0 g/L，pH值自然。

1.1.4 儀器或設(shè)備 試驗(yàn)用到的儀器或設(shè)備有PYXDHS 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）、YX280A 型高壓蒸汽滅菌器（上海三申醫(yī)療儀器有限公司）、HCB-1300v 型垂直層流潔凈工作臺（青島海爾特種電器有限公司）、Primo Star 正直生物顯微鏡（上海無陌光學(xué)儀器有限公司）、ZWY-2102C 恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智誠分析儀器制造公司） 和三角瓶（規(guī)格250 mL）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 P10 菌株對馬鈴薯晚疫病致病疫霉的抑制效果

1.2.1.1 對致病疫霉菌絲生長的影響。采用平皿對峙培養(yǎng)法[15]，測定P10 菌株活菌體對致病疫霉（P.infestans）的抑制活性；采用打孔法[16]，測定P10 菌株發(fā)酵菌液和無菌濾液對致病疫霉的抑制活性。20 ℃暗培養(yǎng)5 d，觀察P10 菌株的抑菌作用，測量抑菌圈寬度。以只接病原菌的平皿為對照（CK）。每處理均3 次重復(fù)。計(jì)算抑菌率：

抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

1.2.1.2 對致病疫霉菌絲體形態(tài)的影響。測量抑菌圈寬度后，挑取距P10 菌株活菌體、發(fā)酵菌液和無菌濾液最近處的致病疫霉菌落邊緣的菌絲以及對照菌落邊緣的菌絲，在顯微鏡10×40 倍視野下觀察菌絲形態(tài)的變化。

1.2.2 P10 菌株對馬鈴薯晚疫病的防治效果

1.2.2.1 對離體葉片侵染的抑制作用。選擇出苗后20 d、長勢一致的盆栽薯苗，參照胡同樂等[17]方法，設(shè)噴清水（處理Ⅰ，CK）、噴P10 菌株發(fā)酵菌液（處理Ⅱ）、噴P10 菌株無菌濾液（處理Ⅲ）3 個(gè)處理，噴施量均為25 mL/株，每處理均5 次重復(fù)。24 h 后，采集各處理相同部位的葉片，噴濃度為104個(gè)/mL 的馬鈴薯晚疫病菌孢子囊懸液后置于鋪有滅菌濕濾紙的平皿中，20 ℃培養(yǎng)，3 d 后統(tǒng)計(jì)發(fā)病葉片數(shù)量，并參照GB/T 17980.30—2000[18]進(jìn)行病情分級。計(jì)算病情指數(shù)和防病效果：

病情指數(shù)=［Σ（病級數(shù)×該病級的葉片數(shù)）/（調(diào)查總?cè)~片數(shù)×最高病級數(shù)）］×100

防病效果=（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%

1.2.2.2 對盆栽馬鈴薯晚疫病的防治效果。參照王文麗等[19]方法，在溫室（溫度20 ℃左右、空氣相對濕度90%）內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。選取苗齡30 d、生長健壯的盆栽馬鈴薯苗，調(diào)查葉片數(shù)后進(jìn)行試驗(yàn)處理。P10 菌株病害預(yù)防處理4 個(gè)，分別是接種病菌前12 h 噴1 次P10菌株發(fā)酵菌液，接種病菌前12 h 噴1 次P10 菌株無菌濾液，接種病菌前12 h 和接種病菌后12 h 各噴1 次P10 菌株發(fā)酵菌液，接種病菌前12 h 和接種病菌后12 h 各噴1 次P10 菌株無菌濾液；P10 菌株病害治療處理2 個(gè)，分別是接種病菌后12 h 噴1 次P10 菌株發(fā)酵菌液，接種病菌后12 h 噴1 次P10 菌株無菌濾液；以噴清水為對照（CK）。P10 菌株發(fā)酵菌液、無菌濾液和清水的噴施量均為25 mL/株；馬鈴薯晚疫病菌孢子囊懸液的噴施量為10 mL/株。處理后第5 天時(shí)統(tǒng)計(jì)發(fā)病葉片數(shù)，計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和防病效果。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel、DPS 9.5 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 P10 菌株對馬鈴薯晚疫病致病疫霉的抑制效果

2.1.1 對致病疫霉菌絲生長的影響 P10 菌株發(fā)酵菌液對致病疫霉菌絲生長的抑制作用最強(qiáng)，抑菌帶寬度為6.11 mm 且顯著＞其他處理，抑菌率達(dá)到77.8%；活菌體對致病疫霉菌絲生長的抑制作用次之，抑菌率為66.7%；無菌濾液對致病疫霉菌絲生長的抑制作用最弱，抑菌帶寬度為2.13 cm 且顯著＜其他處理，抑菌率為44.4%（表1 和圖1）。

圖1 P10 菌株不同處理下馬鈴薯晚疫病致病疫霉菌絲的生長狀況Fig.1 Growth status of P. infestans hypha under different treatments with P10 strain

表1 P10 菌株對馬鈴薯晚疫病致病疫霉菌絲生長的抑制效果Table 1 Inhibition effect of P10 strain on the growth ofP. infestans causing potato late blight

2.1.2 對致病疫霉菌絲體形態(tài)的影響 顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照致病疫霉的菌絲光滑、粗細(xì)一致、內(nèi)含物分布均勻（圖2a），不正常的菌絲較少；而受P10 菌株抑制的菌絲呈現(xiàn)不同程度的畸變，表現(xiàn)為扭曲變形、粗細(xì)不一（圖2b、c、d），局部膨脹（圖2e），內(nèi)含物分布不均（圖2f）等。

2.2 P10 菌株對馬鈴薯晚疫病的防治效果

2.2.1 對離體葉片侵染的抑制作用 馬鈴薯離體葉片噴施P10 菌株發(fā)酵菌液和無菌濾液24 h 后再接種馬鈴薯晚疫病菌孢子囊懸液，病情指數(shù)分別為30.1 和35.6，二者差異顯著，且均顯著＜CK；防治效果分別為57.2%和49.4%（表2）。表明P10 菌株發(fā)酵菌液和無菌濾液均對馬鈴薯晚疫病具有一定的防治效果，其中發(fā)酵菌液的效果優(yōu)于無菌濾液。

表2 P10 菌株對晚疫病菌侵染離體葉片的抑制作用Table 2 Inhibition effect of P10 strain on in vitro leavesinfection by P. infestans

2.2.2 對盆栽馬鈴薯晚疫病的防治效果 在接種晚疫病菌孢子囊懸液前12 h 噴施P10 菌株發(fā)酵菌液以及接種病菌前后各噴施1 次P10 菌株發(fā)酵菌液的防效較高，分別為73.9%和71.5%；接種病菌后再噴施P10菌株發(fā)酵菌液的治療效果為54.8%；接種病菌前噴施P10 菌株無菌濾液以及接種病菌前后各噴施1 次P10菌株無菌濾液的預(yù)防和治療效果分別為60.3%和57.9%（表3）。表明P10 菌株發(fā)酵菌液的預(yù)防效果好于治療效果，發(fā)酵菌液的效果優(yōu)于無菌濾液。

表3 P10 菌株對盆栽馬鈴薯晚疫病的防效Table 3 Control effect of P10 strain against late blight of potted potato

3 結(jié)論與討論

3.1 簡單芽孢桿菌及P10 菌株對馬鈴薯晚疫病致病疫霉的抑制作用

目前對馬鈴薯晚疫病的防控，除培育推廣抗病品種、使用殺菌藥劑外，利用有益微生物進(jìn)行生物防治成為熱點(diǎn)，涉及的生防菌株主要有枯草芽孢桿菌[20]、解淀粉芽孢桿菌[21]、鏈霉菌[22]、地衣芽孢桿菌[10]和哈茨木霉[23]等，而利用簡單芽孢桿菌防控馬鈴薯晚疫病的研究鮮有報(bào)道。馬鈴薯晚疫病菌由于既侵染馬鈴薯塊莖，又侵染植株的莖葉，存在先種傳、土傳再氣傳的侵染機(jī)制[24]，因此為害重，防治困難。這就對生防菌株提出了更高的要求，生防菌株不僅需要對疫霉菌菌絲、胞囊孢子釋放與萌發(fā)具有抑制作用，還需要具有生態(tài)位的競爭和誘導(dǎo)植物抗性等多種功能，如在土壤、根際和葉際等生態(tài)位上都能發(fā)揮作用將會更加理想。簡單芽孢桿菌就具有這方面的潛力。項(xiàng)鵬等[25]利用簡單芽孢桿菌菌株Sneb545 包衣處理大豆種子，通過拮抗和誘導(dǎo)抗性，有效地防控了大豆胞囊線蟲。孫廣正等[26]分離的簡單芽孢桿菌XX6，通過抑菌和促生機(jī)制，對小麥根腐病的抑制率達(dá)到62.3%。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，P10 菌株生物功能多樣、作用廣譜，不僅能有效防控番茄和黃瓜枯萎病，還能提高小麥和玉米耐鹽性，并顯著促進(jìn)根系發(fā)育[13]。本研究以較難防控的馬鈴薯晚疫病為對象，通過對峙培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，P10 菌株的活菌體、發(fā)酵菌液和無菌濾液均對馬鈴薯晚疫病致病疫霉的菌絲生長具有較強(qiáng)的抑制作用，其中發(fā)酵菌液的抑制效果優(yōu)于無菌濾液。說明P10 菌株對馬鈴薯晚疫病致病疫霉的抑制存在營養(yǎng)競爭和代謝產(chǎn)物抑菌2 種機(jī)制，這為深入研究其代謝產(chǎn)物和抑菌機(jī)理指明了方向。

3.2 P10 菌株對馬鈴薯晚疫病的抗病效果

采用離體葉片侵染及溫室盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種晚疫病病菌前噴施P10 菌株發(fā)酵菌液或無菌濾液均對馬鈴薯晚疫病具有較好的防控效果，而在接種病菌后再噴施則效果較差，且發(fā)酵菌液的效果優(yōu)于無菌濾液。說明除抑菌產(chǎn)物外，P10 菌株活菌體也發(fā)揮了一定的作用，菌株通過生態(tài)位、營養(yǎng)競爭和產(chǎn)生抑菌物質(zhì)等多種機(jī)制抑制了病菌的侵染。此外，試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，噴施P10 菌株發(fā)酵菌液的葉片厚度有所增加，且葉色鮮亮，推測可能是P10 菌株與宿主互作，提高了宿主抗性，存在誘導(dǎo)抗性機(jī)制。P10 菌株具有良好的應(yīng)用潛力，更廣泛地應(yīng)用和作用機(jī)制研究正在進(jìn)行中。