張翠綿，賈楠，彭杰麗，馬佳，胡棟，王旭，王占武

（河北省農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源環(huán)境研究所/河北省肥料技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050051）

馬鈴薯糧菜兼用，已成為我國第三大種植作物。近年來，馬鈴薯的種植面積和產(chǎn)量均呈逐年增加趨勢(shì)[1，2]，其深加工產(chǎn)品和副產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于造紙、醫(yī)藥、化工等多個(gè)領(lǐng)域，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的馬鈴薯晚疫病已成為世界第一大作物病害，防治困難[3]。生產(chǎn)上除選用抗病品種外，主要采用化學(xué)防治[4]。而不合理使用化學(xué)農(nóng)藥易造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染，長期使用還會(huì)產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致防效降低[5，6]。利用植物益生菌進(jìn)行生物防治可以有效克服化學(xué)防治的上述缺點(diǎn)，已受到我國學(xué)者的高度重視[7]。前人利用芽孢桿菌（Bacillus spp.）及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行馬鈴薯晚疫?。╬otato late blight）防控已有較多研究。李雙東等[8]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌（Botrytis cinerea）EB-28 對(duì)盆栽馬鈴薯晚疫病的防效為74.22%。和鳳美等[9]發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens） B9601 對(duì)早期的馬鈴薯晚疫病具有較好防效。張笑宇等[10]研究報(bào)道，地衣芽孢桿菌（B.licheniformis） 對(duì)馬鈴薯晚疫病也具有較好防效。王翠翠等[11]報(bào)道，拮抗細(xì)菌S34-1 對(duì)馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長具有較強(qiáng)的抑制作用。年洪娟等[12]發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞桿菌（Pseudomonas fluorescens） 對(duì)疫霉屬（Phytophthora）等引起的植物病害具有較強(qiáng)的防控作用。但截至目前，利用簡單芽孢桿菌（B.simplex）防控馬鈴薯晚疫病的研究鮮有報(bào)道。簡單芽孢桿菌P10 菌株由河北省農(nóng)林科學(xué)院資源環(huán)境研究所微生物工程研究室分離鑒定，前期研究表明，該菌株功能多樣、作用廣譜，可顯著提高小麥和玉米的耐鹽性，并具有促生、溶磷、固氮等特性，對(duì)鐮刀菌、絲核菌和腐霉菌等均具有抑制作用[13]。為了從理論上明確P10 菌株菌劑的防病機(jī)制，利用P10 菌株進(jìn)行馬鈴薯晚疫病防治研究，旨為該菌株進(jìn)一步的應(yīng)用研究和生防產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 參試馬鈴薯品種為冀張薯12 號(hào)。在聚乙烯塑料盆（32 cm×27 cm）內(nèi)裝土2 kg，調(diào)節(jié)土壤含水量至2%，然后點(diǎn)種馬鈴薯塊種1 粒/盆，在日光溫室內(nèi)培養(yǎng)至出苗后30 d，備用。

1.1.2 菌株 簡單芽孢桿菌P10 菌株由河北省農(nóng)林科學(xué)院資源環(huán)境研究所微生物工程研究室分離鑒定，并提供；馬鈴薯晚疫病菌菌株由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

P10 菌株發(fā)酵菌液和無菌濾液的制備。挑取已活化的P10 菌株，接入事先置入三角瓶的液體培養(yǎng)基（裝液量100 mL/瓶）中，在30 ℃下180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h；按照5%的接種量將種子液接到滅菌的細(xì)菌培養(yǎng)液中，在30 ℃下180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，制成P10 菌株發(fā)酵菌液。將發(fā)酵液在4 ℃下5 000 r/min 離心20 min，沉淀（菌體）經(jīng)無菌水重懸浮，并稀釋至與原發(fā)酵液等體積的菌液，制成P10 活菌體；上清液于無菌條件下經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，得到無菌濾液，保存?zhèn)溆谩?/p>

馬鈴薯晚疫病菌孢子囊懸液的制備。參照宋風(fēng)平等[14]方法進(jìn)行制備。用接種環(huán)在已長好的馬鈴薯晚疫病菌落上輕刮，并用細(xì)菌液體培養(yǎng)基多次沖洗，吸出孢子囊懸液，調(diào)至濃度為104個(gè)/mL，備用。

1.1.3 培養(yǎng)基 P10 菌株培養(yǎng)基為PDA 培養(yǎng)基，成分為馬鈴薯200.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L 和瓊脂18.0 g/L，pH值自然。馬鈴薯晚疫病菌培養(yǎng)基為RTA 培養(yǎng)基，成分為黑麥60.0 g/L、蔗糖15.0 g/L、胡蘿卜汁60.0 mL/L和瓊脂18.0 g/L。發(fā)酵培養(yǎng)液為NB 培養(yǎng)基，成分為牛肉浸膏3.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L 和氯化鈉5.0 g/L，pH值自然。

1.1.4 儀器或設(shè)備 試驗(yàn)用到的儀器或設(shè)備有PYXDHS 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）、YX280A 型高壓蒸汽滅菌器（上海三申醫(yī)療儀器有限公司）、HCB-1300v 型垂直層流潔凈工作臺(tái)（青島海爾特種電器有限公司）、Primo Star 正直生物顯微鏡（上海無陌光學(xué)儀器有限公司）、ZWY-2102C 恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智誠分析儀器制造公司） 和三角瓶（規(guī)格250 mL）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 P10 菌株對(duì)馬鈴薯晚疫病致病疫霉的抑制效果

1.2.1.1 對(duì)致病疫霉菌絲生長的影響。采用平皿對(duì)峙培養(yǎng)法[15]，測(cè)定P10 菌株活菌體對(duì)致病疫霉（P.infestans）的抑制活性；采用打孔法[16]，測(cè)定P10 菌株發(fā)酵菌液和無菌濾液對(duì)致病疫霉的抑制活性。20 ℃暗培養(yǎng)5 d，觀察P10 菌株的抑菌作用，測(cè)量抑菌圈寬度。以只接病原菌的平皿為對(duì)照（CK）。每處理均3 次重復(fù)。計(jì)算抑菌率：

抑菌率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%

1.2.1.2 對(duì)致病疫霉菌絲體形態(tài)的影響。測(cè)量抑菌圈寬度后，挑取距P10 菌株活菌體、發(fā)酵菌液和無菌濾液最近處的致病疫霉菌落邊緣的菌絲以及對(duì)照菌落邊緣的菌絲，在顯微鏡10×40 倍視野下觀察菌絲形態(tài)的變化。

1.2.2 P10 菌株對(duì)馬鈴薯晚疫病的防治效果

1.2.2.1 對(duì)離體葉片侵染的抑制作用。選擇出苗后20 d、長勢(shì)一致的盆栽薯苗，參照胡同樂等[17]方法，設(shè)噴清水（處理Ⅰ，CK）、噴P10 菌株發(fā)酵菌液（處理Ⅱ）、噴P10 菌株無菌濾液（處理Ⅲ）3 個(gè)處理，噴施量均為25 mL/株，每處理均5 次重復(fù)。24 h 后，采集各處理相同部位的葉片，噴濃度為104個(gè)/mL 的馬鈴薯晚疫病菌孢子囊懸液后置于鋪有滅菌濕濾紙的平皿中，20 ℃培養(yǎng)，3 d 后統(tǒng)計(jì)發(fā)病葉片數(shù)量，并參照GB/T 17980.30—2000[18]進(jìn)行病情分級(jí)。計(jì)算病情指數(shù)和防病效果：

病情指數(shù)=［Σ（病級(jí)數(shù)×該病級(jí)的葉片數(shù)）/（調(diào)查總?cè)~片數(shù)×最高病級(jí)數(shù)）］×100

防病效果=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%

1.2.2.2 對(duì)盆栽馬鈴薯晚疫病的防治效果。參照王文麗等[19]方法，在溫室（溫度20 ℃左右、空氣相對(duì)濕度90%）內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。選取苗齡30 d、生長健壯的盆栽馬鈴薯苗，調(diào)查葉片數(shù)后進(jìn)行試驗(yàn)處理。P10 菌株病害預(yù)防處理4 個(gè)，分別是接種病菌前12 h 噴1 次P10菌株發(fā)酵菌液，接種病菌前12 h 噴1 次P10 菌株無菌濾液，接種病菌前12 h 和接種病菌后12 h 各噴1 次P10 菌株發(fā)酵菌液，接種病菌前12 h 和接種病菌后12 h 各噴1 次P10 菌株無菌濾液；P10 菌株病害治療處理2 個(gè)，分別是接種病菌后12 h 噴1 次P10 菌株發(fā)酵菌液，接種病菌后12 h 噴1 次P10 菌株無菌濾液；以噴清水為對(duì)照（CK）。P10 菌株發(fā)酵菌液、無菌濾液和清水的噴施量均為25 mL/株；馬鈴薯晚疫病菌孢子囊懸液的噴施量為10 mL/株。處理后第5 天時(shí)統(tǒng)計(jì)發(fā)病葉片數(shù)，計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和防病效果。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel、DPS 9.5 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 P10 菌株對(duì)馬鈴薯晚疫病致病疫霉的抑制效果

2.1.1 對(duì)致病疫霉菌絲生長的影響 P10 菌株發(fā)酵菌液對(duì)致病疫霉菌絲生長的抑制作用最強(qiáng)，抑菌帶寬度為6.11 mm 且顯著＞其他處理，抑菌率達(dá)到77.8%；活菌體對(duì)致病疫霉菌絲生長的抑制作用次之，抑菌率為66.7%；無菌濾液對(duì)致病疫霉菌絲生長的抑制作用最弱，抑菌帶寬度為2.13 cm 且顯著＜其他處理，抑菌率為44.4%（表1 和圖1）。

圖1 P10 菌株不同處理下馬鈴薯晚疫病致病疫霉菌絲的生長狀況Fig.1 Growth status of P. infestans hypha under different treatments with P10 strain

表1 P10 菌株對(duì)馬鈴薯晚疫病致病疫霉菌絲生長的抑制效果Table 1 Inhibition effect of P10 strain on the growth ofP. infestans causing potato late blight

2.1.2 對(duì)致病疫霉菌絲體形態(tài)的影響 顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照致病疫霉的菌絲光滑、粗細(xì)一致、內(nèi)含物分布均勻（圖2a），不正常的菌絲較少；而受P10 菌株抑制的菌絲呈現(xiàn)不同程度的畸變，表現(xiàn)為扭曲變形、粗細(xì)不一（圖2b、c、d），局部膨脹（圖2e），內(nèi)含物分布不均（圖2f）等。

2.2 P10 菌株對(duì)馬鈴薯晚疫病的防治效果

2.2.1 對(duì)離體葉片侵染的抑制作用 馬鈴薯離體葉片噴施P10 菌株發(fā)酵菌液和無菌濾液24 h 后再接種馬鈴薯晚疫病菌孢子囊懸液，病情指數(shù)分別為30.1 和35.6，二者差異顯著，且均顯著＜CK；防治效果分別為57.2%和49.4%（表2）。表明P10 菌株發(fā)酵菌液和無菌濾液均對(duì)馬鈴薯晚疫病具有一定的防治效果，其中發(fā)酵菌液的效果優(yōu)于無菌濾液。

表2 P10 菌株對(duì)晚疫病菌侵染離體葉片的抑制作用Table 2 Inhibition effect of P10 strain on in vitro leavesinfection by P. infestans

2.2.2 對(duì)盆栽馬鈴薯晚疫病的防治效果 在接種晚疫病菌孢子囊懸液前12 h 噴施P10 菌株發(fā)酵菌液以及接種病菌前后各噴施1 次P10 菌株發(fā)酵菌液的防效較高，分別為73.9%和71.5%；接種病菌后再噴施P10菌株發(fā)酵菌液的治療效果為54.8%；接種病菌前噴施P10 菌株無菌濾液以及接種病菌前后各噴施1 次P10菌株無菌濾液的預(yù)防和治療效果分別為60.3%和57.9%（表3）。表明P10 菌株發(fā)酵菌液的預(yù)防效果好于治療效果，發(fā)酵菌液的效果優(yōu)于無菌濾液。

表3 P10 菌株對(duì)盆栽馬鈴薯晚疫病的防效Table 3 Control effect of P10 strain against late blight of potted potato

3 結(jié)論與討論

3.1 簡單芽孢桿菌及P10 菌株對(duì)馬鈴薯晚疫病致病疫霉的抑制作用

目前對(duì)馬鈴薯晚疫病的防控，除培育推廣抗病品種、使用殺菌藥劑外，利用有益微生物進(jìn)行生物防治成為熱點(diǎn)，涉及的生防菌株主要有枯草芽孢桿菌[20]、解淀粉芽孢桿菌[21]、鏈霉菌[22]、地衣芽孢桿菌[10]和哈茨木霉[23]等，而利用簡單芽孢桿菌防控馬鈴薯晚疫病的研究鮮有報(bào)道。馬鈴薯晚疫病菌由于既侵染馬鈴薯塊莖，又侵染植株的莖葉，存在先種傳、土傳再氣傳的侵染機(jī)制[24]，因此為害重，防治困難。這就對(duì)生防菌株提出了更高的要求，生防菌株不僅需要對(duì)疫霉菌菌絲、胞囊孢子釋放與萌發(fā)具有抑制作用，還需要具有生態(tài)位的競爭和誘導(dǎo)植物抗性等多種功能，如在土壤、根際和葉際等生態(tài)位上都能發(fā)揮作用將會(huì)更加理想。簡單芽孢桿菌就具有這方面的潛力。項(xiàng)鵬等[25]利用簡單芽孢桿菌菌株Sneb545 包衣處理大豆種子，通過拮抗和誘導(dǎo)抗性，有效地防控了大豆胞囊線蟲。孫廣正等[26]分離的簡單芽孢桿菌XX6，通過抑菌和促生機(jī)制，對(duì)小麥根腐病的抑制率達(dá)到62.3%。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，P10 菌株生物功能多樣、作用廣譜，不僅能有效防控番茄和黃瓜枯萎病，還能提高小麥和玉米耐鹽性，并顯著促進(jìn)根系發(fā)育[13]。本研究以較難防控的馬鈴薯晚疫病為對(duì)象，通過對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，P10 菌株的活菌體、發(fā)酵菌液和無菌濾液均對(duì)馬鈴薯晚疫病致病疫霉的菌絲生長具有較強(qiáng)的抑制作用，其中發(fā)酵菌液的抑制效果優(yōu)于無菌濾液。說明P10 菌株對(duì)馬鈴薯晚疫病致病疫霉的抑制存在營養(yǎng)競爭和代謝產(chǎn)物抑菌2 種機(jī)制，這為深入研究其代謝產(chǎn)物和抑菌機(jī)理指明了方向。

3.2 P10 菌株對(duì)馬鈴薯晚疫病的抗病效果

采用離體葉片侵染及溫室盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種晚疫病病菌前噴施P10 菌株發(fā)酵菌液或無菌濾液均對(duì)馬鈴薯晚疫病具有較好的防控效果，而在接種病菌后再噴施則效果較差，且發(fā)酵菌液的效果優(yōu)于無菌濾液。說明除抑菌產(chǎn)物外，P10 菌株活菌體也發(fā)揮了一定的作用，菌株通過生態(tài)位、營養(yǎng)競爭和產(chǎn)生抑菌物質(zhì)等多種機(jī)制抑制了病菌的侵染。此外，試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，噴施P10 菌株發(fā)酵菌液的葉片厚度有所增加，且葉色鮮亮，推測(cè)可能是P10 菌株與宿主互作，提高了宿主抗性，存在誘導(dǎo)抗性機(jī)制。P10 菌株具有良好的應(yīng)用潛力，更廣泛地應(yīng)用和作用機(jī)制研究正在進(jìn)行中。