王 英,胡占升,張曉玉,季麗麗,李 娜,吳會(huì)平

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)室,遼寧 錦州 121001;2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,遼寧 錦州 121001;3.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科,遼寧 錦州 121001;4.盤錦市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,遼寧 盤錦 124013)

膿毒癥后會(huì)引起多種并發(fā)癥[1-2],最常見的受累器官之一為腎臟,進(jìn)而引起膿毒癥相關(guān)急性腎損傷(Sepsis related acute kidney injury,S-AKI)[3]。盡管S-AKI病理生理學(xué)機(jī)制仍不完全清楚,但有害的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)起著關(guān)鍵作用[4]。Maresin 1為促炎癥消退介質(zhì)中的最新家族之一,具有強(qiáng)大的抗炎、促炎癥消退活性[5]。Maresin 1在多種炎癥性疾病中發(fā)揮保護(hù)作用[5]。Maresin 1可下調(diào)腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白介素-6(Interleukin-6,IL-6)的水平進(jìn)而抑制小鼠急性肺損傷[6]。細(xì)胞凋亡為半胱氨酸蛋白酶-1(Cysteine protease-1,Caspase-1)依賴機(jī)制,在調(diào)節(jié)S-AKI中發(fā)揮重要作用。但NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域3(NOD like receptor hot protein domain 3,NLRP3)對(duì)于Caspase-1的激活是必不可少的。抑制NLRP3炎癥體激活有助于減輕AKI的發(fā)展[7]。然而,Maresin 1是否通過調(diào)控NLRP3/Caspase-1對(duì)S-AKI具有保護(hù)作用尚不清楚。因此,本研究擬探討Maresin 1在S-AKI中的作用及其相關(guān)機(jī)制,為其對(duì)S-AKI防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SPF級(jí)雄性SD大鼠103只,6～8周,購自錦州醫(yī)科大學(xué)[編號(hào):SYXK(遼)2019-0007]。Maresin 1(美國Cayman Chemical公司);尼日利亞菌素(Nigericin)(美國Glpbio公司);NLRP3一抗(兔抗大鼠)、Caspase-1一抗(兔抗大鼠)、IL-1β一抗(小鼠抗大鼠)、白介素-18(Interleukin-18,IL-18)一抗(兔抗大鼠)、β-actin一抗(兔抗大鼠)購自英國Abcam公司;ELISA及HE染色試劑盒購自上海Mlbio公司。石蠟切片機(jī)(德國Slee公司);倒置顯微鏡(日本Olympus公司);水平電泳儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備:適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,采用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)制備大鼠模型。2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,備皮消毒,下腹正中線做長(zhǎng)約1.5 cm切口。打開腹腔,分離并牽出盲腸,在盲腸根部用絲線結(jié)扎。用直徑2.6 mm三棱針穿刺3孔,擠出少量糞便后將盲腸回納腹腔,逐層縫合關(guān)腹。術(shù)后皮下注射復(fù)方氯化鈉 30 ml/kg補(bǔ)液。模型大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成CLP組(20只)、CLP+Maresin 1組(15只)、CLP+Maresin 1+Nigericin(NLRP3激活劑,18只)組。另取10只正常大鼠作為Sham(僅行開關(guān)腹操作)組。CLP+Maresin 1組、CLP+Maresin 1+Nigericin組大鼠于術(shù)后1 h單次腹腔注射Maresin 1(4 ng/g,溶于200 μl0.9%氯化鈉溶液)[8]。CLP+Maresin 1+Nigericin組在給予Maresin 1基礎(chǔ)上聯(lián)合單次Nigericin(1 mg/kg)給藥[9]。Sham組和CLP組給予200 μl0.9%氯化鈉溶液。另取40只大鼠按照上述方法分組及治療,每24 h記錄各組大鼠死亡數(shù)量,共7 d,進(jìn)行7 d大鼠存活率統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)期間大鼠死亡43只,實(shí)驗(yàn)遵循國家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。給藥12 h后,處死大鼠用于各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.2 標(biāo)本采集:12 h后,大鼠用2%戊巴比妥鈉麻醉,灌注固定前心臟取血留取血清用于血肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)生化指標(biāo)和血清中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)、腎損傷分子-1(KIM-1)及炎癥因子ELISA檢測(cè)。大鼠采用4%多聚甲醛灌流,取腎臟放至固定液中置于-4 ℃ 48 h,進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋用于免疫組化染色和HE染色。同時(shí)對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉,取新鮮視網(wǎng)膜組織進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.2.3 血清Scr和BUN檢測(cè):采用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 ELISA檢測(cè)血清NGAL、KIM1及炎癥因子水平:將收集的上清,于4 ℃、12000 r/min離心20 min。按照ELISA說明書制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并加樣品,以450 nm波長(zhǎng)測(cè)OD值。

1.2.5 HE染色:石蠟切片(5 μm)脫蠟后PBS洗3次;加蘇木素反應(yīng)2 min,自來水沖洗;加伊紅反應(yīng)1 min,自來水沖洗;脫水透明后封片,顯微鏡拍照觀察。

1.2.6 免疫組織染色:切片常規(guī)脫蠟至水。高壓抗原修復(fù)后于3% H2O2避光10 min。PBS清洗3次。山羊血清孵育30 min。一抗(NLRP3,1∶400;Caspase-1,1∶200)4 ℃過夜。復(fù)溫45 min,PBS清洗3次,二抗孵育1 h,PBS洗滌,鏈霉素親和素1 h。DAB顯色后蘇木素復(fù)染。脫水透明后封片并拍照觀察。

1.2.7 Western blot:BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。電泳,轉(zhuǎn)膜,1% BSA封閉2 h。加入NLRP3(1∶5000)、Caspase-1(1∶5000)、IL-1β(1∶1000)、IL-18(1∶1000)、β-actin(1∶5000)4 ℃孵育過夜。18 h后TBST洗膜,二抗(1∶5000)室溫孵育2 h,ECL顯影。用Image J軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析,組間計(jì)量資料兩兩比較采用LSD-t法;P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Maresin 1對(duì)CLP大鼠腎功能及腎損傷指標(biāo)的影響 與Sham組相比,CLP組Scr、BUN、NGAL、KIM-1水平明顯增加;與CLP組相比,CLP+Maresin 1組Scr、BUN、NGAL、KIM-1水平明顯降低;與CLP+Maresin 1組相比,CLP+Maresin 1+Nigericin組Scr、BUN、NGAL、KIM-1水平有所增加(P<0.05或P<0.01)。見圖1。

注:與Sham組比較,*P<0.05,**P<0.01;與CLP組比較,#P<0.05;與CLP+Maresin 1組比較,△P<0.05圖1 各組Maresin 1對(duì)大鼠血清Scr、BUN、NGAL、KIM-1水平的影響

2.2 Maresin 1對(duì)CLP大鼠腎組織病理學(xué)的影響 Sham組腎組織結(jié)構(gòu)完整、清晰,未見明顯損傷性改變;CLP組和CLP+Maresin 1+Nigericin組可見腎小球萎縮,腎小管明顯擴(kuò)張,間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤;CLP+Maresin 1組腎組織損傷程度均較CLP組和CLP+Maresin 1+Nigericin組減輕。見圖2。

圖2 各組Maresin 1對(duì)大鼠腎組織病理學(xué)的影響(HE染色×400)

2.3 Maresin 1對(duì)CLP大鼠腎組織NLRP3和Caspase-1表達(dá)的影響 Sham組可見少量NLRP3和Caspase-1陽性表達(dá),CLP組和CLP+Maresin 1+Nigericin組可見大量NLRP3和Caspase-1陽性表達(dá),CLP+Maresin 1組NLRP3和Caspase-1陽性表達(dá)較CLP組和CLP+Maresin 1+Nigericin組表達(dá)降低,見圖3。

圖3 各組Maresin 1對(duì)大鼠腎組織NLRP3和Caspase-1表達(dá)的影響(免疫組化染色×400)

2.4 Maresin 1對(duì)CLP大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18蛋白相對(duì)表達(dá)的影響 與Sham組相比,CLP組NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18表達(dá)明顯增加;與CLP組相比,CLP+Maresin 1組NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18表達(dá)明顯降低;與CLP+Maresin 1組相比,CLP+Maresin 1+Nigericin組NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18表達(dá)有所增加(均P<0.05),見圖4。

注:與Sham組比較,*P<0.05,**P<0.01;與CLP組比較,#P<0.05;與CLP+Maresin 1組比較,△P<0.05圖4 各組Western blot檢測(cè)Maresin 1對(duì)大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18蛋白相對(duì)表達(dá)的影響

2.5 Maresin 1對(duì)CLP大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響 與Sham組相比,CLP組TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯增加;與CLP組相比,CLP+Maresin 1組TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯降低;與CLP+Maresin 1組相比,CLP+Maresin 1+Nigericin組TNF-α、IL-1β、IL-6水平有所增加(均P<0.05)。見圖5。

注:與Sham組比較,*P<0.05,**P<0.01;與CLP組比較,#P<0.05;與CLP+Maresin 1組比較,△P<0.05圖5 各組ELISA檢測(cè)Maresin 1對(duì)大鼠血清TNF-α、IL-6,IL-1β水平的影響

2.6 Maresin 1對(duì)CLP大鼠7 d存活率的影響 實(shí)驗(yàn)期間Sham組無大鼠死亡,CLP組大鼠死亡8只,存活2只;CLP+Maresin 1組大鼠死亡5只,存活5只;CLP+Maresin 1+Nigericin組大鼠死亡7只,存活3只。見圖6。

圖6 各組Maresin 1對(duì)大鼠7 d存活率的影響

3 討 論

S-AKI為一種可導(dǎo)致腎功能惡化和高病死率的臨床綜合征。S-AKI的病理生理學(xué)相當(dāng)復(fù)雜,涉及多個(gè)病理途徑,包括中性粒細(xì)胞的激活、活性氧和其他炎癥介質(zhì)的分泌[4]。S-AKI病理表現(xiàn)為腎小管壞死和細(xì)胞腫脹、腎小管擴(kuò)張和炎性細(xì)胞浸潤。我們的研究結(jié)果表明,經(jīng)CLP造模12 h后大鼠血清Scr、BUN、NGAL及KIM-1水平明顯升高,腎組織出現(xiàn)明顯的病理變化,包括腎小球萎縮,腎小管明顯擴(kuò)張,間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤,且血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6明顯增加。這提示本研究模型成功,為下一步的研究奠定了基礎(chǔ)。

炎癥是保護(hù)宿主人體免受外部有害抗原和微生物侵害的重要作用。然而,過度的炎癥反應(yīng)有時(shí)會(huì)超過組織損傷,并可能破壞器官功能[10]。最近的研究已經(jīng)確定,omega-3脂肪酸衍生物,在各種炎癥性疾病中顯示出強(qiáng)烈的抗炎作用[5]。Maresin 1是代表性的Omega-3脂肪酸之一,并且在多種炎癥性疾病模型中顯示出有益的作用[11-12]。研究發(fā)現(xiàn),Maresin 1可通過抑制ROS和 Nrf2/HO-1/GPX4 激活防止鐵死亡引起的肝損傷[13]。Maresin 1通過靶向Nrf2和NF-κB預(yù)防肝纖維化,減少氧化應(yīng)激和炎癥[14]。我們的研究結(jié)果表明,大鼠經(jīng)CLP術(shù)后1 h單次腹腔注射4 ng/g Maresin 1,我們發(fā)現(xiàn),Maresin 1能有效降低大鼠血清Scr、BUN、NGAL及KIM-1水平,有效緩解CLP大鼠腎臟病理變化,同時(shí)也大大降低了血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平,并且降低了CLP大鼠的7 d存活率。以上結(jié)果提示,Maresin 1對(duì)S-AKI引起的相關(guān)腎損傷具有明顯的保護(hù)作用。此外,Maresin 1通過激活PI3K/AKT途徑并抑制跑步機(jī)運(yùn)動(dòng)的骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型的滑膜母細(xì)胞中的NF-κB途徑來抑制IL-1β誘導(dǎo)的MMP-13分泌[15]。MaR1通過抑制創(chuàng)傷性出血性休克誘導(dǎo)大鼠TLR4/p38MAPK/NF-κB通路的激活,有效緩解創(chuàng)傷性出血性休克誘導(dǎo)的肺損傷[6]。Maresin 1治療糖尿病小鼠后能夠減少炎癥因子TNF-α 和血栓素2的產(chǎn)生,從而促進(jìn)傷口愈合[16],以上文獻(xiàn)均佐證了Maresin 1的抗炎作用。

S-AKI期間,腎小管上皮細(xì)胞存在多種程序性死亡途徑。近年來,新的證據(jù)表明,除了壞死和凋亡外,細(xì)胞焦亡在S-AKI的發(fā)病機(jī)制中也起著重要作用[17]。細(xì)胞焦亡由NLRP3 Caspase-1軸介導(dǎo),該軸誘導(dǎo)細(xì)胞膜上形成孔隙,導(dǎo)致大量炎性細(xì)胞因子的釋放。先前對(duì)缺血性中風(fēng)的研究表明,NLRP3炎癥小體介導(dǎo)Caspase-1激活,導(dǎo)致促炎因子分泌,然后出現(xiàn)細(xì)胞焦亡[18-19]。NLRP3炎性體激活導(dǎo)致缺血再灌注誘導(dǎo)的腎損傷[20]。在本研究中,我們建立了CLP大鼠模型,以觀察腎臟的炎癥和細(xì)胞焦亡。結(jié)果顯示,CLP造模12 h后,腎組織NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)明顯增加,血清中也存在大量炎癥因子。研究發(fā)現(xiàn),Maresin 1對(duì)NLRP3炎癥體激活具有抑制作用。因此,我們推測(cè)Maresin 1對(duì)S-AKI誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是通過抑制NLRP3介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡實(shí)現(xiàn)的。本研究進(jìn)一步證實(shí)了大鼠經(jīng)CLP術(shù)后1 h單次腹腔注射了4 ng/g Maresin 1,12 h后我們發(fā)現(xiàn),Maresin 1能有效降低大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)。NLRP3和Caspase-1是與細(xì)胞焦亡相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。正如我們的觀察結(jié)果所示,Maresin 1改善了S-AKI誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),并抑制了NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的表達(dá)。本研究在給予Maresin 1的同時(shí)又聯(lián)合給予了NLRP3激活劑Nigericin,有趣的是,Nigericin處理部分逆轉(zhuǎn)Maresin 1的保護(hù)作用,這進(jìn)一步提示,Maresin 1對(duì)S-AKI的保護(hù)作用可能是通過抑制NLRP3/Caspase-1通路實(shí)現(xiàn)的。

總之,本研究證實(shí)了Maresin 1通過抑制NLRP3/Caspase-1軸誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),對(duì)S-AKI發(fā)揮保護(hù)作用。該結(jié)果為S-AKI患者發(fā)現(xiàn)了一種新的基于Maresin 1的治療方法,阻斷NLRP3/Caspase-1軸可能是S-AKI的一種有希望的治療方法。然而,Maresin 1對(duì)NLRP3/Caspase-1軸的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未在本研究中得到徹底研究。今后,我們將從轉(zhuǎn)錄調(diào)控的角度探討Maresin 1對(duì)NLRP3/Caspase-1的直接調(diào)控機(jī)制。