張 婧,衛(wèi) 瑋,韋紅梅,薛茜茜,金 玲,張 楠,吳 賓

(1.新疆軍區(qū)總醫(yī)院營養(yǎng)科,新疆 烏魯木齊 830000;2.新疆軍區(qū)總醫(yī)院檢驗科,新疆 烏魯木齊 830000;3.新疆軍區(qū)總醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科,新疆 烏魯木齊 830000;4.新疆軍區(qū)總醫(yī)院皮膚科,新疆 烏魯木齊 830000)

肺動脈高壓(Pulmonary arterial hypertension,PAH)是一種常見且復(fù)雜的嚴(yán)重危害人類健康的一種進行性臨床綜合征[1-3]。根據(jù)2022年P(guān)AH歐洲指南[4],低氧性肺動脈高壓(Hypoxia-induced pulmonary hypertension,HPH)劃歸于PAH 第三類別,即肺疾病和(或)低氧相關(guān)性 PAH。HPH條件下,肺血管壓力增高及慢性缺氧可直接導(dǎo)致右心舒縮功能障礙,進一步引發(fā)右心室重塑、右心功能衰竭、心律失常甚至導(dǎo)致患者死亡[5-6],因此,尋找有效治療藥物和改善HPH診療現(xiàn)狀具有重要而現(xiàn)實的意義。

水仙環(huán)素(Narciclasine,Nar)又稱為石蒜西定醇,是一種從石蒜科植物中提取的異氰化物生物堿類的天然活性物質(zhì),具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗雌激素等生物活性[7-9]。特別是有研究顯示,水仙環(huán)素可減輕膿毒血癥所誘發(fā)的肺損傷[9]和心肌損傷[10],而水仙環(huán)素在HPH中的作用尚不清楚。本研究依托我院低壓低氧人工實驗艙建立HPH大鼠模型,旨在明確和闡釋水仙環(huán)素在HPH右心室重塑中的重要作用及可能機制,為改善HPH右心室重塑尋找潛在治療藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SD大鼠,雄性,8周齡,體重220～260 g,購買于新疆醫(yī)科大學(xué)動物中心; 水仙環(huán)素(批號:29477-83-6)的純度大于99.9%; BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、5×loading buffer、蛋白酶/磷酸酶抑制劑Cocktail購買于碧云天公司;蛋白Marker購買于北京Applygen公司;Masson染色試劑盒、一氧化氮(Nitric oxide,NO)檢測試劑盒、一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOS)分型檢測試劑盒、腦鈉肽(Brain natriuretic peptide,BNP)ELISA檢測試劑盒、內(nèi)皮素-1(Endotheli-1,ET-1)ELISA檢測試劑盒均購買于南京建成生物有限公司;核因子κB/p65(NF-κB/p65)抗體、肌肉環(huán)指蛋白1(Muscle-specific RING finger protein 1,MuRF1)抗體、大電導(dǎo)鈣激活鉀通道β1亞基(Large conductance Ca2+-activated K+channels,BK-β1)購買于Abcam公司;內(nèi)參GAPDH抗體、HRP標(biāo)記的熒光二抗購買于CST公司;電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、ECL成像系統(tǒng)、全自動酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HPH大鼠模型的建立:依托我院新疆特殊環(huán)境醫(yī)學(xué)重點實驗室的低壓低氧人工實驗艙建立HPH大鼠模型,將實驗艙的大氣壓設(shè)置為約55 kPa,將氧濃度設(shè)置為100 ml/L。方艙內(nèi)有負壓監(jiān)測儀,用來監(jiān)測反饋艙內(nèi)的負壓值,并將其始終維持在目標(biāo)值。每天的間斷低氧時間控制在8 h,大鼠始終能夠自由進食及飲水,此環(huán)境維持6周。

1.2.2 實驗分組:將SD大鼠隨機分為對照組(NC組)、對照+Nar組(NC+Nar組)、HPH組、HPH+Nar組(HPH+Nar組)。HPH組和HPH+Nar組置于低壓低氧人工實驗艙內(nèi)維持6周,NC組和NC+Nar組置于常壓常氧SPF環(huán)境中維持6周。從第5周開始, NC+Nar組和HPH+Nar組給予Nar[0.1 mg/(kg·d)]灌胃維持2周,NC組和HPH組給予同等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃維持2周。

1.2.3 心導(dǎo)管測定血流動力學(xué)指標(biāo):腹腔注射1.5%的苯巴比妥鈉麻醉大鼠,分離右側(cè)頸外靜脈,微導(dǎo)管一端插入頸外靜脈,導(dǎo)管另一端接入壓力傳感器,將微導(dǎo)管并緩慢向前推,經(jīng)過上腔靜脈、右房、三尖瓣直至進入右心室、肺動脈干,維持此狀態(tài)10 min,使用Powerlab系統(tǒng)監(jiān)測大鼠平均肺動脈壓(mean Pulmonary arterial pressure,mPAP)、右心室收縮壓(Right ventricular systolic pressure,RVSP)、右室壓力最大上升/下降速率(±dp/dtmax),同時監(jiān)測心率(Heart rate,HR)變化。

1.2.4 右室肥厚程度的評估:大鼠稱重,測得小鼠體重(Body weight,BW)。分離大鼠心臟,按大鼠心臟解剖要求,將右心室(RV)與左心室(LV)和室間隔(S)分離并稱重。以右心室肥厚指數(shù)(Right Ventricular Hypertrophy Index,RVHI)和RV/BW反映右心室肥厚程度,RVHI=RV/(LV+S)。

1.2.5 Masson染色:4%多聚甲醛固定大鼠心臟,石蠟包埋,切片,按說明書進行染色。隨機選取5個視野,測量心肌膠原面積,計算膠原容積分?jǐn)?shù)(Collagen volume fraction,CVF),CVF=膠原面積/總面積。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達:分離大鼠肺臟,常規(guī)提取組織蛋白,BCA法定量,加入稀釋的上樣緩沖液。配置SDS-PAGE電泳凝膠,按照蛋白定量的濃度和每孔40 μg蛋白的量,計算加入到每個泳道的蛋白體積,上樣,濃縮膠電泳的條件為:60～70 V,30 min;分離膠電泳的條件為: 120～130 V,90 min。然后轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜設(shè)置的條件為200～280 mA,時間為1.5～2.5 h。牛奶封閉,孵育一抗過夜,第2天孵育二抗,ECL發(fā)光,保存圖片用于分析。

1.2.7 比色法測定血漿NO和NOS水平:測定完大鼠血液動力學(xué)指標(biāo)后,用抗凝管收集大鼠血液3 ml,離心,吸取和保存上層血漿。按照NO檢測試劑盒和NOS檢測試劑盒要求配置相應(yīng)的工作液,比色法測定波長為530 nm處的吸光度值,按公式計算NO、總NOS、誘導(dǎo)型NOS(iNOS)活力。

1.2.8 ELISA法測定血漿ET-1和BNP水平:測定完大鼠血液動力學(xué)指標(biāo)后,用抗凝管收集大鼠血液3 ml,離心,吸取和保存上層血漿。將各組樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入到相應(yīng)孔,孵育2 h,洗板。加生物素化抗體,孵育1 h,洗板。TMB顯色,加終止液,混勻后立即測量A450值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量數(shù)據(jù)均表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差,三組及三組以上的統(tǒng)計比較采用單因素方差分析,然后用Student-Newman-Keuls檢驗進行組間比較;P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 水仙環(huán)素對HPH大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)的影響 與NC組和NC+Nar組相比,HPH組mPAP、RVSP、±dp/dtmax均顯著增加(均P<0.05),HR無顯著的統(tǒng)計學(xué)差異;與HPH組相比,HPH+Nar組mPAP、RVSP、±dp/dtmax均顯著降低(均P<0.05),HR無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。見表1。

表1 各組大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)mPAP、RVSP、±dp/dtmax和HR比較

2.2 水仙環(huán)素對HPH大鼠血漿血管活性物質(zhì)水平的影響 與NC組和NC+Nar組相比,HPH組ET-1和BNP顯著增加(均P<0.05),NO、總NOS和iNOS顯著降低(均P<0.05);與HPH組相比,HPH+Nar組ET-1和BNP顯著降低(均P<0.05),NO、總NOS和iNOS顯著增加(均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血漿血管活性物質(zhì)ET-1、NO、總NOS、iNOS和BNP比較

2.3 水仙環(huán)素對HPH大鼠右心室心肌肥厚的影響 與NC組和NC+Nar組相比,HPH組RVHI、RV/BW均顯著增加(均P<0.05);與HPH組相比,HPH+Nar組RVHI、RV/BW均顯著降低(均P<0.05)。見圖1。

注:與NC組比較,*P<0.05;與NC+Nar組比較,#P<0.05;與HPH組比較,△P<0.05圖1 各組大鼠右心室心肌肥厚指標(biāo)比較

2.4 水仙環(huán)素對HPH大鼠右心室重塑的影響 與NC組和NC+Nar組相比,HPH組右心室CVF顯著增加(均P<0.05),心肌纖維化水平顯著增加;與HPH組相比,HPH+Nar組右心室CVF顯著降低(均P<0.05),心肌纖維化水平顯著降低。見圖2。

注:與NC組比較,*P<0.05;與NC+Nar組比較,#P<0.05;與HPH組比較,△P<0.05圖2 各組大鼠右心室纖維化指標(biāo)比較

2.5 水仙環(huán)素對HPH大鼠肺動脈NF-κB/MuRF1/BK-β1通路的影響 與NC組和NC+Nar組相比,HPH組大鼠肺動脈p65和MuRF1表達顯著增加(均P<0.05),BK-β1表達顯著降低(P<0.05);與HPH組相比,HPH+Nar組大鼠肺動脈p65和MuRF1表達顯著降低(均P<0.05),BK-β1表達顯著增加(P<0.05)。見圖3。

注:與NC組比較,*P<0.05;與NC+Nar組比較,#P<0.05;與HPH組比較,△P<0.05圖3 各組大鼠肺動脈p65、MuRF1、BK-β1表達比較

3 討 論

PAH具有高患病率、高致殘率、高病死率的特點,目前全球PAH患者高達1億人,是影響人類健康的重大疾病[11-13]。2022年ESC和ERS聯(lián)合制訂的肺動脈高壓指南制定的PAH診斷標(biāo)準(zhǔn)是:海平面、靜息條件下右心導(dǎo)管測定的mPAP≥25 mmHg[11-12,14]。HPH歸為PAH第三大類別,這是我國臨床中常見的心肺血管疾病,它也是肺動脈高壓中的一個極其重要的類型[5]。

目前HPH發(fā)病機制尚未完全闡明,治療上主要通過藥物擴張肺動脈來降低肺動脈壓力,只能部分緩解患者臨床癥狀和改善生活質(zhì)量,并不能有效降低病死率,因此需要進一步尋找有效的治療藥物和診療策略[5,15]。在HPH發(fā)生發(fā)展的過程中,右心室重塑是不得不面對的問題,后續(xù)引發(fā)的右心衰、心律失常是HPH患者死亡的主要原因和心血管事件的重要危險因素[16- 17]。在本研究中,我們成功建立了HPH大鼠模型,我們發(fā)現(xiàn),與NC組相比,HPH組mPAP、RVSP、±dp/dtmax均顯著增加,促進血管收縮的血漿ET-1顯著增加,促進血管舒張的血漿NO、總NOS和iNOS顯著降低,心衰指標(biāo)BNP顯著增加,右室心肌肥厚指標(biāo)RVHI和RV/BW顯著增加,右室纖維化指標(biāo)CVF顯著增加,這些指標(biāo)的變化與文獻報道的是相一致的[16-18]。

水仙環(huán)素作為一種異氰化物生物堿,具有重要的心臟、肺臟、肝臟保護作用[9-10,19-20]。Tang等[10]報道了水仙環(huán)素通過調(diào)控自噬減輕脂多糖誘導(dǎo)的心肌損傷。Duan等[9]報道了水仙環(huán)素通過抗炎、抗氧化、抗凋亡的方式減輕脂多糖誘導(dǎo)的肺損傷。Tian等[20]報道了水仙環(huán)素通過抑制CD4+T細胞激活減輕刀豆蛋白A誘導(dǎo)的肝臟損傷。大量的研究已經(jīng)顯示,炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡、自噬等多種生物學(xué)過程參與了HPH模型動物右心室重塑[16-17],而水仙環(huán)素在HPH右心室重塑中的作用尚不明確。在本研究中,我們首次發(fā)現(xiàn),水仙環(huán)素治療的HPH大鼠中mPAP、RVSP、±dp/dtmax顯著降低,促進血管收縮的血漿ET-1顯著降低,促進血管舒張的血漿NO、總NOS和iNOS顯著增加,心衰指標(biāo)BNP顯著降低,右室心肌肥厚指標(biāo)RVHI和RV/BW顯著降低,右室纖維化指標(biāo)CVF顯著降低,這提示我們,水仙環(huán)素可通過改善HPH大鼠血液動力學(xué)和調(diào)控血管活性物質(zhì)平衡減輕缺氧所導(dǎo)致的肺動脈壓力持續(xù)增加,進一步減輕HPH大鼠右心室肥厚和心肌重塑。

大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(Large conductance Ca2+-activated K+channels,BK)由α亞基(孔洞形成亞基)和β亞基(調(diào)節(jié)亞基)構(gòu)成,屬于一種鈣敏感的電壓依賴鉀通道,其中BK-β1亞基主要表達在血管平滑肌上,與血管舒縮功能有著密切的關(guān)系[21-22]。越來越多的研究顯示,BK-β1可能參與了冠心病、糖尿病、房顫、高血壓等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程[23-24],但是BK-β1在HPH中的作用尚不清楚。我們的前期研究顯示,在糖尿病小鼠模型中, NF-κB可促進E3泛素連接酶MuRF1介導(dǎo)的BK-β1降解,冠脈平滑肌BK-β1表達降低導(dǎo)致BK通道病變,并進一步引發(fā)冠脈舒縮功能障礙,NF-κB/MuRF1/BK-β1通路可能血管相關(guān)性病變的重要靶點[25- 26]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn),與對照大鼠相比,HPH大鼠肺動脈平滑肌p65和MuRF1表達顯著增加,BK-β1表達顯著降低,而水仙環(huán)素治療的HPH大鼠較安慰劑組大鼠肺動脈平滑肌p65和MuRF1表達顯著降低,BK-β1表達顯著增加。這提示我們,HPH條件下,NF-κB激活,促進MuRF1介導(dǎo)的BK-β1降解,引發(fā)BK通道病變和肺動脈收縮,從而導(dǎo)致肺動脈壓的增加;而水仙環(huán)素可抑制NF-κB激活,進一步抑制MuRF1介導(dǎo)的BK-β1降解,從而改善HPH進展和HPH右心室重塑,NF-κB/MuRF1/BK-β1通路可能是水仙環(huán)素在HPH大鼠模型中發(fā)揮保護作用的重要機制。

本研究也有一定的不足之處。一是只進行了動物實驗,未在細胞實驗中進行驗證;二是BK-β1降解機制尚不清楚,除NF-κB/MuRF1通路外,不排除有其他上游信號通路參與BK-β1的降解。以上不足均需在后續(xù)實驗中進一步驗證與探索。

綜上所述,結(jié)合本實驗結(jié)果和既往文獻,我們發(fā)現(xiàn)水仙環(huán)素可改善HPH大鼠右心室重塑,其機制可能與抑制肺動脈平滑肌中NF-κB/MuRF1信號通路介導(dǎo)的BK-β1降解有關(guān)。水仙環(huán)素可能是HPH治療的重要植物提取物,本研究為水仙環(huán)素用于抑制HPH進展和右心室重塑提供了一定的實驗依據(jù)。