曹雪峰,趙 亮,劉旭東,段鳳梅,董天鑫,姬云飛

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科,河北 承德 067000;2.承德醫(yī)學(xué)院藥理教研室,河北 承德 067000;3.承德市中心醫(yī)院麻醉疼痛科,河北 承德 067000)

右美托咪定(Dexmedetomidine,DEX)目前被認(rèn)為是一種α2腎上腺素受體高選擇性激動(dòng)劑,具有鎮(zhèn)靜、輔助鎮(zhèn)痛和抗焦慮的作用,受到麻醉科,重癥監(jiān)護(hù)室,兒科等科室的廣泛關(guān)注[1-2]。有報(bào)道稱,DEX可以減輕膿毒癥模型引起的全身炎癥[3]。另有研究表明,DEX可以抑制細(xì)胞凋亡保護(hù)組織免受缺血缺氧損傷并改善細(xì)胞的適應(yīng)性缺氧[4-6]。DEX通過(guò)減少活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和乳酸等有害代謝物的產(chǎn)生提高細(xì)胞活力[7-8]。近期研究表明,DEX有心臟保護(hù)、肺保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)和腎保護(hù)等作用[9-12]?？偟膩?lái)說(shuō),這些數(shù)據(jù)提示DEX通過(guò)不同的分子機(jī)制在多種疾病中起圍術(shù)期器官保護(hù)作用。然而,DEX對(duì)心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響鮮有報(bào)道。

大量研究表明,在圍術(shù)期,麻醉藥物和心臟預(yù)處理之間存在重要關(guān)聯(lián)[13-14]。心肌肥大是一種常見(jiàn)的預(yù)處理,它對(duì)各種藥物刺激具有形態(tài)學(xué)適應(yīng)性[15]。然而,DEX預(yù)處理是否誘發(fā)心肌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生適應(yīng)性變化尚不清楚。同時(shí),這種心肌肥大對(duì)心肌是保護(hù)還是損傷,值得研究。這種類似生理性心肌肥厚的形態(tài)變化可能是一種會(huì)逆轉(zhuǎn)病理性肥厚和預(yù)防有害結(jié)果的新治療方法。這將是研究DEX在圍術(shù)期發(fā)揮心肌保護(hù)作用的新的視角,有待為臨床治療心臟疾病提供新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器:Thermo-150i細(xì)胞孵箱,Thermo公司主營(yíng)產(chǎn)品;MA100N倒置顯微鏡,日本株式會(huì)社尼康Nikon公司產(chǎn)品;低溫恒速變速離心機(jī),美國(guó)賽默飛世爾Thermo公司產(chǎn)品;Odyssey生物安全紅外熒光掃描成像儀,中國(guó)科協(xié)有限公司;FV3000激光掃描共聚焦系統(tǒng),日本奧巴株式會(huì)社。

1.1.2 主要藥品與試劑:右美托咪(批號(hào):21080731,純度 99%) 購(gòu)自美國(guó)Selleck生物科技有限公司;高糖培養(yǎng)基DMEM購(gòu)于Hyclone(批號(hào):8119045,中國(guó)),規(guī)格:每瓶500 ml;普諾賽胎牛血清,規(guī)格:每瓶500 ml,購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司(批號(hào):SA210518,中國(guó));胰蛋白酶購(gòu)于索萊寶(批號(hào):20210930,中國(guó)),規(guī)格:每瓶100 ml;二甲基亞砜購(gòu)于碧云天(批號(hào):EZ1609C224,中國(guó)),規(guī)格:每瓶100 ml;ANP一抗購(gòu)于圣克魯斯生物技術(shù)有限公司(批號(hào):sc-515701,中國(guó)),規(guī)格:每支100 μl;BNP一抗購(gòu)于abcom公司(批號(hào):ab-23990,英國(guó)),規(guī)格:每支100 μl;β-MHC一抗購(gòu)于圣克魯斯生物技術(shù)有限公司(批號(hào):sc-53089,中國(guó)),規(guī)格:每支100 μl; alpha-actinin一抗購(gòu)于CST生物技術(shù)有限公司(批號(hào):6487T美國(guó)),規(guī)格:每支100 μl。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 新生大鼠心肌細(xì)胞(NRVMs)分離培養(yǎng):無(wú)菌條件下把乳鼠(1～3 d)心室肌剪成0.8 mm×0.8 mm×0.8 mm,用DMEM緩沖液洗1 次。棄去DMEM上清液,加入37 ℃溫浴的0.25 %胰蛋白酶進(jìn)行消化,邊消化邊搖動(dòng),目的是讓組織塊充分與胰蛋白酶接觸。丟掉第一次胰蛋白酶消化液,目的是去除血細(xì)胞和其他雜質(zhì),將已消化下的心肌細(xì)胞懸液用巴氏滴管吸至含有35 ml 完全培養(yǎng)液(含15%胎牛血清)的無(wú)菌離心管中,4 ℃,2000 r/min 離心3 min,棄掉離心后上清液,細(xì)胞沉淀再次用培養(yǎng)液重懸。經(jīng)200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾后,用國(guó)際通用的差速貼壁分選法細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1.5 h后,鏡下人工計(jì)數(shù)、統(tǒng)計(jì)細(xì)胞密度,以1.8×104/cm2細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞中皿,3 d后取出用于實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)方案已通過(guò)河北省承德市承德醫(yī)學(xué)院動(dòng)物保護(hù)及動(dòng)物使用委員會(huì)批準(zhǔn),并完全達(dá)到《國(guó)家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心小動(dòng)物區(qū)動(dòng)物使用》的要求。

1.2.2 原代乳鼠心肌細(xì)胞表面積測(cè)量:SD乳鼠心肌細(xì)胞消化、測(cè)密度后按照每孔3×105細(xì)胞接種于加有24 mm無(wú)菌蓋玻片中,不同組別分別加入0.9%氯化鈉溶液或右美托咪定(5 μmol/L)孵育細(xì)胞24 h,應(yīng)用醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量單個(gè)細(xì)胞的表面積。

1.2.3 免疫熒光化學(xué)染色:選取不同組別的心肌細(xì)胞用PBS沖洗3遍,冷甲醇固定30 min,加TritonX2100,1%BSA室溫孵育1 h,封閉羊血清封閉5 h后,加入一抗37 ℃孵育,熒光二抗37 ℃孵育,運(yùn)用共聚焦成像系統(tǒng)觀察蛋白的定位和表達(dá)。

1.2.4 Western blot:取不同組別的心肌細(xì)胞(數(shù)量約2×106～3×106)吸管吹打或機(jī)械研磨后冰里放置30 min,離心(13520 r/min、4 ℃、16 min),小心吸取上清液,嚴(yán)格按照Bradford公司試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。100 ℃煮5 min,12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì),快速轉(zhuǎn)膜30 min,快速封閉液室溫封閉20 min。一抗4 ℃過(guò)夜,第二天加入Ⅱ抗室溫孵育1 h后,化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光劑DAB 顯影,凝膠成像儀分析系統(tǒng)掃描,計(jì)算目的條帶與GAPDH的相對(duì)灰度值作為各蛋白表達(dá)的相對(duì)含量。

1.2.5 CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性:細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到70%～95%時(shí),收集消化下的細(xì)胞并人工計(jì)數(shù),小心吹打混勻制成細(xì)胞懸浮液,將密度均勻的5000個(gè)細(xì)胞加入96孔板中。將處理板孵育24 h。更換新鮮1%FBS+DMEM低血清培養(yǎng)液,隨機(jī)分為四組,每組6個(gè)復(fù)孔,并設(shè)置空白對(duì)照孔。在96孔細(xì)胞板中精準(zhǔn)加入12 μl CCK8原液,制成10%的CCK8工作液。細(xì)胞孵箱內(nèi)培育90 min后,酶標(biāo)儀震蕩混勻450 nm檢測(cè)吸光強(qiáng)度(氣泡會(huì)影響測(cè)定)。

1.2.6 離體原代心肌肥厚模型建立:血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大:細(xì)胞貼壁3 d后,用含有1% FBS的維持培養(yǎng)液替換正常的細(xì)胞培養(yǎng)液,加入濃度為10-7mol/L的Ang Ⅱ,在37 ℃、5% CO2、95%濕度環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng),隔48 h換1次液,培養(yǎng)3 d后,檢測(cè)心肌細(xì)胞表面積、細(xì)胞體積、肥大相關(guān)基因和蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。組間比較應(yīng)用ANOVA分析。應(yīng)用Bonferroni校正t檢驗(yàn)進(jìn)行多組比較,應(yīng)用配對(duì)或非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行單個(gè)比較。雙尾概率P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠心肌細(xì)胞的形態(tài)變化 與C組比較,D組細(xì)胞面積增大,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)圖1A、B。

2.2 兩組大鼠心肌細(xì)胞心房利鈉肽(Atrialnatriureticpeptide,ANP)、腦鈉肽(Brain natriuretic peptide,BNP)和β-肌球蛋白重鏈(β-Myosin heavy Chain,β-MHC)蛋白的表達(dá) 與C組比較,D組的ANP、BNP、β-MHC蛋白表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見(jiàn)圖2A、B。

注:左圖為Western blot檢測(cè)C組和D組的心肌細(xì)胞ANP、BNP和β-MHC表達(dá)結(jié)果,以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照;右圖為Western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞ANP、BNP和β-MHC的相對(duì)表達(dá),與C組比較,*P<0.05,**P<0.001圖2 DEX誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)

2.3 CCK8檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞活性 與CTL組比較,D組(5 μmol/L)細(xì)胞活性明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)圖3。

注: CTL、對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組分別加DEX(1、2、5 μmol/L)處理24 h,與CTL組比較,*P<0.01圖3 DEX增加了心肌細(xì)胞的活性

2.4 三組大鼠心肌細(xì)胞ANP、BNP和β-MHC蛋白的表達(dá) D組停藥24 h后ANP、BNP、β-MHC蛋白表達(dá)明顯恢復(fù),接近C組。而A組停藥24 h后ANP、BNP、β-MHC蛋白表達(dá)并未恢復(fù)正常(圖4)。

注:C組為無(wú)血清培養(yǎng)基處理心肌細(xì)胞48 h;A組為Ang Ⅱ(1 μmol/L)處理心肌細(xì)胞24 h后,換成無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)心肌細(xì)胞24 h;D組為DEX處理心肌細(xì)胞24 h后,換成無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)心肌細(xì)胞24 h。圖4 三組大鼠心肌細(xì)胞ANP、BNP和β-MHC蛋白的表達(dá)

3 討 論

相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道心血管疾病已成為人類致死的首位元兇[16]。隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高和人們生活方式的改善,心血管疾病的患病率和病死率逐年攀升,并呈現(xiàn)年輕化,其中心肌肥大是引起心血管疾病病死率逐年升高的一個(gè)主要因素。心肌肥大是一種適應(yīng)性和代償性機(jī)制,在有害刺激下保持心輸出量。然而,長(zhǎng)期的刺激會(huì)導(dǎo)致慢性肥厚,并可能導(dǎo)致心力衰竭,進(jìn)而導(dǎo)致患者死亡。由于心肌細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞,增殖能力有限,心臟通過(guò)肥厚性重塑改變其體積和肌肉質(zhì)量,以增加收縮力和工作負(fù)荷。在這種動(dòng)態(tài)反應(yīng)中,心肌細(xì)胞體積增大,形狀變形,基因表達(dá)改變,細(xì)胞骨架和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)均發(fā)生重塑。這種性質(zhì)的心肌肥厚稱之為病理性心肌肥厚。病理性心肌肥厚主要由于心肌對(duì)持續(xù)性不良負(fù)荷增加的一種適應(yīng)性反應(yīng),如這種刺激得不到緩解,會(huì)導(dǎo)致各種惡性事件的發(fā)生。比如臨床上常見(jiàn)的惡性心律失常及心力衰竭,同時(shí)心肌細(xì)胞可能發(fā)生多種形式的損傷,如凋亡、壞死、焦亡、鐵死亡、纖維化,這種損傷均可以導(dǎo)致心功能進(jìn)一步下降和心室惡性重構(gòu)的發(fā)生。這種肥厚通常認(rèn)為是不可逆轉(zhuǎn)的,但也有報(bào)道在一定的條件下是可逆的[17],而這一特定條件正是可逆性臨床干預(yù)的靶點(diǎn)。這種特點(diǎn)的心肌肥厚在發(fā)生的初級(jí)階段即代償階段,也是一種相對(duì)保護(hù)心肌的適應(yīng)性改變。另一種心肌肥厚是生理性心肌肥厚,發(fā)生人群比如長(zhǎng)期體育鍛煉的人員或妊娠婦女等,隨著時(shí)間的推移可維持心臟功能,這種變化通常是可逆的[18]。長(zhǎng)期負(fù)荷內(nèi)運(yùn)動(dòng)是一種慢性心臟刺激因素,可以誘導(dǎo)心臟發(fā)生生理性心肌肥厚,這是一種良性適應(yīng)性改變,有助于提高心功能,同時(shí)對(duì)病理性的心肌損傷具有保護(hù)效應(yīng)。因此,心肌肥大是一個(gè)平衡的過(guò)程:當(dāng)心肌肥大得到緩解時(shí),它是適應(yīng)性和代償性的,并對(duì)心臟收縮產(chǎn)生有益的影響;當(dāng)它是慢性得不到緩解的時(shí)候,它會(huì)變得不適應(yīng),并為病理疾病打開(kāi)了道路。

DEX目前被人們廣泛認(rèn)為是一種α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑,并且具有高度選擇性。應(yīng)用廣泛,備受臨床醫(yī)生的青睞,多用于手術(shù)麻醉、緩解患者焦慮及鎮(zhèn)靜。α2受體廣泛分布于心血管、中樞、外周神經(jīng)系統(tǒng)和血小板中,在人體發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。DEX 通過(guò)抑制皮質(zhì)類固醇和皮質(zhì)醇的分泌,降低體外循環(huán)(CPB)后血中cTnI和CK-MB的水平,而這些因子均可以加重心肌細(xì)胞的損傷,促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生。DEX減少心肌缺血/再灌注損傷中的促炎細(xì)胞因子和氧化產(chǎn)物,還有研究顯示,DEX可以上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá),下調(diào)促凋亡因子Bax的表達(dá),從而減輕心肌凋亡的發(fā)生,起到心肌保護(hù)的作用。DEX通過(guò)抑制線粒體活性氧生成減輕阿霉素心臟毒性[19]。上述表明DEX通過(guò)不同的作用機(jī)制在不同的背景下發(fā)揮心臟保護(hù)作用。但至今有關(guān)DEX發(fā)揮心臟保護(hù)作用與它誘發(fā)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)報(bào)道卻十分少見(jiàn)。本研究從新的視角去探討DEX對(duì)心肌的作用,該研究顯示DEX明顯誘發(fā)大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生肥大。這種證明為DEX預(yù)處理在圍術(shù)期環(huán)境中的有益作用提供了新的重要證據(jù)。

ANP、BNP和C型利鈉肽(CNP)屬于胚胎基因,在胚胎期高表達(dá),而生物體出生后該基因表達(dá)減少,直至表達(dá)停止。而這種心臟胚胎基因在出生成熟心臟中已停止表達(dá),但在某些特定病理?xiàng)l件下,如壓力超負(fù)荷、去甲腎上腺素能神經(jīng)長(zhǎng)期過(guò)度興奮、心肌重構(gòu)等,該類基因可再次激活,表達(dá)逐步上調(diào)。這一過(guò)程中,肌球蛋白重鏈 (MHC) 也會(huì)同步表達(dá)上調(diào)。前期研究顯示,心肌肥厚發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子GATA4參與調(diào)控壓力負(fù)荷、內(nèi)皮素等病理因素誘導(dǎo)的 ANP 、BNP 和MHC等心肌肥厚相關(guān)基因的表達(dá)[20-21]?？梢?jiàn)ANP 、BNP 和MHC可通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控參與胚胎基因再編程,成為心肌肥厚藥物治療研究的新靶點(diǎn)。本研究顯示DEX處理的乳鼠心肌細(xì)胞ANP、BNP和β-MHC的蛋白表達(dá)水平明顯增加,也是DEX誘發(fā)心肌細(xì)胞發(fā)生肥大的又一個(gè)有力證據(jù)。我們用CCK8檢測(cè)了兩組心肌細(xì)胞的活性,結(jié)果表明DEX (5 μmol/L)處理的心肌細(xì)胞活性明顯增加,差異是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明DEX誘發(fā)的心肌細(xì)胞肥大可能是一種暫時(shí)的可逆的代償性的,類似于生理性心肌肥厚的形態(tài)變化。為了證明這個(gè)猜測(cè),將實(shí)驗(yàn)分成三組,我們構(gòu)建了國(guó)際通用的心肌細(xì)胞肥大模型A組。C組作為對(duì)照,無(wú)血清培養(yǎng)基處理心肌細(xì)胞48 h;A組Ang Ⅱ(1 μmol/L)處理心肌細(xì)胞24 h后,換成無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h;D組DEX處理心肌細(xì)胞24 h后,換成無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)心肌細(xì)胞24 h。觀察三組心肌細(xì)胞肥大相關(guān)指標(biāo)ANP、BNP和β-MHC的變化。結(jié)果顯示:D組心肌肥大指標(biāo)ANP、BNP和β-MHC的表達(dá)能隨著時(shí)間的延長(zhǎng)恢復(fù)正常,而病理性肥大組(A組)ANP、BNP和β-MHC的表達(dá)則不能恢復(fù)。這證明了我們的猜測(cè),DEX發(fā)揮心肌保護(hù)作用是通過(guò)誘發(fā)心肌細(xì)胞肥大,而這種肥大是類似于生理性心肌肥大,是一種可逆的代償性的形態(tài)變化,對(duì)心臟是一種有利的保護(hù)作用。

近百年來(lái),我們已經(jīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞水平、亞細(xì)胞水平對(duì)心肌肥厚進(jìn)行了廣維度、多角度的深入探究,研究包括:circRNA、lncRNA、miRNA、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子等多個(gè)領(lǐng)域。但心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍然不夠清楚。本研究局限性在于我們采用乳鼠心肌細(xì)胞做實(shí)驗(yàn),與人心肌細(xì)胞有一定的差異。開(kāi)展在體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究DEX誘發(fā)心肌肥厚是我們下一步的研究?jī)?nèi)容。探明心肌肥厚發(fā)生機(jī)制是心血管領(lǐng)域研究的重要課題,具有重要的理論和臨床實(shí)用意義,這將是我們下一步的研究重點(diǎn)。