寇 慧 黃長浩 嚴 騁 鄒 偉

（四川輕化工大學生物工程學院，四川 宜賓 644005）

油菜是我國的主要油料作物之一，種植面積居世界前列[1]。目前，油菜秸稈的處置方式多為露天焚燒和自然降解，會造成資源浪費和環(huán)境污染，因此探究優(yōu)質高效的秸稈資源綜合利用方法成為熱點話題[2]。但油菜秸稈木質化程度高、生物質結構復雜，造成其利用難、利用率低。高效且低成本的降解技術是實現(xiàn)資源化利用油菜秸稈的亟須解決的難題。目前，油菜秸稈的降解方法主要有物理處理法、化學處理法、生物處理法，其中生物降解技術操作簡單、生產(chǎn)費用較低且效用高，不會污染環(huán)境，在降解纖維素類物質方面具有巨大的潛力[3]。

秸稈的主要成分包括木質素、纖維素和半纖維素，木質素和半纖維素以共價鍵的形式形成一種天然的屏障包裹纖維素，防止纖維素被酶解[4]。木質素結構復雜，對纖維素和半纖維素的酶解產(chǎn)生可發(fā)酵糖及高附加值產(chǎn)品的開發(fā)形成了一定阻礙，因此能否有效去除木質素也會影響纖維素和半纖維素的有效利用[5]。生物降解木質素主要借助于自然界中真菌、放線菌、細菌等，與細菌相比，真菌降解木質素的能力較強，且具有產(chǎn)生多種氧化還原酶的能力[6-7]，在木質素解聚方面起重要作用，其中關于白腐真菌的研究最多。但白腐真菌存在效率低、碳水化合物損失大、覆蓋面積大、發(fā)酵周期長等缺點，因此有需要篩選新菌株、探索新方法降解木質素[8]。本研究從腐爛木頭及土壤中篩選、分離、鑒定具有木質素降解能力的真菌，進一步探究了該菌株以油菜秸稈為底物的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化以及降解效果，為后續(xù)油菜秸稈生物降解提供高效微生物資源，為秸稈的資源化利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源

土壤和腐爛木頭采自四川輕化工大學匯南校區(qū)樹林里含腐爛木頭的土壤地表下2～5 cm 處，使用無菌袋包裝，冰袋保存帶回實驗室，4 °C冰箱保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：葡萄糖5 g、蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、NaCl 10 g、蒸餾水1 000 mL，pH 值自然，121 ℃高壓滅菌20 min。

初篩培養(yǎng)基：木質素2 g、硫酸銨2 g、磷酸二氫鉀1 g、磷酸氫二鈉0.2 g、瓊脂20 g，pH 值7.0，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min，倒平板備用[9]。

復篩培養(yǎng)基：

愈創(chuàng)木酚-PDA：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水定容至1 000 mL，pH 值6.0～6.5，121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻至不燙手，使用0.22 μm 濾膜過濾，除菌，加入0.1%愈創(chuàng)木酚[9]。

苯胺藍-PDA：馬鈴薯200 g、酵母膏20 g、蛋白胨5 g、葡萄糖20 g、NaCl 5 g、蒸餾水定容至1 000 mL，pH 值5.5 左右，瓊脂20 g；滅菌，冷卻至不燙手，用0.22 μm濾膜過濾除菌加入0.1 g苯胺藍，倒平板備用[10]。

木質素降解培養(yǎng)基[10]：堿性木質素2 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 1 g、蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。

初始固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基[10]：預處理過的油菜秸稈3.0 g、麩皮2 g 裝入150 mL 錐形瓶中，以料液比1∶2 加入營養(yǎng)液搖勻。

營養(yǎng)液為KH2PO41.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、(NH4)2SO410 g/L、蛋白胨1.0 g/L。

所有培養(yǎng)基均需1×105Pa滅菌30 min后冷卻。

1.1.3 試劑與儀器

1.1.3.1 試驗試劑

木質素、堿性木質素、鐵氰化鉀、乳酸鈉購自上海麥克林生化科技有限公司；葡萄糖、氯化鐵購自成都市科隆化學品有限公司；2,2-二氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）購自合肥巴斯夫生物科技有限公司；苯胺藍、愈創(chuàng)木酚購自上海泰坦科技股份有限公司；藜蘆醇購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3.2 試驗儀器

HH-4恒溫水浴鍋購自上海力辰邦西儀器科技有限公司，LRH-300 生化培養(yǎng)箱購自常州諾基儀器有限公司，UV-1800紫外/可見分光光度計購自上海美譜達儀器有限公司，SW-CJ-2D 型超凈工作臺購自上海蘇凈實業(yè)有限公司，PHS-3C 酸度計購自成都世紀方舟科技有限公司，LS-50HJ 立式壓力蒸汽滅菌器購自江陰濱江醫(yī)療設備有限公司，F(xiàn)2000全自動纖維分析儀購自濟南海能儀器股份有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 油菜秸稈的預處理

參考王輝等[11]預處理秸稈方法，稱取20.00 g 粉碎至過20 目篩的油菜秸稈粉，置于250 mL 錐形瓶中，加入200 mL 1.1% NaOH（液料比為10 mL/g），密封，置于45 ℃環(huán)境中浸泡36 h，置于濾袋中洗至中性，烘干至恒重，稱量。

1.2.2 木質素降解菌株的分離篩選

取10 g土壤樣品于已滅菌的50 mL富集培養(yǎng)基中，放入搖床28 ℃、180 r/min富集7 d。取出在超凈工作臺內取上清液1 mL梯度稀釋至10-1～10-8，吸取10-5、10-6、10-7、10-8各200 μL涂布于初篩培養(yǎng)基上，每個梯度設置3個重復。28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，選擇生長旺盛的菌株轉接至初篩分離培養(yǎng)基上進行劃線分離純化，直至得到純菌，并對篩選得到菌株進行編號。

挑取初篩培養(yǎng)基上的單菌落，使用牙簽點種至愈創(chuàng)木酚-PDA、苯胺藍-PDA 培養(yǎng)基上的中心，28～30 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，分別挑取周邊有紅色顯色圈、脫色圈明顯的菌株，反復劃線純化，保藏。

1.2.3 木質素降解菌的鑒定

將篩選出的菌株M20 根據(jù)菌落培養(yǎng)特征和菌體結構特征，參考《真菌鑒定手冊》[12]進行初步鑒定，將菌種送至上海生工進行內轉錄間隔區(qū)（ITS）測序，測序結果使用BLAST 程序在NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫進行同源性分析，利用MEGA 5.0 軟件計算序列的相似度，使用Neighbor-joining 法構建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，確定物種的系統(tǒng)發(fā)育地位[13]。

1.2.4 木質素降解菌株降解率測定

采用普魯士法[14]測木質素濃度，將菌株涂布于初篩培養(yǎng)基平板上，均勻鋪滿平板后，使用打孔器做成直徑8 mm 菌塞，每個木質素降解培養(yǎng)基中無菌操作接種5個菌塞，28 ℃、150 r/min降解5 d，取出，搖勻，過濾掉菌的孢子，濾液使用0.22 μm濾膜抽濾，所得濾液測木質素含量。木質素含量標準曲線操作步驟參考文獻[13]，得到回歸方程y=0.028 2x+0.030 1（R2=0.992 2）。

1.2.5 木質素降解菌株酶活測定

木質素胞外漆酶（Lac）、木質素過氧化物酶（Lip）和錳過氧化物酶（MnP）活性的測定具體操作步驟參考文獻[15-17]。

1.2.6 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶單因素優(yōu)化

碳、氮源優(yōu)化：在初始固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的基礎上，分別選取秸稈與麩皮比為4∶1、3∶1、2∶1、3∶2、1∶1，選取蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨作為氮源，初始添加量為3%。選出最優(yōu)氮源后，分別選取1%、2%、3%、4%添加量，在發(fā)酵條件為接種量10%、28 ℃、5 d進行試驗。

采用最優(yōu)碳氮源，即秸稈、麩皮比3∶1，硫酸銨2%，分別選取液料比1、2、3、4 L/g，發(fā)酵溫度24、28、32、36、40 ℃，發(fā)酵時間為2、3、4、5、6、7 d，接種量分別取5%、10%、20%、25%、30%進行單因素優(yōu)化。

1.2.7 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化正交試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果，選擇對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶影響較大的因素設計正交試驗，進一步獲得最佳工藝條件，以秸稈與麩皮比（A）、時間（B）和氮源添加量（C）作為3 個因素，選取3 個水平進行試驗。采用L9（34）正交表進行正交試驗設計，確定固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳工藝。正交試驗因素及水平設計見表1。

表1 正交試驗因素水平設計

1.2.8 驗證試驗

以最優(yōu)發(fā)酵工藝檢驗正交法所獲得的結果的可靠性，通過比較初篩發(fā)酵條件和優(yōu)化后的酶活，評價優(yōu)化前后發(fā)酵條件對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1.2.9 油菜秸稈降解率的測定方法

參照GB/T 20805—2006、GB/T 6434—2006，采用濾袋法分別測定飼料中的酸性洗滌木質素含量和粗纖維含量。將發(fā)酵油菜秸稈粉碎過40目篩，稱取約0.5 g左右發(fā)酵油菜秸稈于濾袋封口，將濾袋放入燒杯中用石油醚浸沒10 min 脫脂，在通風櫥晾干。放入F2000 全自動纖維分析儀中，設置不同程序進行消煮和洗滌，取出濾袋，瀝干水分，放入丙酮中浸沒5 min，通風櫥晾干，放入烘箱（100±2）℃烘干至恒重，馬弗爐灰化至恒重，計算酸性洗滌木質素含量、粗纖維含量。

2 結果與分析

2.1 木質素降解菌的篩選

從初篩培養(yǎng)基上共挑出56株菌，共有20株菌出現(xiàn)褪色圈或/和顯色圈。其中14株菌株同時在愈創(chuàng)木酚-PDA培養(yǎng)基、苯胺藍-PDA 培養(yǎng)基上顯色/褪色圈出現(xiàn)時間較快且直徑圈較大，表明其產(chǎn)漆酶和過氧化物酶能力較強。但僅通過褪色圈/顯色圈只能簡單判斷產(chǎn)酶的特性，無法具體了解酶的活性，因此還需后續(xù)試驗加以驗證。將14株菌株分別接入木質素降解培養(yǎng)基中通過發(fā)酵后測木質素降解率進行下一步復篩，結果顯示，降解率大于30%的有10株菌，再分別接入以油菜秸稈為唯一碳源的初始固態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，以篩選出高效降解油菜秸稈的菌株。10株木質素降解菌的木質素酶活見表2。

表2 10株木質素降解菌的木質素酶活 單位：U/g

由表2可知，菌株M8的漆酶最高，但其余兩種酶活很低；M20、M4-2 的3 種酶活均較高，M20 的均略高于M4-2，且M20的苯胺藍褪色效果以及木質素降解效果比M4-2好，因此最終確定M20為目的菌株進行后續(xù)研究。

2.2 木質素降解菌的鑒定

2.2.1 菌株M20的形態(tài)特征及顯微觀察結果（見圖1）

圖1 菌株M20的形態(tài)特征及顯微觀察結果

由圖1可知，菌株M20在苯胺藍-PDA、愈創(chuàng)木酚-PDA平板上均呈黃綠色，絲絨質地，菌絲為致密短絨狀，向四周擴展，邊緣不規(guī)整，在平板上呈中央凸起生長。顯微鏡觀察菌體形態(tài)，菌株具有分生孢子梗，孢梗莖壁薄且長，壁平滑，頂端有球形頂囊，由頂囊的小梗產(chǎn)生孢子，分生孢子頭輻射狀。結合鄧維琴等[18]對米曲霉的鑒定研究結果，初步判斷篩選出的M20菌株為米曲霉。

2.2.2 菌株M20的ITS序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹

雙向測序獲得菌株M20 的ITS基因序列，經(jīng)拼接后在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行序列同源性比對，選取BLAST 中相似度較高的真菌序列，利用MEGA5.0計算真菌序列相似度，采用其中的Neighbor Joining 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖2。由圖2 可知，M20 與AspergillusoryzaeBS A2 在同一個分支上，序列相似性為100%。因此，將該菌株初步命名為A.oryzaeM20。

圖2 菌株M20系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化單因素試驗結果（見圖3～圖9）

圖3 秸稈與麩皮比對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖4 不同氮源對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖5 氮源添加量對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖6 接種量對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖7 發(fā)酵時間對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖8 溫度對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖9 液料比對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

由圖3 可知，當秸稈與麩皮比例為3∶1 時，木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶均達到峰值，漆酶的酶活略低于秸稈與麩皮比為2∶1和1∶1；考慮秸稈的利用率最大化，選擇秸稈與麩皮比例4∶1～2∶1進行后續(xù)試驗。

由圖4、圖5 可知，以硫酸銨為氮源時，3 種酶活性均最高。隨著硫酸銨含量的增加，3種酶的活性均上升再下降，其中漆酶和木質素過氧化物酶的在硫酸銨含量為2%時達到峰值，錳過氧化物酶在硫酸銨含量為3%時達到峰值；當硫酸銨含量為4%時，3種酶活性均下降。因此，選擇2%～4%硫酸銨含量進行后續(xù)試驗。

由圖6 可知，當接種量在5%～20% 范圍內時，3 種酶活波動幅度不大。因此，接種量對產(chǎn)酶結果影響不大，分析原因是接種量過多，微生物生長旺盛，使環(huán)境競爭加劇，微生物群提前衰亡期，且在進入主要代謝階段之前底物已經(jīng)大量被消耗，使最終產(chǎn)物減少。

由圖7可知，隨著發(fā)酵時間延長，3種酶活均逐漸升高，到6 d時，3種酶活性均下降。

因此，本試驗選擇發(fā)酵時間為3～5 d 進行后續(xù)試驗。

由圖8 可知，24～32 ℃范圍內，3 種酶活性隨著溫度的升高而逐漸增大，在米曲霉最適生長溫度32～36 ℃范圍內[19]，3 種酶活性均逐漸下降。因此，選取32 ℃作為后續(xù)試驗。

由圖9 可知，液料比為1～2 時，漆酶與木質素過氧化物酶活性均隨著液料比增加而增加，而錳過氧化物酶活性呈下降趨勢；液料比大于2 時，隨時液料比增加，3 種酶活性均下降，可能是固態(tài)發(fā)酵適宜霉菌生長，水分含量過大會導致培養(yǎng)基透氣性不足，影響菌株生長，產(chǎn)酶降低[20]。

2.4 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶正交試驗優(yōu)化結果

為考察各因素之間的關系及影響，進一步優(yōu)化各因素的最佳量，應用SPSS 24軟件，設計秸稈與麩皮比、發(fā)酵時間、氮源添加量3因素3水平的正交試驗，正交試驗結果見表3，方差分析見表4～表6。

表3 正交試驗結果及極差分析

表4 錳過氧化物酶方差分析

表5 漆酶方差分析

表6 木質素過氧化物酶方差分析

由表3～表6可知，氮源添加量對3種酶活力影響均顯著（P＜0.05），發(fā)酵時間僅對過氧化物酶活力影響顯著（P＜0.05），對其余兩種酶活力影響不顯著（P＞0.05），而秸稈與麩皮比例對錳過氧化物酶和漆酶活力影響顯著（P＜0.05），對木質素過氧化物酶活性影響不顯著（P＞0.05），因此最佳方案為A3B2C2，即產(chǎn)木質素過氧化物酶最佳的發(fā)酵條件為秸稈與麩皮比為2∶1、時間4 d、(NH4)2SO4添加量為3%；產(chǎn)錳過氧化物酶最佳的發(fā)酵條件為秸稈與麩皮比為2∶1、時間4 d、(NH4)2SO4添加量為3%；產(chǎn)漆酶最佳的發(fā)酵條件為秸稈與麩皮比為2∶1、時間5 d、(NH4)2SO4添加量為3%。根據(jù)極差分析結果，產(chǎn)漆酶的最佳方案為A3B3C2，即產(chǎn)漆酶的最佳發(fā)酵條件中僅發(fā)酵時間與另兩種酶發(fā)酵時間不同，但發(fā)酵時間僅對過氧化物酶活力影響顯著，因此以過氧化物酶的最佳發(fā)酵時間為準，最終最佳方案為A3B2C2。

2.5 最優(yōu)發(fā)酵條件的驗證

以正交試驗得到的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)條件組合為秸稈與麩皮比為2∶1、(NH4)2SO4添加量為3%、發(fā)酵4 d進行試驗驗證。優(yōu)化后木質素過氧化酶從1 121.03 U/g 上升到1 796.74 U/g，提高了60.28%；錳過氧化酶從101.13 U/g上升至146.78 U/g，提高了45.14%；漆酶從3.135 U/g 上升至3.979 U/g，提高了27.00%。

2.6 油菜秸稈中木質素、纖維素的降解率

在最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基條件下，未接菌的秸稈固體培養(yǎng)基粗纖維含量47.76%、木質素含量為13.34%；接入菌株M20 經(jīng)過發(fā)酵后的秸稈固體培養(yǎng)基粗纖維33.09%、木質素含量為6.71%。菌株M20 對油菜秸稈中木質素降解率達49.70%，粗纖維降解率達30.72%，均高于?ilerd?i?等[21]利用Ganodermaapplanatum對秸稈的木質素、纖維素的降解率。

將未發(fā)酵的油菜秸稈固體培養(yǎng)基發(fā)酵基質與發(fā)酵過后的秸稈培養(yǎng)基基質分別烘干、粉碎、過篩，用導電雙面膠帶固定在樣品臺上，在真空環(huán)境下進行鍍金處理，物料表面形成一層導電膜后，用掃描電子顯微鏡進行觀察秸稈表面形態(tài)變化[22]，結果見圖10。

由圖10可知，未發(fā)酵的秸稈表面光滑，結構緊密且完整，試驗組秸稈經(jīng)菌株發(fā)酵處理后可見，菌體孢子覆蓋、夾雜在秸稈細胞中，秸稈致密完整的結構被破壞。

3 討論

李佳少[23]將米曲霉CGMCC5992 進行固態(tài)發(fā)酵后，發(fā)現(xiàn)錳過氧化物酶達到2.08 U/g，木質素過氧化物酶達到1.79 U/g，而通過單因素和響應面試驗優(yōu)化了米曲霉CGMCC5992固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的工藝條件，得到木質素過氧化物酶最大酶活值可達到6.62 U/g，秸稈木質素降解率達40.25%。本研究篩選的米曲霉M20 產(chǎn)的錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶活均遠高于上述研究結果，同時還能夠產(chǎn)漆酶。張芳芳等[4]利用白腐真菌接種到玉米秸稈固體培養(yǎng)基中，發(fā)酵過程中漆酶活性最高值為21.36 U/g，錳過氧化物酶活性峰值0.32 U/g，木質素過氧化物酶峰值為15 U/g。與張芳芳等[4]的研究結果相比，本研究中的菌株M20 的漆酶活性較低，但木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶分別是其119倍和456倍。由M20的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶結果發(fā)現(xiàn)，米曲霉M20 在油菜秸稈為底物的固態(tài)發(fā)酵中，木質素過氧化物酶在木質素降解中起主要作用，與Pinto等[24]報道的木質素過氧化物酶在固態(tài)發(fā)酵占優(yōu)勢的結果一致，與Fackler 等[25]用白腐菌降解木質素時，錳過氧化物酶起主要作用結果不同，可能是不同菌種代謝差異導致[26]。

此外，與已報道其他種屬的木質素降解菌相比，M20 在短時間、低能耗的發(fā)酵條件下對水溶堿性木質素和油菜秸稈（天然木質素）均具有較強的降解能力。李靈靈等[10]以白腐菌BYL-7 發(fā)酵5 d 對堿性木質素降解率為36.5%，培養(yǎng)8 d 對秸稈木質素降解率為32.8%，而M20 在液體培養(yǎng)基中發(fā)酵5 d 對堿性木質素降解率約為40%，固態(tài)發(fā)酵5 d后對秸稈木質素降解率達49.70%，分別提高了4.5%和16.9%。Zhu等[27]以變色栓菌為木質素降解試驗菌株，發(fā)現(xiàn)秸稈木質素降解率為34.8%，本試驗中M20的木質素降解率提高了14.9%，且明顯縮短了發(fā)酵周期。范寰等[28]利用復合木質素菌系發(fā)酵30 d 時，秸稈的木質素降解率達到（57.0±0.2）%，雖M20 秸稈木質素降解率比其低（7.3±0.2）%，但發(fā)酵周期縮短了7.5倍。

4 結論

本研究分離篩選的菌株米曲霉M20 具有較強的產(chǎn)木質素酶活和木質素降解能力，對其利用油菜秸稈固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵優(yōu)化，在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上改變秸稈與麩皮比為2∶1、(NH4)2SO4添加量為3%、發(fā)酵4 d可明顯提高其產(chǎn)木質素酶活能力，且油菜秸稈中木質素降解率達49.70%，粗纖維降解率達30.72%。該菌株在油菜秸稈生物降解方面具有較大的開發(fā)利用前景，一定程度上為秸稈資源化利用提供了新的微生物資源。后續(xù)還可利用此菌株與其他菌株結合處理油菜秸稈，多菌協(xié)同產(chǎn)酶，使酶系統(tǒng)更加完整，提高油菜秸稈的降解率。