真 誠 譚 薇 趙梅仙 賈紅敏

（中牧實業(yè)股份有限公司，北京 100095）

酸化劑是目前市場上一種重要的替抗化合物，主要有固體和液體兩大類[1-2]。液體酸化劑主要應(yīng)用于家禽、仔豬和反芻動物中。在規(guī)?；B(yǎng)殖場的封閉飲水線中存在大量的有害微生物，會影響畜禽健康生長[3]。在養(yǎng)殖過程中添加液體酸化劑[4]，可有效抑菌殺菌，提高機體抗應(yīng)激、抗病能力，減少疾病發(fā)生[5-8]；改善水質(zhì)，降低pH值，清理管道壁生物膜，降低飲水微生物傳播風(fēng)險[9-12]；可促進有益菌生長，提高消化酶活性，改善腸道健康，達到促生長和提高飼料利用率的作用[13-15]。液體酸化劑產(chǎn)品在動物生產(chǎn)中的使用量和實際應(yīng)用效果主要取決于產(chǎn)品中有機酸的種類和含量，所以產(chǎn)品在研發(fā)與生產(chǎn)過程中有必要通過精準(zhǔn)檢測進行產(chǎn)品含量分析及質(zhì)控。

目前，有機酸檢測的方法有高效液相色譜法[16-17]、氣質(zhì)聯(lián)用法[18]、氣相色譜法[19-20]、離子色譜法[21]等。氣質(zhì)聯(lián)用法和氣相色譜法雖具有較強的專屬性，但適用范圍小，僅能夠檢測低沸點有機酸含量，且檢測成本較高。離子色譜法多使用稀強酸，對設(shè)備具有一定不可逆的腐蝕作用，而且檢測時間較長，綜合檢測效率較低。高效液相色譜法是目前檢測有機酸含量的常用方法，此法特異性強、精確度高，可用于大多數(shù)有機酸的同時分離檢測?，F(xiàn)階段市場上的液體酸化劑產(chǎn)品主要以甲酸、乙酸、丙酸、丁酸中的1 種或幾種為主要成分，還未見有對這4種有機酸同時檢測的報道。本研究根據(jù)液體酸化劑產(chǎn)品的特點，在大量試驗基礎(chǔ)上進行色譜條件優(yōu)化，為液體酸化劑的研發(fā)及生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備與試劑

主要儀器：1260 型高效液相色譜分析儀（美國Agilent 公司）、Atlantis T3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國Waters 公司）、UV-2100 型紫外可見分光光度儀（日本Shimadzu 公司）、MC204 型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、FE20型pH計（梅特勒-托利多儀器有限公司）、KD-600DV型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

主要試劑：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸（分析標(biāo)準(zhǔn)品，濃度＞99%，麥克林公司）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）；磷酸二氫鉀（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；磷酸（分析純，北京化工廠）；試驗用水為超純水。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液制備

分別準(zhǔn)確稱取0.400 0 g（精確至0.000 1 g）甲酸、

0.400 0 g乙酸、0.200 0 g丙酸、0.200 0 g丁酸標(biāo)準(zhǔn)品，使用流動相B 溶解超聲20 min，冷卻，于100 mL 容量瓶中定容，制備質(zhì)量濃度分別為40、40、20、20 g/L 的有機酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4 ℃保存，上機前用0.45 μm濾膜過濾。

1.2.2 樣品處理

準(zhǔn)確稱取1 g 液體酸化劑產(chǎn)品于100 mL 容量瓶中，用流動相B稀釋，超聲20 min，冷卻，定容，0.45 μm濾膜過濾，于樣品瓶中待測。

1.2.3 色譜條件

使用Atlantis T3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫為30 ℃，乙腈為流動相A，20 mmol/L KH2PO4緩沖鹽溶液（pH值2.9）為流動相B，流速為1 mL/min，檢測波長220 nm，進樣量20 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的選擇

分別測定甲酸、乙酸、丙酸、丁酸4 種有機酸的紫外吸收譜圖，結(jié)果表明，4 種有機酸在220 nm 條件下均具有較大吸收，因此最終確定檢測波長為220 nm。

2.1.2 緩沖鹽濃度和pH值的選擇

緩沖鹽選擇常用的磷酸鹽，pH 值調(diào)整為小于4 種有機酸的酸度系數(shù)值，保證4 種有機酸以分子狀態(tài)存在。但pH值不能過低，過低會導(dǎo)致峰形拖尾嚴(yán)重，保留效果不好，所以最終選擇pH值為2.9。緩沖鹽水平篩選了10、20、30 mmol/L。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液可以滿足4種有機酸均有合適的分離度。

2.1.3 色譜柱及洗脫濃度的選擇

采用美國Agilent 公司1260 型高效液相色譜分析儀，比較了普通C18柱和Atlantis T3柱對4種有機酸的分離效果。由于4種有機酸中甲酸極性很大，在普通的C18色譜柱中無保留，因此選擇Waters 公司更耐水的Atlantis T3色譜柱，使用100%流動相B 進行等度洗脫，等度洗脫（流動相A∶流動相B=0∶100）時，4種有機酸的色譜圖見圖1。

圖1 等度洗脫為流動相A∶流動相B=0∶100時4種有機酸的色譜圖

由圖1 可知，甲酸有合適的保留因子，但是乙酸、丙酸、丁酸出峰時間過長，而且峰形存在拖尾現(xiàn)象。因此，考慮改用90%流動相B進行等度洗脫。

等度洗脫（流動相A∶流動相B=10∶90）時，4 種有機酸的色譜圖見圖2。由圖2 可知，雖然乙酸、丙酸、丁酸分離效果較好，但甲酸與空白溶劑雜峰出峰重疊?？瞻兹軇┑纳V圖見圖3。

圖2 等度洗脫為流動相A∶流動相B=10∶90時4種有機酸的色譜圖

圖3 空白溶劑的色譜圖

因此綜合考慮，設(shè)置梯度洗脫，先使用100%的流動相B 進行洗脫，在甲酸出峰后調(diào)節(jié)流動相B 的比例，通過篩選，在15 min時將流動相B調(diào)整到20%，洗脫乙酸、丙酸和丁酸，最終同時檢測4種有機酸的效果良好。

2.1.4 流速與柱溫的選擇

本試驗分別比較了0.7、1.0、1.5 mL/min 3 種流速及20、30、40 ℃ 3 種柱溫條件下的檢測效果。結(jié)果表明，流速在0.7 mL/min時，出峰時間過長，降低了檢測效率；流速為1.5 mL/min 時，甲酸出峰時間過早，與空白溶劑雜峰部分交匯不能有效分離；流速為1.0 mL/min 時，分析時間短，峰形分離效果好。柱溫為40 ℃時，4 種有機酸的色譜圖見圖4。

圖4 柱溫為40 ℃時，4種有機酸的色譜圖

由圖4 可知，溫度過高空白溶劑中的雜質(zhì)峰出峰時間后移，使丙酸與空白溶劑雜峰出峰重疊。而選用柱溫為30 ℃時，4 種有機酸都可有效分離，且峰形對稱性良好。

2.1.5 提取條件的選擇

有機酸均是弱酸，在水系流動相中易發(fā)生解離，不被非極性鍵合相保留，所以常用磷酸氫鹽溶液溶解樣品，可抑制溶液解離。試驗比較了使用甲醇∶水=1∶1為提取條件和流動相B 為提取條件時的檢測效果，結(jié)果表明，使用流動相B溶解樣品可有效保留和分離4種有機酸。

2.2 有機酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限、定量限

按選定的色譜條件對4種有機酸標(biāo)準(zhǔn)品單獨進樣，確定各有機酸的分離時間?？紤]一般液體酸化劑產(chǎn)品中有機酸的含量，將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成濃度為0.5～8.0 g/L的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，進行上機檢測，繪制甲酸、乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖，見圖5。

圖5 甲酸、乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

將儲備液進行大倍數(shù)稀釋后上機測定，以3 倍信噪比計算檢出限，以10倍信噪比計算定量限，測定儀器所能檢出和定量的最低濃度。4種有機酸的保留時間、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表2。由表2可知，4 種有機酸在0.5～8.0 g/L 線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為0.999 7～1.000 0，均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。4 種有機酸檢出限在0.26～0.53 mg/L，定量限為0.70～2.65 mg/L，表明方法靈敏度較高。

表2 4種有機酸的保留時間、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.3 方法重復(fù)性

對同一液體酸化劑產(chǎn)品使用1.2.2方法處理，上機進行6 次檢測，計算各有機酸含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值（RSD），液體酸化劑樣品RSD值見表3。由表3可知，甲酸、乙酸、丙酸、丁酸的RSD 值分別為0.76%、1.41%、1.93%、0.84%，表明該方法精密度良好。

表3 液體酸化劑樣品精密度檢測結(jié)果 單位：%

2.4 加標(biāo)回收率

準(zhǔn)確稱取6 個液體酸化劑產(chǎn)品，向其中加入不同濃度的有機酸混合標(biāo)準(zhǔn)液測定加標(biāo)回收率，每種有機酸設(shè)置3個添加濃度，每個添加濃度進行2次平行測定，使用1.2.2 方法處理樣品，并上機測定。液體酸化劑加標(biāo)回收率的檢測結(jié)果見表4。由表4 可知，4 種有機酸均可達到較穩(wěn)定的回收率，回收率范圍為94.1%～101.2%，表明方法有良好的準(zhǔn)確度。

表4 液體酸化劑加標(biāo)回收率的檢測結(jié)果

2.5 樣品測定

從市面上隨機采購3種已知含量的液體酸化劑產(chǎn)品，按1.2.2 方法處理樣品，對樣品進行定性和定量檢測。3種液體酸化劑產(chǎn)品的定量檢測結(jié)果見表5。樣品檢測色譜圖見圖6。由表5 和圖6 可知，本方法可以滿足一般液體酸化劑中的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸的測定需求。

圖6 樣品檢測色譜圖

表5 3種液體酸化劑產(chǎn)品的定量檢測結(jié)果 單位：%

3 結(jié)論

本研究建立的高效液相色譜法可同時檢測液體酸化劑中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸的含量。該方法分離效果和線性關(guān)系良好，精密度和準(zhǔn)確度較高，樣品前處理簡單，檢測時間短，可大幅提高檢測效率。使用優(yōu)化后的色譜方法對市場上已知含量的液體酸化劑樣品進行檢測，可準(zhǔn)確檢測不同種類液體酸化劑中有機酸的含量，能夠滿足液體酸化劑在研發(fā)和生產(chǎn)中的質(zhì)控要求。