沈 丹

（河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)與健康管理系，河北 石家莊 050000）

茶樹純露（tea tree hydrosol，TTH） 是桃金娘科（Myrtaceae）白千層屬（MelaleucaL.）植物互葉白千層（Melaleucaalternifolia）的枝、葉在水蒸氣蒸餾過程中分離出來的水相。TTH 是一種清澈無色的水溶液，具有肉豆蔻香氣[1]。TTH植物的葉、枝經(jīng)水蒸氣蒸餾法提取出的精油名為茶樹精油（tea tree oil，TTO）[2-4]，廣泛應(yīng)用于細(xì)菌和真菌感染引起的皮膚黏膜受損、口腔潰瘍、牙齦炎等疾病[5-7]。

TTH 是茶樹油生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，具有茶樹枝葉的水溶性物質(zhì)，如鞣質(zhì)、皂苷以及糖類，具有抑菌、抗病毒、免疫等藥理活性[8-10]，具有廣泛的應(yīng)用前景。于曉雪等[11]發(fā)現(xiàn)，蛋雞飼料中添加一定濃度的TTH 能夠改善雞蛋的蛋黃顏色、蛋白高度和哈夫單位等指標(biāo)。李桂賢[12]研究表明，在斷奶仔豬飼料中添加TTO 可以提高仔豬的生長性能。本文對(duì)TTH 進(jìn)行化學(xué)成分富集，利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）對(duì)粗提物進(jìn)行化學(xué)成分分析，并進(jìn)行體外抑菌活性研究，以期為TTH 的開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

TTH 購自北京科學(xué)城日化有限公司，牛肉膏、蛋白胨培養(yǎng)基購自天津市英博生化試劑有限公司，正己烷、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，D101 大孔吸附樹脂、AB-8 大孔吸附樹脂購自天津南開和成科技有限公司。

革蘭氏陽性菌株：金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、化膿鏈球菌、表皮葡萄球菌、微球菌、腐生葡萄球菌；革蘭氏陰性菌株：大腸埃希菌、副傷寒乙沙門菌、肺炎克雷伯菌；真菌：白色念珠菌。菌株均購自天津醫(yī)科大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)儀器

Agilent 6890/5973 氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent 7697A頂空自動(dòng)進(jìn)樣器、SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺(tái)購自蘇州凈化設(shè)備有限公司，BL-50A壓力滅菌鍋購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司，AR2130 電子天平購自梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 化學(xué)成分富集

由于TTH 中的化學(xué)成分極性相對(duì)較小，所以本研究采用D101大孔吸附樹脂和AB-8大孔吸附樹脂對(duì)TTH中的化學(xué)成分進(jìn)行富集。

對(duì)D101 大孔吸附樹脂和AB-8 大孔吸附樹脂進(jìn)行樹脂預(yù)處理。將5 kg 的D101 大孔吸附樹脂和2 kg 的AB-8大孔吸附樹脂分別在95%乙醇中浸泡12 h；將兩種樹脂分別裝入合適的玻璃柱中；采用95%乙醇洗脫樹脂，洗至流出液與水（1∶1）混合后無混濁現(xiàn)象；采用5%稀鹽酸以4 BV/h的流速分別洗脫兩種樹脂2 h，蒸餾水洗至流出液的pH值為 7；5%氫氧化鈉以4 BV/h的流速分別洗脫兩種樹脂2 h，蒸餾水洗至流出液的pH值為7。

將410 L 的TTH 以500 mL/h 的流速經(jīng)過裝有5 kg 的D101大孔吸附樹脂柱（150 cm × 18 cm）富集TTH中的化學(xué)成分，所得流出液以400 mL/h 的流速經(jīng)過裝有2 kg的AB-8大孔吸附樹脂柱（120 cm × 12 cm），對(duì)D101大孔吸附樹脂柱未富集的化學(xué)成分進(jìn)行二次富集。再用50%乙醇和95%乙醇兩種洗脫劑洗脫兩根樹脂柱，得到M1-95%（35 g）、M1-50%（54 g）、M2-95%（2.5 g）和M2-50%（20 g）共4個(gè)部分，M1為經(jīng)過D101大孔吸附樹脂富集出的粗提物，M2 為經(jīng)過D101 大孔吸附樹脂富集后又經(jīng)過AB-8 大孔吸附樹脂再次富集得到的粗提物。

1.3.2 化學(xué)成分分析

采用GC-MS 對(duì)TTH 的2 個(gè)粗提物M1-95%和M2-95%進(jìn)行化學(xué)成分分析。流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，分流進(jìn)樣，分流比為20∶1，進(jìn)樣口溫度為250 ℃。升溫程序：初始溫度50 ℃，保持3 min，以5 ℃/min速率升至120 ℃，保持2 min，以10 ℃/min速率升至250 ℃，保持2 min。離子源溫度：230 ℃。電離電壓：70 eV。四級(jí)桿溫度：150 ℃，保持5 min[13-14]。掃描模式為全掃描，掃描范圍：50～650 m/z。采用GC-MS 分析和質(zhì)譜庫檢索（NIST 和AMDIS）及文獻(xiàn)對(duì)比，確定各個(gè)化學(xué)成分，運(yùn)用峰面積歸一化法，求得各成分的相對(duì)含量。

1.3.3 抑菌活性測(cè)定

將革蘭氏陽性菌株（金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、化膿鏈球菌、表皮葡萄球菌、微球菌、腐生葡萄球菌）、革蘭氏陰性菌株（大腸埃希菌、副傷寒乙沙門菌、肺炎克雷伯菌）及真菌（白色念珠菌）配制成一定濃度的菌懸液（濃度為107CFU/mL），采用涂布器將其均勻涂布在供試無菌牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，制成含菌平板[15-17]。將固體樣品M1-50%和M2-50%分別用10%吐溫80-水溶液二倍稀釋配成質(zhì)量濃度為600、300、150 g/L 的樣品溶液；液體樣品M1-95%和M2-95%分別用10%吐溫80-水溶液二倍稀釋配成體積分?jǐn)?shù)為100%、50%、25%的樣品溶液。直徑為6.0 mm、吸水量為20 μL的專用藥敏紙片經(jīng)高溫蒸汽消毒后，使用浸泡的方法將紙片浸泡在樣品溶液中，充分吸收2 h，取出冷凍干燥，貼于具有供試菌懸液的瓊脂培養(yǎng)基上，細(xì)菌在37 ℃培養(yǎng)箱中無光培養(yǎng)24 h，真菌在37 ℃培養(yǎng)箱中無光培養(yǎng)48 h。每個(gè)樣品重復(fù)3 次，選用游標(biāo)卡尺作為測(cè)量每個(gè)抑菌圈兩個(gè)垂直方向直徑的工具，以肉眼看不到細(xì)菌明顯生長作為判斷抑菌圈邊緣的依據(jù)，評(píng)價(jià)4 個(gè)粗提物的抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 TTH化學(xué)成分分析

通過GC-MS 對(duì)M1-95%粗提物進(jìn)行化學(xué)成分分析，并通過標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)比及檢索圖譜分析，鑒定出22種化學(xué)成分，并計(jì)算各成分的相對(duì)含量，鑒定出匹配度90%以上的化合物含量占93.80%，其中化合物多為烯、醇類。TTH粗提物M1-95%化學(xué)成分與含量見表1。

表1 TTH粗提物M1-95%化學(xué)成分與含量

由表1可知，M1-95%粗提物中較大峰的化學(xué)成分和保留時(shí)間分別為：α-蒎烯（6.555 min）、3-蒈烯（9.526 min）、1,8-桉葉素（10.285 min）、γ-松油烯（13.987 min）、α-松油烯（14.483 min）、松油-1-醇（22.145 min）、α-杜松醇（22.412 min）、α-古蕓烯（23.186 min）、γ-杜松烯（23.862 min）、hedycaryol（36.480 min），10種化合物總含量占93.48%。

通過GC-MS 對(duì)M2-95%粗提物進(jìn)行化學(xué)成分分析，并通過標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)比及檢索圖譜分析，鑒定出10種化學(xué)成分，并計(jì)算出各成分的相對(duì)含量，鑒定出匹配度90%以上的化合物含量占96.63%，其中化合物多為烯、醇類。TTH粗提物M2-95%化學(xué)成分與含量見表2。

表2 TTH粗提物M2-95%化學(xué)成分與含量

由表2可知，M2-95%粗提物中較大峰的化學(xué)成分和保留時(shí)間分別為：α-蒎烯（6.726 min）、1,8-桉葉素（11.394 min）、γ-松油烯（14.529 min）、α-松油烯（15.030 min）、松油-1-醇（22.292 min）、α-杜松醇（23.037 min），6種化合物總含量占89.24%。

2.2 抑菌活性分析

M1-50%和M2-50%抑菌圈直徑見表3。由表3 可知，M1-50%對(duì)藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和肺炎克雷伯菌具有中等強(qiáng)度抑制活性。M2-50%對(duì)以上菌株抑制活性較弱。

表3 M1-50%和M2-50%抑菌圈直徑 單位：mm

M1-95%和M2-95%抑菌圈直徑見表4。由表4 可知，M1-95%對(duì)藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌具有較強(qiáng)抑制活性。其中，M1-95%對(duì)藤黃微球菌的抑菌圈直徑分別為34.6、29.6、22.7 mm；M1-95%對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別為26.8、22.6、20.6 mm；M1-95%對(duì)白色念珠菌的抑菌圈直徑分別為33.2、32.6、33.3 mm。M1-95%對(duì)大腸埃希菌、副傷寒乙沙門菌、肺炎克雷伯菌、革蘭氏陽性菌株金黃葡萄球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌和化膿鏈球菌具有中等強(qiáng)度抑制活性。M2-95%對(duì)上述菌株沒有抑制活性。

表4 M1-95%和M2-95%抑菌圈直徑 單位：mm

3 討論

3.1 TTH中的化學(xué)成分分析

本研究采用大孔吸附樹脂對(duì)TTH 中的化學(xué)成分進(jìn)行富集，選用D101和AB-8兩種大孔吸附樹脂，經(jīng)過D101大孔吸附樹脂富集的M1-95%粗提物，主要化學(xué)成分為松油-1-醇、γ-松油烯、1,8-桉葉素和α-松油烯，經(jīng)過D101 大孔吸附樹脂富集后又再次經(jīng)過AB-8 大孔吸附樹脂富集的M2-95%粗提物，主要化學(xué)成分為松油-1-醇、γ-松油烯、1,8-桉葉素和α-松油烯。M1-95%粗提物和M2-95%粗提物主要化學(xué)成分相同，M1-95%粗提物重量為35 g，M2-95%粗提物重量為2.5 g，重量相差較大。由此可見，D101大孔吸附樹脂對(duì)TTH中的化學(xué)成分具有較強(qiáng)的富集能力，而AB-8大孔吸附樹脂并未富集出其他化學(xué)成分，表明生產(chǎn)車間無須將流出液再次經(jīng)過AB-8大孔吸附樹脂富集。

3.2 TTH中的化學(xué)成分抑菌活性分析

Koh等[8]、Garozzo等[9]、Grando等[10]研究發(fā)現(xiàn)，TTH具有抑菌、抗病毒和免疫等藥理活性。本研究針對(duì)TTH的粗提物進(jìn)行抑菌活性研究表明，結(jié)果顯示，M1-95%對(duì)革蘭氏陽性菌株藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌和真菌白色念珠菌具有較強(qiáng)抑制活性，而M2-95%對(duì)研究菌株沒有抑制活性。原因可能是M2-95%粗提物中沒有M1-95%粗提物中含有的抑菌活性成分。

M1-50%對(duì)革蘭氏陽性菌株藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、真菌白色念珠菌和革蘭氏陰性菌株肺炎克雷伯菌具有中等強(qiáng)度抑制活性，M2-50%對(duì)研究菌株抑制活性較弱，原因可能是M2-50%粗提物中無M1-50%粗提物中含有的抑菌活性成分。結(jié)果再次證實(shí)TTH經(jīng)過D101大孔吸附樹脂富集后，無須將流出液再次經(jīng)過AB-8大孔吸附樹脂富集。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，D101大孔吸附樹脂對(duì)TTH中的化學(xué)成分具有較強(qiáng)的吸附能力，而AB-8大孔吸附樹脂并沒有富集出其他化學(xué)成分，表明生產(chǎn)車間無須將流出液再次經(jīng)過AB-8大孔吸附樹脂富集。M1-95%對(duì)革蘭氏陽性菌株藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌和真菌白色念珠菌具有較強(qiáng)抑制活性；M1-50%對(duì)革蘭氏陽性菌株藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、真菌白色念珠菌和革蘭氏陰性菌株肺炎克雷伯菌具有中等強(qiáng)度抑制活性。本研究不僅為TTH 的化學(xué)成分富集提供工藝方法，也為其化學(xué)成分及抑菌活性研究提供了參考。