沈 丹

（河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)與健康管理系，河北 石家莊 050000）

茶樹純露（tea tree hydrosol，TTH） 是桃金娘科（Myrtaceae）白千層屬（MelaleucaL.）植物互葉白千層（Melaleucaalternifolia）的枝、葉在水蒸氣蒸餾過程中分離出來的水相。TTH 是一種清澈無色的水溶液，具有肉豆蔻香氣[1]。TTH植物的葉、枝經(jīng)水蒸氣蒸餾法提取出的精油名為茶樹精油（tea tree oil，TTO）[2-4]，廣泛應(yīng)用于細菌和真菌感染引起的皮膚黏膜受損、口腔潰瘍、牙齦炎等疾病[5-7]。

TTH 是茶樹油生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，具有茶樹枝葉的水溶性物質(zhì)，如鞣質(zhì)、皂苷以及糖類，具有抑菌、抗病毒、免疫等藥理活性[8-10]，具有廣泛的應(yīng)用前景。于曉雪等[11]發(fā)現(xiàn)，蛋雞飼料中添加一定濃度的TTH 能夠改善雞蛋的蛋黃顏色、蛋白高度和哈夫單位等指標(biāo)。李桂賢[12]研究表明，在斷奶仔豬飼料中添加TTO 可以提高仔豬的生長性能。本文對TTH 進行化學(xué)成分富集，利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）對粗提物進行化學(xué)成分分析，并進行體外抑菌活性研究，以期為TTH 的開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

TTH 購自北京科學(xué)城日化有限公司，牛肉膏、蛋白胨培養(yǎng)基購自天津市英博生化試劑有限公司，正己烷、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，D101 大孔吸附樹脂、AB-8 大孔吸附樹脂購自天津南開和成科技有限公司。

革蘭氏陽性菌株：金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、化膿鏈球菌、表皮葡萄球菌、微球菌、腐生葡萄球菌；革蘭氏陰性菌株：大腸埃希菌、副傷寒乙沙門菌、肺炎克雷伯菌；真菌：白色念珠菌。菌株均購自天津醫(yī)科大學(xué)微生物實驗室。

1.2 試驗儀器

Agilent 6890/5973 氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent 7697A頂空自動進樣器、SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺購自蘇州凈化設(shè)備有限公司，BL-50A壓力滅菌鍋購自上海博訊實業(yè)有限公司，AR2130 電子天平購自梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 化學(xué)成分富集

由于TTH 中的化學(xué)成分極性相對較小，所以本研究采用D101大孔吸附樹脂和AB-8大孔吸附樹脂對TTH中的化學(xué)成分進行富集。

對D101 大孔吸附樹脂和AB-8 大孔吸附樹脂進行樹脂預(yù)處理。將5 kg 的D101 大孔吸附樹脂和2 kg 的AB-8大孔吸附樹脂分別在95%乙醇中浸泡12 h；將兩種樹脂分別裝入合適的玻璃柱中；采用95%乙醇洗脫樹脂，洗至流出液與水（1∶1）混合后無混濁現(xiàn)象；采用5%稀鹽酸以4 BV/h的流速分別洗脫兩種樹脂2 h，蒸餾水洗至流出液的pH值為 7；5%氫氧化鈉以4 BV/h的流速分別洗脫兩種樹脂2 h，蒸餾水洗至流出液的pH值為7。

將410 L 的TTH 以500 mL/h 的流速經(jīng)過裝有5 kg 的D101大孔吸附樹脂柱（150 cm × 18 cm）富集TTH中的化學(xué)成分，所得流出液以400 mL/h 的流速經(jīng)過裝有2 kg的AB-8大孔吸附樹脂柱（120 cm × 12 cm），對D101大孔吸附樹脂柱未富集的化學(xué)成分進行二次富集。再用50%乙醇和95%乙醇兩種洗脫劑洗脫兩根樹脂柱，得到M1-95%（35 g）、M1-50%（54 g）、M2-95%（2.5 g）和M2-50%（20 g）共4個部分，M1為經(jīng)過D101大孔吸附樹脂富集出的粗提物，M2 為經(jīng)過D101 大孔吸附樹脂富集后又經(jīng)過AB-8 大孔吸附樹脂再次富集得到的粗提物。

1.3.2 化學(xué)成分分析

采用GC-MS 對TTH 的2 個粗提物M1-95%和M2-95%進行化學(xué)成分分析。流速1.0 mL/min，進樣量1 μL，分流進樣，分流比為20∶1，進樣口溫度為250 ℃。升溫程序：初始溫度50 ℃，保持3 min，以5 ℃/min速率升至120 ℃，保持2 min，以10 ℃/min速率升至250 ℃，保持2 min。離子源溫度：230 ℃。電離電壓：70 eV。四級桿溫度：150 ℃，保持5 min[13-14]。掃描模式為全掃描，掃描范圍：50～650 m/z。采用GC-MS 分析和質(zhì)譜庫檢索（NIST 和AMDIS）及文獻對比，確定各個化學(xué)成分，運用峰面積歸一化法，求得各成分的相對含量。

1.3.3 抑菌活性測定

將革蘭氏陽性菌株（金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、化膿鏈球菌、表皮葡萄球菌、微球菌、腐生葡萄球菌）、革蘭氏陰性菌株（大腸埃希菌、副傷寒乙沙門菌、肺炎克雷伯菌）及真菌（白色念珠菌）配制成一定濃度的菌懸液（濃度為107CFU/mL），采用涂布器將其均勻涂布在供試無菌牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，制成含菌平板[15-17]。將固體樣品M1-50%和M2-50%分別用10%吐溫80-水溶液二倍稀釋配成質(zhì)量濃度為600、300、150 g/L 的樣品溶液；液體樣品M1-95%和M2-95%分別用10%吐溫80-水溶液二倍稀釋配成體積分數(shù)為100%、50%、25%的樣品溶液。直徑為6.0 mm、吸水量為20 μL的專用藥敏紙片經(jīng)高溫蒸汽消毒后，使用浸泡的方法將紙片浸泡在樣品溶液中，充分吸收2 h，取出冷凍干燥，貼于具有供試菌懸液的瓊脂培養(yǎng)基上，細菌在37 ℃培養(yǎng)箱中無光培養(yǎng)24 h，真菌在37 ℃培養(yǎng)箱中無光培養(yǎng)48 h。每個樣品重復(fù)3 次，選用游標(biāo)卡尺作為測量每個抑菌圈兩個垂直方向直徑的工具，以肉眼看不到細菌明顯生長作為判斷抑菌圈邊緣的依據(jù)，評價4 個粗提物的抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 TTH化學(xué)成分分析

通過GC-MS 對M1-95%粗提物進行化學(xué)成分分析，并通過標(biāo)準圖譜對比及檢索圖譜分析，鑒定出22種化學(xué)成分，并計算各成分的相對含量，鑒定出匹配度90%以上的化合物含量占93.80%，其中化合物多為烯、醇類。TTH粗提物M1-95%化學(xué)成分與含量見表1。

表1 TTH粗提物M1-95%化學(xué)成分與含量

由表1可知，M1-95%粗提物中較大峰的化學(xué)成分和保留時間分別為：α-蒎烯（6.555 min）、3-蒈烯（9.526 min）、1,8-桉葉素（10.285 min）、γ-松油烯（13.987 min）、α-松油烯（14.483 min）、松油-1-醇（22.145 min）、α-杜松醇（22.412 min）、α-古蕓烯（23.186 min）、γ-杜松烯（23.862 min）、hedycaryol（36.480 min），10種化合物總含量占93.48%。

通過GC-MS 對M2-95%粗提物進行化學(xué)成分分析，并通過標(biāo)準圖譜對比及檢索圖譜分析，鑒定出10種化學(xué)成分，并計算出各成分的相對含量，鑒定出匹配度90%以上的化合物含量占96.63%，其中化合物多為烯、醇類。TTH粗提物M2-95%化學(xué)成分與含量見表2。

表2 TTH粗提物M2-95%化學(xué)成分與含量

由表2可知，M2-95%粗提物中較大峰的化學(xué)成分和保留時間分別為：α-蒎烯（6.726 min）、1,8-桉葉素（11.394 min）、γ-松油烯（14.529 min）、α-松油烯（15.030 min）、松油-1-醇（22.292 min）、α-杜松醇（23.037 min），6種化合物總含量占89.24%。

2.2 抑菌活性分析

M1-50%和M2-50%抑菌圈直徑見表3。由表3 可知，M1-50%對藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和肺炎克雷伯菌具有中等強度抑制活性。M2-50%對以上菌株抑制活性較弱。

表3 M1-50%和M2-50%抑菌圈直徑 單位：mm

M1-95%和M2-95%抑菌圈直徑見表4。由表4 可知，M1-95%對藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌具有較強抑制活性。其中，M1-95%對藤黃微球菌的抑菌圈直徑分別為34.6、29.6、22.7 mm；M1-95%對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別為26.8、22.6、20.6 mm；M1-95%對白色念珠菌的抑菌圈直徑分別為33.2、32.6、33.3 mm。M1-95%對大腸埃希菌、副傷寒乙沙門菌、肺炎克雷伯菌、革蘭氏陽性菌株金黃葡萄球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌和化膿鏈球菌具有中等強度抑制活性。M2-95%對上述菌株沒有抑制活性。

表4 M1-95%和M2-95%抑菌圈直徑 單位：mm

3 討論

3.1 TTH中的化學(xué)成分分析

本研究采用大孔吸附樹脂對TTH 中的化學(xué)成分進行富集，選用D101和AB-8兩種大孔吸附樹脂，經(jīng)過D101大孔吸附樹脂富集的M1-95%粗提物，主要化學(xué)成分為松油-1-醇、γ-松油烯、1,8-桉葉素和α-松油烯，經(jīng)過D101 大孔吸附樹脂富集后又再次經(jīng)過AB-8 大孔吸附樹脂富集的M2-95%粗提物，主要化學(xué)成分為松油-1-醇、γ-松油烯、1,8-桉葉素和α-松油烯。M1-95%粗提物和M2-95%粗提物主要化學(xué)成分相同，M1-95%粗提物重量為35 g，M2-95%粗提物重量為2.5 g，重量相差較大。由此可見，D101大孔吸附樹脂對TTH中的化學(xué)成分具有較強的富集能力，而AB-8大孔吸附樹脂并未富集出其他化學(xué)成分，表明生產(chǎn)車間無須將流出液再次經(jīng)過AB-8大孔吸附樹脂富集。

3.2 TTH中的化學(xué)成分抑菌活性分析

Koh等[8]、Garozzo等[9]、Grando等[10]研究發(fā)現(xiàn)，TTH具有抑菌、抗病毒和免疫等藥理活性。本研究針對TTH的粗提物進行抑菌活性研究表明，結(jié)果顯示，M1-95%對革蘭氏陽性菌株藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌和真菌白色念珠菌具有較強抑制活性，而M2-95%對研究菌株沒有抑制活性。原因可能是M2-95%粗提物中沒有M1-95%粗提物中含有的抑菌活性成分。

M1-50%對革蘭氏陽性菌株藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、真菌白色念珠菌和革蘭氏陰性菌株肺炎克雷伯菌具有中等強度抑制活性，M2-50%對研究菌株抑制活性較弱，原因可能是M2-50%粗提物中無M1-50%粗提物中含有的抑菌活性成分。結(jié)果再次證實TTH經(jīng)過D101大孔吸附樹脂富集后，無須將流出液再次經(jīng)過AB-8大孔吸附樹脂富集。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，D101大孔吸附樹脂對TTH中的化學(xué)成分具有較強的吸附能力，而AB-8大孔吸附樹脂并沒有富集出其他化學(xué)成分，表明生產(chǎn)車間無須將流出液再次經(jīng)過AB-8大孔吸附樹脂富集。M1-95%對革蘭氏陽性菌株藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌和真菌白色念珠菌具有較強抑制活性；M1-50%對革蘭氏陽性菌株藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、真菌白色念珠菌和革蘭氏陰性菌株肺炎克雷伯菌具有中等強度抑制活性。本研究不僅為TTH 的化學(xué)成分富集提供工藝方法，也為其化學(xué)成分及抑菌活性研究提供了參考。