●李 彬 彭樹德 白和平 史秋梅

（1.秦皇島撫寧區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 河北 秦皇島 066004；2.唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測中心 河北 唐山 063000；3.河北科技師范學(xué)院 河北 秦皇島 066004；4.唐河縣和杰農(nóng)業(yè)專業(yè)合作社 河南 南陽 473000）

肺炎克雷伯氏菌為革蘭氏陰性、需氧、無動力桿菌，是一種條件性致病菌，歸屬于腸桿菌科克雷伯氏菌屬[1]，廣泛存在于自然界中，也是引起醫(yī)源性感染的最主要致病菌。1822年，研究人員首次從大葉性肺炎病人痰液里分離出肺炎克雷伯氏菌[2]，之后在全世界范圍內(nèi)相繼被報(bào)道，近年來陸續(xù)報(bào)道出該菌引起不同動物源性疾病，據(jù)報(bào)道已在兔、大熊貓、貉、貂、鹿、雞、豬、犬、牛、羊[3-4]等物體內(nèi)分離出致病性肺炎克雷伯氏菌，主要癥狀為出血性肺炎、菌血癥、腸炎、腦膜炎、泌尿道炎癥，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡。研究表明該菌對環(huán)境適應(yīng)性和不利條件抵抗力強(qiáng)，還具有多重抗生素抗性和耐藥機(jī)制，不僅危害養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展還造成了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。2021年11月河北秦皇島某荷斯坦奶牛養(yǎng)殖養(yǎng)殖場出現(xiàn)母?；撔匀榉垦准盃倥：粑腊Y狀，為查明此次牛只發(fā)病原因，本研究采集化膿性乳汁與犢牛鼻腔分泌物，進(jìn)行病原菌的分離鑒定、革蘭氏染色、生化鑒定，并通過致病性試驗(yàn)明確牛只發(fā)病原因，為該病的預(yù)防和治療提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及試驗(yàn)動物

樣品為河北秦皇島荷斯坦奶牛養(yǎng)殖養(yǎng)送檢的化膿性乳汁與患呼吸道疾病牛的鼻拭子；試驗(yàn)動物為北京維利通化動物實(shí)驗(yàn)中心的6～8周齡BALB/c普通級健康小鼠。

1.2 主要試劑及儀器

LB培養(yǎng)基、綿羊血瓊脂培養(yǎng)基，均購自北京陸橋；PCR試劑均購自天根公司；ID32E生化鑒定試紙條、ABI微生物全自動生化鑒定儀，購自法國梅里埃生物公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒，購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；革蘭氏染色試劑、麥康凱肌醇阿冬醇氨芐青霉素鈉瓊脂，購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

肺炎克雷伯氏菌引物序列：5'-ATGAAACGACCTGATTGCAT-TCGC-3'和5'-TTACTTTT TCCGCGGCTTACCGTC-3'，由上海生工生物科技有限公司合成[5]。

1.4 細(xì)菌的分離純化及革蘭氏染色

無菌操作取化膿性乳汁100 μL并加入900 μL滅菌PBS均勻稀釋備用；將鼻拭子放入裝有3 mL滅菌PBS的EP管中，充分旋轉(zhuǎn)擠壓后棄掉棉拭子，分別取一管稀釋后的奶液和菌懸液劃線于LB瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后挑取優(yōu)勢菌純化至形態(tài)單一，再將純化后單菌落劃線于麥康凱肌醇阿冬醇氨芐青霉素鈉培養(yǎng)基，觀察分離菌的生長特性。最后取純化后的細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色，染色完成后在油鏡下觀察染色結(jié)果，并拍照記錄。

1.5 細(xì)菌的生化鑒定

使用ID32E腸桿菌科生化鑒定試紙條鑒定分離菌的生化特性，挑取適量純化的細(xì)菌培養(yǎng)物，使用0.9%的生理鹽水調(diào)整菌液濃度為0.5麥?zhǔn)媳葷岫龋s1×108CFU/mL），然后在每個(gè)檢測孔滴加70 μL菌懸液，0～6孔滴加1滴滅菌甘油（創(chuàng)造厭氧條件）引起吲哚實(shí)驗(yàn)，放置在濕盒內(nèi)，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后使用ABI微生物全自動生化鑒定儀讀取結(jié)果。

1.6 PCR鑒定及序列分析

按照細(xì)菌DNA提取試劑盒提取分離菌DNA作為PCR模板，以16S rRNA通用引物擴(kuò)增分離菌16S rRNA基因，反應(yīng)體系為20 μL，其中2×TaqPCRMasterMix10 μL，上游引物、下游引物、細(xì)菌基因組DNA各1 μL，超純水補(bǔ)足充至20 μL，PCR結(jié)束后取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶符合預(yù)期即判斷為陽性，并將陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化、測序，其測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站做BLAST比對，并建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析種屬關(guān)系。

1.7 致病性試驗(yàn)

取10只普通級健康BALB/c小鼠，分為攻毒組和對照組，每組各5只，攻毒組處理為向5只小鼠腹腔內(nèi)注射菌液濃度為1.0×108CFU/mL的細(xì)菌懸液0.2 mL，對照組處理為向5只小鼠腹腔內(nèi)注射0.2 mL滅菌PBS，試驗(yàn)期間小鼠可自由采食和飲水，每天記錄小鼠的狀況，對死亡的小鼠要及時(shí)進(jìn)行剖檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床診斷結(jié)果

6周歲左右荷斯坦奶牛臨床癥狀表現(xiàn)為體溫40.5℃、拒絕哺乳、乳房紅腫、乳頭有傷口，乳汁為淡黃色絮狀并伴有血絲。30日齡犢牛具有體溫升高、精神沉郁、食欲減退、伴有輕微的咳嗽等癥狀，約2 d后呼吸道癥狀加重，并伴有流鼻涕現(xiàn)象。

2.2 分離菌形態(tài)學(xué)觀察

分離菌在LB瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，呈邊緣光滑、中間凸起、中等大小的乳白色菌落（圖1-A）；在麥康凱肌醇阿冬醇氨芐青霉素鈉培養(yǎng)基上生長良好，菌落呈粉紅色，伴有粉色沉淀環(huán)，黏稠且不易挑起，有明顯“拉絲”現(xiàn)象（圖1-B）；革蘭氏染色后，油鏡下可看到陰性短小桿菌，兩端頓圓，散在或成對存在（圖1-C）。

圖1 細(xì)菌的形態(tài)特征

2.3 生化鑒定結(jié)果

取經(jīng)24 h培養(yǎng)的生化鑒定試紙條，在IND孔滴加1滴吲哚試劑，用ABI微生物自動生化鑒定儀讀取鑒定結(jié)果，鑒定結(jié)果，如表1所示，2株菌的生化特性一致且均與肺炎克雷伯氏菌生化特性相符，初步鑒定為肺炎克雷伯氏菌。

表1 生化鑒定結(jié)果

2.4 PCR鑒定及序列分析

通過擴(kuò)增分離菌16S rRNA基因，得到1500 bp左右條帶（圖2），與目標(biāo)片段條帶大小相符。經(jīng)16S rRNA測序結(jié)果雙向拼接后，結(jié)果顯示2株菌序列相似性為100%，經(jīng)NCBI網(wǎng)站中BLAST比較同源性，與肺炎克雷伯氏菌同源性達(dá)99.93%。選取同源性較高的序列，利用MEGA7.0軟件采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分離菌與肺炎克雷伯氏菌自然聚為一支，與鮑曼不動桿菌、流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌不在同一分支（圖3）。以上結(jié)果綜合分析，證實(shí)分離菌為肺炎克雷伯氏菌，并命名為kp-1、kp-2。

圖2 分離菌16S rRNA鑒定結(jié)果

圖3 分離菌16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果

2.5 致病性試驗(yàn)

小鼠攻毒24 h后，臨床表現(xiàn)為行動遲緩、呼吸急促、畏寒扎堆，48 h后攻毒組全部死亡，刨檢可見肺臟出血性浸潤，取肺組織進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定，從肺臟中分離出與肺炎克雷伯氏菌生化特性、染色特征結(jié)果均為一致的分離菌株，經(jīng)PCR鑒定為陽性；而對照組肺炎克雷伯氏菌檢測結(jié)果為陰性。以上試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)本次分離的2株肺炎克雷伯菌均有較強(qiáng)致病性。

3 討論與結(jié)論

克雷伯氏菌是一種重要的人畜共患條件性致病菌，長期存在于動物腸道及上呼吸道，在機(jī)體免疫力低下或環(huán)境條件發(fā)生改變時(shí)易引起繼發(fā)性感染。本研究從乳腺炎奶牛的奶樣及呼吸道癥狀牛鼻拭子中分離鑒定到2株優(yōu)勢菌，通過實(shí)驗(yàn)室診斷方法鑒定為肺炎克雷伯氏菌，動物性試驗(yàn)結(jié)果顯示小鼠死亡，說明該分離菌有較強(qiáng)致病性，且死亡小鼠均出現(xiàn)出血性肺炎的癥狀，能夠從病變肺臟中分離到同源性肺炎克雷伯氏菌，證實(shí)肺炎克雷伯氏菌是致此次牛只發(fā)病的主要病原菌。在對2株菌16s rRNA基因序列進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)兩株菌的同源性為100%，且在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中同處一個(gè)分支，這提示2株菌可能來自同一祖先。此外2株菌均能在48 h內(nèi)致死小鼠，可能這與菌株的毒力基因相關(guān)，肺炎克雷伯氏菌的致病性主要與毒力基因的表達(dá)與調(diào)控因子相關(guān)，包括莢膜多糖、黏附素、鐵攝入能力、脂多糖。但是對于犢牛是否通過食物鏈感染該菌，需進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)研究。

綜上，本研究從乳腺炎奶牛的奶樣及呼吸道癥狀牛鼻拭子中分離到2株毒力較強(qiáng)的分離株，不僅為肺炎克雷伯氏菌的臨床診治提供一定參考，也為牛源肺炎克雷伯氏菌生物制品研發(fā)提供一定基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。