翟丹丹，閆苗苗，姜寧，李巧珍，尚曉冬，譚琦，李玉，于海龍*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學食藥用菌教育部工程研究中心，長春 130118；2.上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方食用菌資源利用重點實驗室，國家食用菌工程技術(shù)研究中心，國家食用菌加工技術(shù)研發(fā)中心，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點開放實驗室，上海 201403）

香菇（Lentinula edodes）是我國第一大食用菌品種，其產(chǎn)量占我國食用菌總產(chǎn)量的31%以上，其味道鮮美、營養(yǎng)豐富，深受消費者喜愛[1]。重金屬可以通過生物富集進入人體[2]，對人體造成一定的毒性損傷[3]。食用菌具有重金屬富集特性最早是由Stijve等[4]報道，后續(xù)又有大量的研究報道證實很多大型真菌都具有重金屬富集特性[5-6]，且其富集程度大于植物[7]。研究發(fā)現(xiàn)，不同種類間、同一種類不同品種間、同種內(nèi)不同菌株間、同一個體不同部位間的重金屬富集程度和含量都有差異[8-9]。前期研究表明，香菇子實體中鎘含量存在超標現(xiàn)象，栽培區(qū)域、基質(zhì)、品種、栽培方式等生產(chǎn)因素都會對香菇中鎘含量產(chǎn)生影響[10]，不同潮次、不同部位、不同生長發(fā)育階段的香菇子實體中的鎘含量也會有顯著差異[11-12]。在對靈芝[13]、猴頭菇[14-15]、香菇[16-17]的研究中證實，食用菌生長發(fā)育過程中的活性物質(zhì)累積是一個動態(tài)過程，當生物體受到脅迫時，其滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如可溶性蛋白等的含量會發(fā)生顯著變化，以維持細胞正常代謝[18]，而丙二醛（MDA）是衡量非生物脅迫后細胞氧化損傷程度的重要指標[19]，探究鎘脅迫對香菇菌株不同生長發(fā)育階段鎘含量及活性物質(zhì)積累的影響，可以進一步了解香菇子實體內(nèi)鎘積累的生理機制。前期本課題組以菌絲生長速率和鎘含量為指標對99份香菇種質(zhì)資源進行鎘耐受性評價，獲得了不同鎘耐受性的香菇菌株和外源鎘脅迫下的表型差異[20]。本研究以4606（鎘積累較低）和4625（鎘積累較高）兩個不同鎘耐受性香菇菌株為供試菌株[21]，通過外源添加鎘脅迫，探究兩個菌株不同發(fā)育階段子實體中鎘含量、MDA含量、可溶性蛋白含量的變化規(guī)律，明確不同鎘耐受性香菇菌株在不同發(fā)育階段對鎘脅迫的生理響應差異，以期為闡明不同鎘耐受性香菇菌株鎘脅迫應答提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

香菇菌株4606（國品認菌2007004）和4625（國品認菌2008007），由國家食用菌工程技術(shù)研究中心提供。

PDA 培養(yǎng)基（購自美國BD 公司）：將PDA 培養(yǎng)基按照說明書中的方法進行配制，將配制好的培養(yǎng)基于121 ℃高壓滅菌30 min。

原種及栽培種培養(yǎng)料配方：櫟木屑79%、麥麩20%、石膏1%，含水量57%~58%，pH自然。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌袋制作及培養(yǎng)

無鎘添加的對照組栽培種培養(yǎng)料按照1.1中的配方配制。鎘添加的培養(yǎng)料按照每千克培養(yǎng)料添加500μL氯化鎘母液（10 g·L-1）的比例配制。培養(yǎng)料混勻后測定接種前單位干質(zhì)量培養(yǎng)料中的實際鎘含量，其中對照組為（0.386±0.059）mg·kg-1、處理組為（6.918±0.484）mg·kg-1。稱取1 kg培養(yǎng)料裝入聚丙烯袋，并保持裝料高度一致，封口后121 ℃高壓滅菌4 h，料溫降到28 ℃以下接種，接種量為3%（體積比），接種后將菌棒放入培養(yǎng)室（23±1）℃避光培養(yǎng)，菌棒中心溫度不超過26 ℃，空氣相對濕度60%~80%；待菌棒發(fā)滿菌后，調(diào)控溫度、濕度、光照及通氣等條件促進轉(zhuǎn)色：溫度（23±1）℃，空氣相對濕度60%~80%，光照強度50~200 lx，每天光照時長不少于12 h。

1.2.2 出菇管理

接種后150 d 進行出菇處理，將菌棒置于環(huán)境參數(shù)可控的出菇房，設(shè)置（12±1）℃進行催蕾，48 h 后菇房溫度設(shè)置為（17±1）℃進行出菇，空氣相對濕度85%~95%，光照強度100~200 lx，出菇管理過程中不疏蕾。

1.2.3 子實體農(nóng)藝性狀測定

每個處理取12個菌棒，每3個菌棒為一次生物重復，測定香菇子實體農(nóng)藝性狀。

1.2.4 MDA含量及可溶性蛋白含量測定

將香菇子實體發(fā)育分為原基期、生長期、成熟期、開傘期4 個階段，每個時期3 個重復菌棒，按照圖1 所示收集4 個時期子實體樣品，樣品經(jīng)液氮速凍并研磨后，稱取0.1 g 于2 mL 離心管，并于-80 ℃超低溫冰箱保存。使用MDA 試劑盒測定MDA 含量，使用考馬斯亮藍法測蛋白含量試劑盒測定可溶性蛋白含量，兩種試劑盒均購自蘇州科銘生物有限公司。

圖1 香菇子實體不同生長發(fā)育階段示意圖Figure 1 Schematic diagram of different growth and development stages of Lentinula edodes fruiting bodies

1.2.5 鎘含量測定

隨機選取對照及鎘添加的未接種培養(yǎng)料各5 棒，以及出菇后不同發(fā)育階段子實體樣品，置于50 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，粉碎研磨，過80 目篩，于干燥處保存?zhèn)溆?。參照GB 5009.15—2014[22]的方法測定培養(yǎng)料與香菇子實體中單位干質(zhì)量的鎘含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 對獲得的數(shù)據(jù)進行分析，使用SPSS 23.0[23]進行單因素方差分析并進行差異顯著性檢驗（Duncan，P<0.05）及相關(guān)性分析（Pearson）。

2 結(jié)果與分析

2.1 對子實體農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量的影響

鎘脅迫對不同鎘耐受性菌株的主要農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量變化有不同影響（表1）：菌株4606受到鎘脅迫后菌蓋直徑和菌蓋厚度顯著降低，其余農(nóng)藝性狀未受到顯著影響；菌株4625 受到鎘脅迫后單棒子實體個數(shù)、單棒產(chǎn)量顯著降低，單菇質(zhì)量、菌蓋質(zhì)量顯著升高，其余農(nóng)藝性狀未受到顯著影響。鎘脅迫對菌株4625 的主要農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量的影響更大。

表1 鎘脅迫對香菇子實體農(nóng)藝性狀的影響Table 1 Effects of Cd stress on agronomic characters of Lentinula edodes fruiting bodies

2.2 對子實體不同發(fā)育階段鎘含量的影響

對鎘脅迫后不同鎘耐受性香菇子實體不同發(fā)育階段中鎘含量進行方差分析，結(jié)果如圖2。外源添加鎘脅迫后菌株4606 各生長階段的鎘含量分別為原基期（68.817±4.479）mg·kg-1、生長期（69.760±6.114）mg·kg-1、成熟期（53.667±8.791）mg·kg-1、開傘期（45.170±8.205）mg·kg-1，菌株4625 分別為原基期（128.900±14.465）mg·kg-1、生長期（95.573±1.406）mg·kg-1、成熟期（79.580±1.456）mg·kg-1、開傘期（60.950±1.291）mg·kg-1。菌株4625 的4 個生長發(fā)育階段子實體中鎘含量均表現(xiàn)為：原基期>生長期>成熟期>開傘期；菌株4606的原基期與生長期無顯著差異，成熟期與開傘期的鎘含量顯著低于原基期與生長期。結(jié)果說明子實體中鎘含量隨著子實體生長發(fā)育時間的延長，有逐步降低的趨勢。對鎘脅迫后兩個菌株不同生長發(fā)育階段中的鎘含量進行分析發(fā)現(xiàn)，受到鎘脅迫后，菌株4625在不同生長發(fā)育階段的鎘含量均遠高于菌株4606，其中原基期的差異倍數(shù)最大，為菌株4606原基期的1.873倍，說明菌株4625更容易吸收培養(yǎng)料中的鎘。

圖2 鎘脅迫對香菇不同發(fā)育階段子實體鎘含量的影響Figure 2 Effects of Cd stress on Cd content in fruiting bodies of Lentinula edodes at different developmental stages

2.3 對子實體MDA含量的影響

鎘脅迫對子實體MDA 含量的影響見圖3。菌株4606對照組MDA含量隨生長時間的延長先顯著降低后顯著升高，生長期MDA 含量顯著低于其他發(fā)育階段，鎘脅迫處理后菌株4606 的MDA 含量先上升后顯著降低，生長期MDA 含量最高，為（8.967±1.149）nmol·g-1；將相同生長發(fā)育階段鎘脅迫前后子實體MDA 含量進行對比，發(fā)現(xiàn)鎘脅迫前后原基期MDA 含量無顯著差異，生長期MDA 含量在鎘脅迫后顯著升高，且高于對照組1.249 nmol·g-1，成熟期MDA 含量在鎘脅迫后顯著下降，且低于對照組0.629 nmol·g-1，開傘期MDA含量在鎘脅迫后極顯著降低，且低于對照組1.066 nmol·g-1。菌株4625對照組MDA含量隨生長時間的延長先顯著降低后顯著升高，成熟期MDA含量最低，鎘脅迫處理后菌株4625 的MDA 含量隨生長時間的延長顯著降低，成熟期MDA 含量最低；將相同生長發(fā)育階段鎘脅迫前后子實體MDA含量進行對比，發(fā)現(xiàn)鎘脅迫前后原基期、生長期、成熟期MDA 含量無顯著差異，開傘期MDA 含量在鎘脅迫后顯著降低，且低于對照組1.720 nmol·g-1。

圖3 鎘脅迫對不同階段香菇子實體MDA含量的影響Figure 3 Effects of MDA content in the fruiting bodies of Lentinula edodes at different stages under Cd stress

2.4 對子實體中可溶性蛋白含量的影響

測定不同階段香菇子實體中可溶性蛋白含量發(fā)現(xiàn)（圖4），菌株4606對照組與鎘脅迫組的可溶性蛋白含量均隨生長時間延長顯著下降，而菌株4625 對照組與鎘脅迫組不同發(fā)育階段可溶性蛋白含量均隨生長時間延長先顯著升高后顯著降低，生長期可溶性蛋白含量最高，開傘期可溶性蛋白含量最低。將相同生長發(fā)育階段鎘脅迫前后子實體中可溶性蛋白含量進行比較，發(fā)現(xiàn)鎘脅迫導致菌株4606 子實體開傘期可溶性蛋白含量顯著降低，而菌株4625 原基期、生長期、開傘期子實體可溶性蛋白含量極顯著升高。

圖4 鎘脅迫對不同階段香菇子實體可溶性蛋白含量的影響Figure 4 Effects of soluble protein content of Lentinula edodes fruiting bodies under Cd stress at different stages

3 討論

重金屬污染是被廣泛關(guān)注的世界性問題，且重金屬屬于非氧化還原金屬，其不僅會對環(huán)境造成污染，還可能通過食物鏈進入人體而威脅人體健康，嚴重時可能會造成重金屬中毒。有研究發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫下姬松茸子實體數(shù)量顯著減少[24]，平菇子實體的產(chǎn)量降低[25]，杏鮑菇子實體產(chǎn)量及生物學效率降低[26]。本試驗發(fā)現(xiàn)鎘脅迫造成菌株4625 單棒子實體個數(shù)、單棒產(chǎn)量顯著低于對照，但菌株4606 受到鎘脅迫后的菌蓋直徑、菌蓋厚度顯著降低，其余農(nóng)藝性狀未受到顯著影響。劉朋虎等[27-28]以兩個不同鎘耐受性姬松茸菌株為材料進行研究，發(fā)現(xiàn)外源鎘添加對兩菌株子實體農(nóng)藝性狀產(chǎn)生的影響各異，且該影響與外源添加的鎘濃度相關(guān)。本試驗發(fā)現(xiàn)鎘脅迫對兩個不同鎘耐受性香菇菌株的農(nóng)藝性狀也產(chǎn)生不同影響，這可能與前期課題研究證實的菌株4625和菌株4606對鎘脅迫表現(xiàn)出不同的應答模式有關(guān)[21]。生物體在不同生長發(fā)育階段對環(huán)境脅迫的適應能力不同[29]。本試驗發(fā)現(xiàn)兩個不同鎘耐受性香菇菌株子實體中鎘含量均有隨著子實體生長發(fā)育時間的延長而顯著降低的趨勢，這與吳陽[30]的研究結(jié)果一致。受到鎘脅迫后，菌株4625在不同生長發(fā)育階段的鎘含量均遠高于菌株4606，說明相比于菌株4606，菌株4625 更容易吸收培養(yǎng)料中的鎘。

MDA 含量是細胞膜脂過氧化的檢驗指標，間接表示細胞膜系統(tǒng)的受損害程度，其含量越高說明受到的傷害越重。正常情況下，生物體的MDA 含量很低，但受到脅迫后，MDA 的變化可以反映菌株的脂質(zhì)過氧化程度，間接反映菌株的抗脅迫能力。董洪新等[31]發(fā)現(xiàn)豬肚菇子實體未生長成熟前其子實體內(nèi)SOD 和CAT 具有較高的活性氧清除能力，MDA 含量水平較低。鎘脅迫菌株4606 幼菇期的MDA 含量顯著高于對照組幼菇期，這可能是因為菌株4606 子實體生長發(fā)育前期還未形成完備的抗性系統(tǒng)，鎘脅迫導致菌株4606胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷；鎘脅迫下，菌株4606成熟期、開傘期的MDA 含量以及菌株4625開傘期的MDA含量顯著低于對照組相應生長發(fā)育階段，這可能是后期胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)被誘導，在一定程度上削弱了鎘脅迫造成的細胞脂質(zhì)過氧化[32]。魏杰等[33]在研究鹽脅迫對西藏擬溞MDA 影響的過程中也發(fā)現(xiàn)高鹽脅迫下的MDA 含量均低于對照組，且隨著鹽脅迫濃度的升高，部分抗氧化酶活性增強，機體的滲透調(diào)節(jié)功能加強，從而可清除代謝過程中產(chǎn)生的自由基，進而減少機體氧化損傷。因此，我們推測本試驗部分發(fā)育階段MDA 含量顯著低于對照可能也是受到菌株內(nèi)抗氧化酶系及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響。本試驗發(fā)現(xiàn)鎘脅迫處理后菌株4606 不同發(fā)育階段的MDA 含量相比于對照組先上升后顯著降低，而鎘脅迫處理后菌株4625原基期、生長期、成熟期的MDA 含量未受到顯著影響，但鎘脅迫后開傘期MDA 含量相比于對照組顯著降低，且鎘脅迫處理后菌株4625 開傘期MDA 含量（1.720 nmol·g-1）的下降程度高于菌株4606（1.066 nmol·g-1），整體上，相比于菌株4606，鎘脅迫處理對菌株4625氧化損傷的程度更低。結(jié)合菌株4625受到鎘脅迫的產(chǎn)量性狀來看，雖然鎘脅迫下菌株4625 開傘期MDA 含量顯著低于對照組，但菌株4625 的農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量受鎘脅迫影響較大，這可能是由于生物體受到脅迫時會主動調(diào)整生長發(fā)育與脅迫適應之間的關(guān)系來應對脅迫[34]。Carpenter 等[35]的研究發(fā)現(xiàn)部分生物在遇到某些逆境時會選擇延遲或減少生殖生長，推測這可能是生物體內(nèi)泛素化蛋白酶體失活，無法清除體內(nèi)的錯誤折疊或變性蛋白而導致生育受阻造成的[36]。

可溶性蛋白是重要的營養(yǎng)物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)性物質(zhì)，可對外界刺激迅速反應，是有機體合成代謝及分解的指示劑[37]。本試驗發(fā)現(xiàn)菌株4606 的可溶性蛋白含量均隨生長時間延長顯著下降，這與王東明等[38]的研究結(jié)果一致。宋鵬等[39]發(fā)現(xiàn)鎘脅迫條件下雙孢蘑菇抗氧化酶和可溶性蛋白含量受鎘脅迫時間的影響，菌株4606 的代謝水平隨生長發(fā)育時間的延長逐漸降低，菌株4625 的可溶性蛋白含量隨生長時間延長先顯著升高后顯著降低，可溶性蛋白作為研究酶活的重要指標，間接反映出菌株4625 的總體代謝水平隨生長時間延長先顯著升高后顯著降低，這也與MDA 含量變化趨勢相互印證。菌株4625 在不同生長發(fā)育階段的鎘含量均遠高于菌株4606，這可能是菌體中特定成分可溶性蛋白和協(xié)同抗氧化酶系的共同作用，增強了菌株對外源鎘的耐受性[40]。

4 結(jié)論

（1）兩個不同鎘耐受性香菇菌株受到鎘脅迫后，其子實體農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量都受到影響，但不同菌株受鎘脅迫影響的農(nóng)藝性狀和受影響程度不同。

（2）兩個不同鎘耐受性香菇菌株不同生長發(fā)育階段單位干質(zhì)量子實體中鎘含量均有隨生長發(fā)育時間的延長顯著降低的趨勢。

（3）受到鎘脅迫后菌株4606 生長期丙二醛含量顯著升高，成熟期顯著下降，開傘期極顯著降低；菌株4625 受到鎘脅迫后開傘期丙二醛含量顯著降低，其余階段未受到顯著影響。

（4）菌株4606 不同處理的可溶性蛋白含量均隨生長時間延長顯著降低，菌株4625 不同處理的可溶性蛋白含量均隨生長時間延長先顯著升高后顯著降低。