姚媛，廖瓊峰，陳國平，孫旭，蘇芬麗 （. 廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 50405；. 廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東 廣州 50006）

穿心蓮內酯是中藥穿心蓮的主要有效成分之一，具有抗炎、抗菌作用[1]，對諸多炎癥性疾病和感染性疾病有良好療效，已被開發(fā)成為多種制劑應用于臨床，如喜炎平注射液可用于治療新冠病毒感染重癥患者[2]。穿心蓮內酯口服制劑因其療效確切，安全性高，使用方便，被臨床廣泛用于治療上呼吸道感染、細菌性痢疾等。然而以往的研究[3]發(fā)現，在正常動物體內，穿心蓮內酯口服生物利用度低。這一特點無法解釋穿心蓮內酯在臨床上高效的抗炎作用。在疾病條件下，藥物在體內的藥效學和藥動學行為可能發(fā)生改變?；谒幬锉旧硎亲饔糜诩膊顟B(tài)下的機體，本研究通過大鼠炎癥模型，研究穿心蓮內酯血藥濃度與對炎癥因子的作用關系，旨在建立穿心蓮內酯在體內炎癥狀態(tài)下的藥代動力學-藥效動力學（PK-PD）結合模型，客觀闡明穿心蓮內酯發(fā)揮抗炎作用的量效關系和作用時間窗，以期為其臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器 BS224S 萬分之一電子天平，德國Sartorius公司； HH-6 數顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司；3K30 離心機，德國Sigma 公司；5424 型小型高速離心機，德國Eppendorf 公司； Varsoskan Flash 多功能酶標儀，美國Thermo 公司；Thermo Scientific Ultimate 3000 液相系統、TSQ Endura 三重四極桿質譜儀、Thermo Fisher 和Thermo Scientific Xcalibur 數據采集和處理系統，美國Thermo 公司。

1.2 藥物與試劑 穿心蓮內酯對照品，中國藥品生物制品研究院，批號：110797-201609，純度≥98%；白術內酯對照品，上海詩丹德生物技術有限公司，批號：4030，純度≥98%；穿心蓮內酯供試品，西安美禾生物技術有限公司，批號：2021040301，純度≥98%；脂多糖（LPS），美國Sigma-Aldrich 公司，批號：12181202，純度≥98%；大鼠TNF-α、IL-1β及IL-6 酶聯免疫檢測試劑盒，天津安諾瑞康生物技術 有 限 公 司， 批 號： 596210720、 310210720、385210720；甲醇、甲酸，色譜純，德國Merck 公司；實驗用水為去離子水。

1.3 動物 SPF 級SD 大鼠，180～220 g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（粵）2018-0002，實驗動物質量合格證號44007200090193。動物實驗環(huán)境：廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院SPF 級動物實驗室。動物飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度（60±10）%的環(huán)境中，飼養(yǎng)管理均按照實驗動物的要求及規(guī)則執(zhí)行。動物實驗經廣東省中醫(yī)藥工程研究院動物倫理委員會審批，審批號：048889。

1.4 大鼠炎癥模型的建立 選取雄性SD 大鼠10 只，體質量（250±20）g，適應性飼養(yǎng)7 d。按10 mg·kg-1給予大鼠腹腔一次性注射LPS 溶液，注射后正常飲食，備用[4]。大鼠腹腔注射麻醉后仰臥位躺立，對右頸部進行皮膚消毒后剪開，鈍性分離頸靜脈，將此靜脈的遠心端結扎，在血管上剪一小切口；然后沿切口處向心臟方向插入連接1 mL 注射器，觀察出血是否順暢，后拔掉注射器，將聚乙烯管的末端固定在頸部的皮膚上，縫合開口處。

1.5 藥液的制備 先稱取穿心蓮內酯0.080 g，置研缽中，先加一滴乙醇充分研磨，再用0.5%CMC-Na配制成穿心蓮內酯質量濃度約為11 mg·mL-1的混懸藥液。藥液現配現用，并超聲充分混勻。

1.6 穿心蓮內酯在炎癥模型大鼠體內的藥物代謝動力學研究 取炎癥模型大鼠，按84.70 mg·kg-1灌胃穿心蓮內酯，于給藥前及給藥后5、15、30 min，1、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h 各采血0.45 mL，置于肝素化的離心管中，以3 500 r·min-1離心15 min（離心半徑13.5 cm），分離血漿，取血漿樣品100 μL于-80 ℃下保存，用于藥效學考察。

取血漿樣品50 μL，置于1.5 mL 高速離心管中。精密加入4.0 μg·mL-1內標溶液白術內酯50 μL，甲醇100 μL，渦流混合1 min，離心10 min（15 000 r·min-1，離心半徑7.7 cm），取上清液10 μL 進樣分析。采用LC-MS/MS 測定不同時間點血漿中穿心蓮內酯的質量濃度，按非房室模型計算穿心蓮內酯主要的藥代動力學參數。

1.7 穿心蓮內酯干預后的藥效動力學考察 取“1.6”項下的血漿樣品，按酶聯免疫檢測試劑盒說明書操作，測定不同時間點血漿中IL-6、IL-β 和TNF-α 的含量，結合“1.6”項下樣品的血藥濃度數據，分別繪制穿心蓮內酯的質量濃度-時間和效應濃度-時間曲線。

1.8 穿心蓮內酯在效應室質量濃度的擬合 將“1.7”項下穿心蓮內酯的質量濃度-時間及效應濃度-時間數據導入到Phoenic 8.1 軟件，通過半房室模型工具對上述數據進行擬合，獲得穿心蓮內酯在效應室的質量濃度-時間數據，進而繪制穿心蓮內酯效應室的質量濃度-效應曲線（以IL-6、IL-β 和TNF-α 為藥效指標）。

1.9 穿心蓮內酯PK-PD 結合模型的建立 固定“1.6”項下穿心蓮內酯的相關藥代動力學參數，采用Phoenic 8.1 軟件中的Phoenic model 項下的“PK”模型進行擬合，獲得PK 參數；采用Phoenic model 項下的“PD”模型，對“1.8”項下效應室濃度-效應關系（分別以IL-6、IL-β 和TNF-α 為藥效指標）進行擬合，得相關PD 參數；進而獲得穿心蓮內酯的PKPD 結合模型的參數，建立其PK-PD 結合模型。

2 結果

2.1 穿心蓮內酯在炎癥模型大鼠體內的藥代動力學研究 炎癥模型大鼠灌胃給予穿心蓮內酯后，大鼠血漿中穿心蓮內酯的血藥濃度-時間關系經一、二、三房室模型擬合后，以負2 倍對數似然函數值（-2LL）、最小化信息量（AIC）、貝葉斯信息準則（BIC）為主要擬合優(yōu)度參數的標準，發(fā)現二房室模型擬合優(yōu)度最高。通過模型計算后發(fā)現血藥濃度的實測值與預測值基本一致。穿心蓮內酯的主要藥代動力學參數：吸收速率常數（Ka）=0.045 08 min-1，表觀分布容積1（V1）=1 290 L，表觀分布容積2（V2）=3 733 L，清除率1（Cl1）=9.40 L·min-1，清除率2（Cl2）=37.82 L·min-1，分布半衰期（t1/2）=15.37 min。

2.2 穿心蓮內酯干預后的藥效動力學研究 分別以IL-6、IL-1β 和TNF-α 為藥效指標，穿心蓮內酯在炎癥模型大鼠體內的血藥濃度-時間和效應-時間之間的變化見圖1。

圖1 穿心蓮內酯在炎癥大鼠體內的血藥濃度-時間和效應-時間曲線（n=10）Figure 1 Plasma concentration-time and effect-time profiles of andrographolide in inflammatory model rats（n=10）

2.3 穿心蓮內酯在效應室濃度（Ce）的擬合 以IL-6、IL-β 及TNF-α 為藥效指標，可得穿心蓮內酯在效應室的效應-濃度變化，如圖2 所示。

圖2 穿心蓮內酯在炎癥模型大鼠體內的效應室質量濃度-效應曲線（n=10）Figure 2 Concentration in effect compartment and effect profiles of andrographolide in inflamatory model rats（n=10）

2.4 穿心蓮內酯的PK-PD 模型的建立 分別以IL-6、IL-β、TNF-α 為藥效指標時，利用Phoenic model 項下的“PK-Emax”模型進行擬合計算，得到穿心蓮內酯的PK-PD 參數。見表1。根據穿心蓮內酯的PK-PD參數，以IL-6 為藥效指標時，可得穿心蓮內酯的PK-PD 模型為：E=55.004-20.544 5×Ce/（1.680 23+Ce）。最終模型擬合的-2LL 為78.83，AIC 值為100.83，BIC 值為114.68，說明該模型擬合度較精確。

表1 穿心蓮內酯以IL-6、IL-1β 和TNF-α 為藥效指標的PK-PD 參數Table 1 PK-PD parameters of andrographolide when using IL-6，IL-1β and TNF-α as pharmacodynamic indexes

以IL-1β 為藥效指標時，可得穿心蓮內酯的PK-PD 模型為：E=133.776-42.560 3×Ce/（3.483 03+Ce）。最終模型擬合的-2LL 為132.40，AIC 值為156.40，BIC 值為171.50 ，說明該模型擬合度較精確。

以TNF-α 為藥效指標時，可得穿心蓮內酯的PK-PD 模型為：E=138.27-52.412 2×Ce/（2.571 69+Ce）。最 終 模 型 擬 合 的-2LL 為109.73，AIC 值 為133.72， BIC 值為148.82，說明該模型擬合度較精確。

式中E為效應值。由上述PK-PD 模型可以根據穿心蓮內酯的濃度推算出相應的藥效值，也可以根據藥效值推算相對應的濃度。

3 討論

以往對穿心蓮內酯的藥動學研究多在正常機體條件下進行，未考慮炎癥狀態(tài)下藥物在體內的藥動學行為可能發(fā)生變化，從而導致藥物治療效果的差異。對于臨床而言，病理狀態(tài)下獲得的藥效指標更有意義[5]。因此，在疾病狀態(tài)下進行穿心蓮內酯的PK-PD 研究，可客觀評價穿心蓮內酯在機體內的藥動學行為和產生藥理效應的動態(tài)變化，為科學預測其在感染性疾病中的作用機制提供參考[6-7]。

本研究主要是以大鼠炎癥模型為研究對象，觀察穿心蓮內酯的血藥濃度-時間曲線以及效應-時間曲線。結果發(fā)現，在大鼠給藥后，隨著穿心蓮內酯的血藥濃度的提高，炎癥因子表達緩慢下降，給藥30 min 后血藥濃度達峰，而IL-6、IL-1β 和TNF-α在給藥后90 min 才基本達到最大下調值，提示藥物在作用部位的效應變化滯后于血藥濃度變化，藥物分布至靶點的延遲、通過間接機制產生活性、受體激活時間的延長和耐受現象的產生等[8]均可能是導致滯后現象產生的原因。根據這種變化關系宜采用間接效應連接模型建立PK-PD 模型。因此以Phoenic 8.1 軟件中的半房室模型法對血藥濃度-效應濃度-時間數據進行擬合，獲得穿心蓮內酯在效應室的質量濃度-效應濃度數據，采用效應室間接連接模型擬合，進而呈現穿心蓮內酯與藥效指標之間的量效關系，最終建立穿心蓮內酯的PK-PD 結合模型。

穿心蓮內酯的PK-PD 模型結果表明，IL-6、IL-1β、TNF-α 的濃度與穿心蓮內酯的質量濃度存在一定的相關性。由此可推測穿心蓮內酯通過抑制促炎性細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 的表達發(fā)揮抗炎作用。通過對炎癥狀態(tài)下穿心蓮內酯的PK-PD 模型建立，可準確地評價穿心蓮內酯在炎癥狀態(tài)下體內的動力學過程和產生藥理效應的動態(tài)變化，為揭示中藥穿心蓮及穿心蓮內酯制劑的清熱解毒的藥效物質基礎及作用機制提供參考。